E3蛋白泛素连接酶WWP1...炎症性肠病炎性聚集中的作用_徐舒佳.pdf

解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1E3蛋白泛素连接酶 WWP1调控TLR4介导的炎症性肠病炎性聚集中的作用徐舒佳，杨剑，李燕飞深圳市前海蛇口自贸区医院消化内科，广东深圳518000论著【摘要】目的探讨E3蛋白泛素连接酶 WWP1调控TLR4介导的炎症性肠病炎性聚集中的作用及机制。方法构建髓系细胞中特异性敲除 E3 蛋白泛素连接酶 WWP1 基因的小鼠，检测 WPP1基因是否被敲除，随后进行分组，分为 WWP 敲除组（WWP1+/+）和 WWP 未敲除组（WWP1-/-），两组小鼠再分别喂养菊聚糖硫酸钠（DSS）建立炎症性肠病模型（DSS 组）和喂养生理盐水（无菌水组），每组小鼠共10只，喂养7 d，每天检测小鼠结肠炎的临床症状，结束后处死小鼠，测量结肠长度，评估小鼠结肠炎损伤情况，Elisa检测小鼠结肠黏膜组织炎性因子IL6、IL10、TNF水平，采用RTqPCR和Western blot检测TLR4表达水平。同时使用基因沉默方法敲除RAW 264.7 细胞的WWP1基因，使用LPS刺激构建结肠炎症情况下的巨噬细胞环境，检测 WWP1+组与 WWP1-组细胞中 IL6、IL10、TNF 和 TLR4、WWP1 表达水平。结果WWP1+/+组和 RAW264.7 细胞沉默组中WWP1mRNA表达均明显下调，提示成功敲除WWP1基因。DSS组WWP1-/-小鼠体质量减轻程度明显大于DSS组WWP1+/+小鼠，DSS组WWP1-/-小鼠的DAI值明显大于DSS组WWP1+/+小鼠，DSS组WWP1+/+小鼠结肠长度明显长于DSS组WWP1-/-小鼠；与WWP1-/-相比，WWP1+/+的小鼠组织病理损伤程度更轻，结肠炎的症状更轻，同时小鼠 IL6、TNF 表达水平明显更低，IL10 表达水平明显更高，炎症损伤程度更轻，RTqPCR和Western blot检测结肠组织和细胞中TLR4的表达也显示，与WWP1-/-相比，WWP1+/+的小鼠TLR4表达水平明显更低，在细胞株中，WWP1+组TLR4表达水平明显更低（P0.05）。结论E3蛋白泛素连接酶 WWP1 可以对炎症性肠病中炎性聚集起到保护作用，这种保护作用的发挥可能是通过 TLR4 通路实现的。【关键词】炎症性肠病；泛素化修饰；含 WW 结构域的E3 泛素连接酶 1（WWP1）；作用机制基金项目：深圳市南山区卫生科技计划项目（深南科 2021 NS046）DOI：10.20021/ki.16710770.2023.01.09The role of E3 protein ubiquitin ligase WWP1 in regulation of TLR4mediated inflammatory aggregation ininflammatory bowel diseaseXU Shujia，YANG Jian，LI YanFeiDepartment of Gastroenterology，Shekou Free Trade Zone Hospital of Shenzhen Qianhai，Shenzhen 518000，China【Abstract】ObjectiveTo investigate the role and mechanism of E3 protein ubiquitin ligase WWP1 in theregulation of TLR4mediated inflammatory aggregation in inflammatory bowel disease.MethodsMice with specificknockout of E3 protein ubiquitin ligase WWP1 gene in myeloid cells were constructed，and WPP1 gene was detected.Then the mice were divided into WWP knockout group（WWP1+/+）and WWP nonknockout group（WWP1-/-）.Mice in the two groups were fed inulan sodium sulfate（DSS）to establish inflammatory bowel disease model（DSSgroup）and normal saline（sterile water group）for 7 days，and the clinical symptoms of colitis were detected everyday.After the mice were sacrificed，colonic length was measured，and colitis injury was evaluated.The levels of inflammatory factors IL6，IL10 and TNFA were detected by Elisa，and the expression of TLR4 was detected by RTqPCR.At the same time，WWP1 gene of RAW 264.7 cells was knocked down by gene silencing method，and themacrophage environment under colonic inflammation was constructed by LPS stimulation.The expression levels of IL6，IL10，TNFA，TLR4 and WWP1 in WWP1+and WWP1-groups were detected.ResultsWWP1mRNA expression was significantly downregulated in both WWP1+/+group and RAW 264.7 cell silencing group，suggesting thatWWP1 gene was successfully knocked out.The weight loss degree of WWP1-/-mice in DSS group was significantly51解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1greater than WWP1+/+mice in DSS group，the DAI value of WWP1-/-mice in DSS group was significantly greaterthan WWP1+/+mice in DSS group，and the colon length of WWP1+/+mice in DSS group was significantly longer thanWWP1-/-mice in DSS group.Compared with WWP1-/-，mice with WWP1+/+have less pathological damage and lesssymptoms of colitis.Meanwhile，mice with WWP1+/+have significantly lower expression levels of IL6 and TNF，significantly higher expression levels of IL10，and less inflammatory damage.RTqPCR and Western blot detectionof TLR4 expression in colon tissues and cells also showed that compared with WWP1-/-，the expression level ofTLR4 in WWP1+/+mice was significantly lower，and in cell lines，the expression level of TLR4 in WWP1+group wassignificantly lower（P0.05）.ConclusionE3 ubiquitin ligase WWP1 may play a protective role in inflammatory aggregation in inflammatory bowel disease，which may be realized through TLR4 pathway.【Key words】Inflammatory bowel disease；Ubiquitination modification；WW domaincontaining E3 ubiquitin protein ligase 1（WWP1）；Mechanism of action炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一类慢性反复发作的肠道疾病，以胃肠道炎症及不受控的上皮损伤为特征1-2，目前炎症性肠病的病因及发病机制尚不完全明确，多项研究提示IBD 的发生与多种调控机制异常引起的肠道黏膜屏障、炎症、免疫失调有关3-5。泛素化修饰是一种蛋白质翻译后修饰方式，对蛋白质的降解，蛋白质之间相互作用，蛋白质功能等进行调节6。泛素化过程的实现与过E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和 E3 泛素连接酶等相关7，研究表明，E3 泛素连接酶可以通过多种信号调节通路参与炎症及免疫反应，并且有大量研究表明E3泛素连接酶的活化异常与 IBD 的炎症及免疫损伤发生机制相关8-10。E3 及其相应的靶蛋白控网络对炎症及免疫反应调控呈现双向调控，可诱导也可以抑制，具体作用的发挥取决于 E3 及其靶蛋白的具体类型11-12。目前关于含 WW 结构域的 E3 泛素连接酶 1（WW domaincontaining E3 ubiquitin protein ligase 1，WWP1）在IBD中的作用及作用机制尚不明确，因此，本研究探讨 E3 蛋白泛素连接酶 WWP1负性调控 TLR4 介导的炎症性肠病炎性聚集中的作用，现报道如下。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物本研究中使用小鼠为 C57BL/6雄性小鼠40只，基因缺陷小鼠为WWP1基因敲除的 C57BL/6 雄性小鼠，小鼠购于江苏艾菱菲生物科技有限公司。所有小鼠均为 68 周龄，体质量为 1825 g 的 SPF 级小鼠。所有的小鼠均在送风隔离独立笼具中进行饲养，饲养笼具保持恒温（223），湿度为 30%70%，光照时间昼夜各半，给予小鼠常规灭菌饲料及饮用水自由喂养。1.1.2实验细胞选取一株RAW264.7细胞株，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。1.2方法1.2.1DSS 小鼠急性结肠损伤模型构建所有小鼠 分 为 WWP1+/+DSS 组WWP1 敲 除 小 鼠 喂 养2.5%葡聚糖硫酸钠（DSS）构建程炎症性肠病模型、WWP1+/+无菌水组（WWP1敲除小鼠喂养生理盐水作为对照）、WWP1-/-DSS 组（正常小鼠喂养DSS构建程炎症性肠病模型）和WWP1-/-无菌水组（正常小鼠喂养生理盐水），每组 10 只小鼠，所有小鼠正常自由喂养，共喂养7 d。1.2.2各组小鼠处理饲养 7 d 期间每日对小鼠所表现出的结肠损伤症状进行监测，监测的症状包括体质量、大便性状、小鼠行为状态。饲养 7 d后处死小鼠，剖腹取小鼠结肠，所取结肠段为全结肠取自回肠末段及回盲部交点至肛门口，使用直尺测量肛门至回盲部距离作为结肠长度。取远端结肠组织，沿纵轴切开，并沿中线切成两半卷成瑞士卷状进行苏木精-伊红（HE）染色制片，采用免疫组化、RTqPCR 和 Western blot 检测 TLR4 和MMP1 的表达，ELISA 法检测 IL6、IL10 和 TNF表达水平。1.2.3细胞模型构建RAW264.7 细胞进行常规培养后，使用 WWP1siRNA 转染来抑制 WWP1 的表达，RTqPCR 检测转染了 WWP1 siRNA 的细胞中 WWP1 基因的表达，确认细胞中 WWP1 基因被成功沉默，此组细胞为 WWP1-组，未进行 WWP152解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1siRNA转染的细胞为WWP1+组。24 h后用5 mg/mL的 LPS 溶液刺激两组细胞，3 h 后收集细胞细胞株，ELISA法检测炎性因子IL6、IL10和TNF表达水平，RTqPCR检测TLR4水平。1.2.4结肠组织免疫组织化学法结肠组织的固定并且经过包埋处理后，制作成病理切片，烤箱65烘烤，使用二甲苯脱蜡 3 次，然后使用无水乙醇，90%、80%、70%梯度乙醇进行复水，抗原修复后滴加第一抗体（TLR4 浓度：1 100 和 MMP1 浓度：1 200），孵育 1 hour 后滴加 Envision 第二抗体继续孵育 30 min，DAB 显色，苏木素复染，使用二甲苯透明后晾干封片即可。1.2.5Westernblot 法 检 测 结 肠 组 织 和RAW264.7细胞中 TLR4 和 MMP1 的表达 新鲜结肠组织经研磨后，提取细胞/组织总蛋白，采用BSA 法测量总蛋白量，随后进行 SDSPAGE 电泳、转膜等操作后，将PVCA膜置于第一抗体（TLR4浓度：1 1000和MMP1浓度：1 1000）中过夜孵育，随后滴加第二抗体孵育，DAB法显影，计算蛋白相对表达量。1.2.6RTPCR 法检测结肠组织和 RAW264.7细胞中 TLR4 和 MMP1mRNA 的表达 组织或细胞加入 TRIzol 进行 RNA 提取，RNA 提取液按一定比例配制成 RNA 反应液，加入反转录酶 Oligo dT Primer 37进行反转录15 min，85 5 s反转录酶失活，4静置后配备 PCR 反应液进行 PCR 反应，95 5min 进行变性，然后按以下条件进行热循环：9545 s、56 30 s、72 30 s，循环 30 次，最后 72 延伸10 min，上机进行检测和结果读取。1.2.7小鼠结肠炎的临床症状各组小鼠体质量变化及疾病活动指数变化检测：对本实验中的所有小鼠饲养的 7 日进行体质量及疾病活动指数（Disease activity index，DAI）进行监测，并且取平均值做成曲线图观察各组小鼠的体制量及DAI变化趋势。DAI采用04分制进行等级评价，评分标准未：正常大便为0分，软便为1分，软便伴随轻微的出血为 2 分，轻微出血伴随便溏为 3 分，大出血为 4 分。各组小鼠的结肠长度：每组小鼠的结肠长度测量采用3人各3次测量取平均值的方式，最后取整组小鼠的结肠长度平均值。各组小鼠结肠炎组织病理损伤程度：各组小鼠结肠组织采用苏木精伊红（HE）染色制备成切片后使用显微镜进行检查，并且采用扫描仪获取显微图像，对每个切片的病理组织进行溃疡，炎症细胞浸润情况的评估。1.3统计学分析将数据导入并且使用 GraphPad Prime8.0 软件进行统计分析，数据用均值标准差（MeanSD）表示。所有统计检验均为双侧 t 检验，P0.05 为差异具有统计学意义。2结果2.1各组小鼠体质量、DAI指数、结肠长度的变化4 组小鼠体质量都有明显下降，WWP1+/+DSS组与WWP1-/-DSS组的下降程度比WWP1+/+无菌水组及 WWP1-/-无菌水组更为明显，WWP1-/-DSS 组比 WWP1+/+DSS 组 下 降 程 度 更 多（图 1A）。WWP1-/-DSS 组小鼠 DAI 指数都有明显升高，比WWP1+/+DSS 组升高程度更多（图 1B）。小鼠结肠长度：DSS组与无菌水组相比，小鼠结肠长度明显减 低，WWP1+/+组 的 小 鼠 的 结 肠 长 度 明 显 比WWP1-/-组小鼠长（P0.05）（图1C）。图1各组小鼠体质量（A）、DAI指数（B）、结肠长度（C）的变化*与WWP1-/-DSS组比较，P0.05100%90%80%70%WWP1+/+-无菌水WWP1-/-无菌水1234567时间（d）8WWP1+/+-DSSWWP1-/-DSS1234567时间（d）6420DAI指数10WWP1+/+-DSSWWP1-/-DSS820Colon length（cm）4567931WWP1+/+-无菌水WWP1-/-无菌水A A AA A BA A C*2.2各组小鼠结肠炎组织病理损伤程度各组小鼠结肠组织 HE 染色显示组织病理损伤情况见图 2，无菌水组小鼠结肠均未显示明显结肠组织炎症细胞浸润及溃疡，具有正常结肠组织结构，但 DSS 组小鼠都显示明显的炎症细胞浸润及组织损伤黏膜溃疡，表明本实验中 DSS 组的53解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1结肠急性损伤模型构建成功，与 WWP1-/-相比，WWP1+/+的小鼠组织病理损伤程度更轻，结肠炎的症状更轻，WWP1 基因显示对结肠炎发生的保护作用（图2）。2.3各组小鼠IL6、TNF、IL10表达水平无菌水组小鼠IL6、TNF表达水平明显低于DSS组，IL10表达水平明显高于DSS组（P0.05），表明本实验中DSS组的结肠急性损伤模型构建成功。与 WWP1-/-相比，WWP1+/+的小鼠 IL6、TNF表达水平明显更低，IL10 表达水平明显更高（P0.05），炎症损伤程度更轻，WWP1 基因显示对结肠炎的抑制作用（图3）。2.4各组细胞IL6、TNF、IL10表达水平与WWP1-组的细胞相比，WWP1+组的细胞IL6、TNF表达水平明显更低，IL10表达水平明显更高，炎症损伤程度更轻（P0.01），WWP1基因显示对结肠炎的抑制作用（图4）。2.5采用免疫组化染色检测小鼠结肠组织中TLR4和MMP1的表达WWP1 敲除小鼠中 MMP1 的表达明显下降，同时TLR4表达也明显降低（图5）。图2各组小鼠结肠组织黏膜损伤和炎症浸润情况（HE 染色，200）WWP1-/-WWP1+/+无菌水组DSS组图3各组小鼠IL6、TNF和IL10表达水平*与无菌水组比较，*P0.05；#与WWP1-/-DSS组比较，P0.0590IL10（pg/mL）80706050403020100WWP1+/+-DSSWWP1-/-DSSTNF（pg/mL）WWP1+/+-无菌水WWP1-/-无菌水120010008006004002000WWP1+/+-DSSWWP1-/-DSSIL6（pg/mL）WWP1+/+-无菌水WWP1-/-无菌水500450400250200150035030010050*#*#*#*#*WWP1+/+-DSSWWP1-/-DSSWWP1+/+-无菌水WWP1-/-无菌水5004003002001000WWP1+WWP1-IL6（pg/mL）1000950900850800750WWP1+WWP1-TNF（pg/mL）64626058565452WWP1+WWP1-IL10（pg/mL）图4各组细胞IL6、TNF和IL10表达水平*与WWP1-比较，P0.01*2.6RAW264.7 细胞和小鼠结肠组织中 TLR4 的表达在 RAW264.7 细 胞 株 中，与 WWP1-相 比，WWP1+组 TLR4 蛋白和 TLR4-mRNA 表达水平明显更低（P0.05,图6A、6B）;在小鼠结肠组织中，无菌水组 TLR4 蛋白和 TLR4-mRNA 表达水平明显高于 DSS 组，与 WWP1-/-组相比，WWP1+/+组的TLR4表达水平明显更低（P0.05）（图6C、6D）。3讨论研究表明TLR信号转导通过多种途径进行机体炎症活动与抗炎活动强度的调节1314。多种E3泛素连接酶通过调节 MyD88 信号通路间接调节TLR信号通路或直接参与TLR信号通路的调节从而发挥炎症调节作用，参与IBD的发生，如TRAF3和TRAF6等15，E3泛素连接酶对TLR信号通路的54解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1WWP1+WWP1-DSS组无菌水组无菌水组DSS组WWP1+/+组WWP1-/-组TLR4蛋白GAPDHABWWP1+/+-DSSWWP1-/-DSSWWP1+/+-无菌水WWP1-/-无菌水WWP1+WWP1-1086420TLR4mRNA水平14121086420TLR4-mRNAC*#*WWP1+组WWP1-组TLR4蛋白GAPDHD图 6RAW264.7 细胞和小鼠结肠组织中 TLR4 的表达A.Western blot 检测；B.RTPCR 检测，*与 WWP1组细胞比较，*P0.05；C.Western blot检测；D.RTPCR检测，*与无菌水组比较，*P0.05，#与WWP1组比较，#P0.05）调节可以发挥抗炎作用也可以发挥促炎作用，取决于 E3 泛素连接酶的类型及靶蛋白调控网络。E3泛素连接酶是个庞大的泛素化修饰蛋白家族，E3 泛素连接酶家族可以分为 HECT（Homologousto the E6AP carboxyl terminus）家族、RING（Reallyinteresting new gene）家族和 Ubox 家族，HECT 家族是研究最早的 E3 泛素酶家族，目前 HECT 家族的功能尚未完全明确，但是有研究显示 HECT 家族在泛素分子转运过程中发挥重要作用，对蛋白降解、膜蛋白转运、信号传导、转录和凋亡等生理活动进行调节16。含 WW 结构域的 E3 泛素连接酶 1（WW domaincontaining E3 ubiquitin protein ligase 1，WWP1）是 HECT 家族的一员，目前关于WWP1 的功能尚未阐释清晰，但已有研究提示WWP1 是 RNF11、SMAD2、RUNX2、SPG20、JUNB、P27 等因子的 E3 泛素连接酶，并且在乳腺癌等癌症细胞中存在明显的高表达1718，但是关于WWP1在 IBD 的炎症中发挥的作用及作用途径尚不明确，发挥作用是否通过 TLR 信号通路也没有充分的研究。本 研 究 目 的 是 探 讨 E3 蛋 白 泛 素 连 接 酶WWP1 负性调控 TLR4 介导的炎症性肠病炎性聚集中的作用，本研究分为动物实验及细胞实验两部分进行，研究结果表明 DSS 组与无菌水组相比小鼠的体质量有明显下降，DAI指数明显更高，结肠长度更短，结肠组织病理损伤程度更严重，IL6、TNF 表达水平明显升高，IL10 表达水平明显降低，表明本研究中 DSS 组构建结肠炎症模型成功，WWP1+/+组与 WWP1-/-组相比体质量降低程度更小，DAI 指数更低，结肠长度更长，结肠组织病理损伤程度更轻，表明WWP1+/+组小鼠的炎症性肠病程度更轻，同时WWP1+/+组小鼠IL6和TNF表图5MMP1敲除小鼠结肠组织中TLR4和MMP1中的阳性表达（免疫组化染色，200）TLR4MMP155解剖学研究2023年第45卷第1期Anat Res,2023,Vol.45,No.1达水平明显低于 WWP1-/-组，IL10 表达水平明显高于WWP1-/-组，表明WWP1组小鼠的炎症反应程度较WWP1-/-组更轻，以上结果都提示WWP1可对IBD的炎性聚集发挥保护作用，抑制IBD的炎症反应程度，同时 WWP1+/+组中 TLR4 的表达明显高于WWP1-/-组，表明这种保护作用的发挥可能通过TLR 信号通路发挥作用，细胞实验结果与动物实验结果呈现一致性，WWP1+组细胞中 TLR4、IL6、TNF的表达都明显低于WWP1-组细胞，IL10表达明显高于 WWP1-组细胞，也可进一步验证WWP1 基因可以发挥抗炎作用，抗炎作用的发挥可能通过 TLR 信号通路实现。本研究样本量较小，检测指标有限，并未充分对TLR信号通路下游各个指标进行检测，尚不能明确 WWP1 对 TLR 信号通路调节的具体机制，仍需进一步研究。综 上 所 述，E3 蛋 白 泛 素 连 接 酶 WWP1 对TLR4 介导的炎症性肠病炎性聚集起到负性调控的作用，临床中可将 WWP1 作为炎症性肠病的诊断，预后评估指标或治疗靶点。作者贡献徐舒佳负责科研设计、数据分析整理以及文章撰写、修改；杨剑负责实验手术指导及文章审阅；李燕飞负责实验实施、数据收集及协助文章审阅利益冲突所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突，课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道机构伦理问题研究方案经蛇口人民医院医学伦理委员会批准参考文献1张夏璐，李冶夫，周平.炎症性肠病肠外临床表现及对应治疗策略的研究进展 J.世界华人消化杂志2016，24（4）：894901.2Uniken 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