基于高通量测序分析健康比格犬肠道菌群结构.pdf

中国兽医杂志():基于高通量测序分析健康比格犬肠道菌群结构卢 炜 赵晓薇 马泽超 黄 欣 朱建平 陈则东(江苏农牧科技职业学院宠物科技学院 江苏 泰州)摘要:为研究健康幼龄比格犬肠道菌群结构并进一步开展犬的肠道菌群调整试验奠定基础本试验收集 只 月龄健康比格犬粪便通过 基因组测序分析肠道菌群在门、纲、目、科、属水平上的相对丰度 结果显示比格犬肠道菌群在门水平上有 个门相对丰度为厚壁菌门 、梭杆菌门 、拟杆菌门 、放线菌门 、变形菌门 和脱铁杆菌门 在纲水平上主要有 个纲相对丰度为梭杆菌纲 、梭菌纲 、拟杆菌纲 、丹毒菌纲 、杆菌纲 、棒状杆菌纲 、变形菌纲 、放线菌纲 和 变形杆菌纲 在目水平上主要有 个目相对丰度为梭菌目 、梭杆菌目 、拟杆菌目 、丹毒丝菌目 、乳杆菌目、红蝽杆菌目 、伯克氏菌目 、双歧杆菌目 和肠杆菌目 在科水平上主要有 个科其中相对丰度前 位的分别是梭杆菌科 、丹毒丝菌科 、瘤胃球菌科 、帕拉普氏菌科 、韦荣氏球菌科、毛螺菌科、普雷沃氏菌科、科、红蝽杆菌科 和乳杆菌科 在属水平上主要有 个属其中相对丰度前 位的分别是梭杆菌属 、别样棒菌属 、普氏菌属 、考拉杆菌属 、乳杆菌属 、柯林斯氏菌属 、粪杆菌属 、醋酸杆菌属 、巨单胞菌属 和劳特氏菌属 结果表明 月龄健康比格犬已建立较为复杂的肠道菌群结构能够用于肠道菌群调整相关试验关键词:比格犬 高通量测序 肠道菌群 相对丰度中图分类号:文献标志码:文章编号:()():.收稿日期:基金项目:中国特色高水平高职学校和专业建设项目(教职成函 号)国家职业教育教师教学创新团队建设项目(教职成函 号)江苏农牧科技职业学院校级科研项目()作者简介:卢炜()男副教授硕士主要从事动物营养与免疫研究:通信作者:陈则东:期卢 炜等:基于高通量测序分析健康比格犬肠道菌群结构.:动物体肠道共生着结构复杂、数量庞大的微生物群通过长期与宿主协同进化已成为维持动物健康不可忽视的“重要器官”正常情况下肠道菌群与动物机体和外界环境保持着相对平衡状态以维持机体健康一旦这种平衡被打破肠道菌群失调便会引发疾病 研究表明肠道菌群以直接或间接方式参与动物机体的免疫调节、消化吸收、能量代谢、疾病预防 比格犬()具有多种优良特点是国际公认的理想实验动物广泛用于遗传学、微生物学、生物学、药物非临床等试验研究占全国实验犬用量的 比格犬肠道菌群结构的差异势必会影响某些试验数据的均一性、重复性和可比性 然而对于比格犬的肠道菌群结构尤其是低月龄比格犬肠道菌群结构的报道较少因此本试验通过高通量测序分析 月龄健康比格犬的肠道菌群结构为全面了解幼龄比格犬的肠道菌群状况并进一步开展犬的肠道菌群结构调整相关试验提供数据支撑 材料与方法 主要试剂 粪便肠道微生物 提取试剂盒购自杭州沃森生物技术有限公司 建库试剂盒购自基因生物技术国际贸易(上海)有限公司 主要仪器 超低温冰箱赛默飞世尔科技(中国)有限公司 系列 型数显恒温水浴锅青岛聚创环保集团有限公司艾本德 离心机艾本德(上海)国际贸易有限公司 分光光度计赛默飞世尔科技(中国)有限公司 实验动物 只比格犬 月龄购自扬州四方实验动物科技有限公司生产许可证号:(苏)单笼饲养于江苏农牧科技职业学院实验动物房早晚各饲喂犬粮 次自由饮水适应性饲喂 周后用于后续试验 试验方法 粪便采集 无菌采集精神状态良好、被毛光亮、体重正常、食欲旺盛的比格犬成型粪便迅速转移至 超低温冰箱冻存 肠道菌群 高通量测序 无菌称取粪便样品 按 粪便肠道微生物 提取试剂盒说明书提取总 经琼脂糖凝胶电泳确定 样品完整性后用 分光光度计检测调整 浓度至 /以提取的 为模板用通用引物()和 ()进行 扩增细菌 的 区域 反应体系():缓冲液 (/)引 物(/)聚合酶 模板 扩增程序:预变性 变性 退火 延伸 个循环 变性 退火 延伸 个循环 扩展延伸 依次经电泳、切胶回收、洗脱完成 产物纯化使用 建库试剂盒进行文库构建构建好的文库经过 定量和文库检测合格后根据插入片段大小选择 平台进行测序得到原始数据 生物信息学分析 对原始的测序数据进行过滤使用软件()利用重叠关系将双末端测序得到的成对 组装成一条序列得到高变区的 利用软件()将相似度在 以上的 聚类为一个操作分类单元()得到 代表序列后通过()软件将 代表序列与 数据库比对、物种注释置信度阈值设置为 结果 门水平相对丰度 由图 可知在门水平上比格犬肠道菌群包括放线菌门()、拟杆菌门()、脱铁杆菌门()、厚壁菌门()、梭杆菌门()和变形菌门()个门 其中以厚壁菌门相对丰度最高占 其次是梭杆菌门和拟杆菌门分别占 和 再次是放线菌门和变形菌门分别占 和 最后是脱铁杆菌门占 研 究 论 文 卷图 肠道菌群群落组成和相对丰度.:门水平的群落组成和相对丰度:纲水平的群落组成和相对丰度:目水平的群落组成和相对丰度:纲水平相对丰度 由图 可知在纲水平上比格犬肠道菌群主要包括放线菌纲()、杆菌纲()、拟杆菌纲()、变形菌纲()、梭菌纲()、棒状杆 菌 纲()、丹 毒 菌 纲()、梭杆菌纲()、变形杆菌纲()个纲 梭杆菌纲、梭菌纲、拟杆 菌 纲 和 丹 毒 菌 纲 相 对 丰 度 较 高 分 别 占、和 其次是杆菌纲、棒状杆菌纲、变形菌纲、放线菌纲和 变形杆菌纲分别占比 、和 其中杆菌纲和梭菌纲属于厚壁菌门拟杆菌纲属于拟杆菌门梭杆菌纲属于梭杆菌门放线菌纲和棒状杆菌纲属于放线菌门变形菌纲和变形菌纲属于变形菌门 目水平相对丰度 由图 可知在目水平上比格犬肠道菌群包括拟杆菌目()、双歧杆菌目()、伯克氏菌目()、梭菌目()、红蝽杆菌目()、肠杆菌目()、丹毒丝菌目()、梭杆菌目()、乳杆菌目()个目 梭菌目、梭杆菌目、拟杆菌目和丹毒丝菌目相对丰度较高 分别占、和 乳杆菌目、红蝽杆菌目、伯克氏菌目、双歧杆菌目和肠杆菌目相对丰度较低 分别占 、和 其中梭菌目、丹毒丝菌目和乳杆菌目属于厚壁菌门拟杆菌目属于拟杆菌门梭杆菌目属于梭杆菌门伯克氏菌目和肠杆菌目属于变形菌门双歧杆菌目和红蝽杆菌目属于放线菌门 科水平相对丰度 由表 可知在科水平上比格犬肠道菌群包括 个科分别是产碱菌科()、拟杆菌科()、双歧杆菌科()、梭菌科()、红蝽杆菌科()、肠杆菌科()、肠球菌科()、丹毒丝菌科()、梭杆菌科()、毛螺菌科()、乳杆菌科()、艰难杆菌科()、帕拉普氏菌科()、消 化 链 球 菌 科()、普雷沃氏菌科()、瘤胃球菌科()、科()、链球菌科()、韦荣氏球菌科()相对丰度前 位的分别是梭杆菌科()、丹毒丝菌科()、瘤胃球菌科()、帕拉普氏菌科()、韦荣氏球菌科()、毛 螺 菌 科()、普 雷 沃 氏 菌 科()、科()、红 蝽 杆 菌 科()、乳杆菌科()其中丹毒丝菌科、瘤胃球菌科、韦荣氏球菌科、乳杆菌科和毛螺旋菌科属于厚壁菌门帕拉普氏菌科、普雷沃氏菌科和 科属于拟杆菌门梭杆菌科属于梭杆菌门产碱杆菌科属于变形菌门红蝽杆菌科属于放线门 期卢 炜等:基于高通量测序分析健康比格犬肠道菌群结构表 肠道菌群科水平上的群落组成和相对丰度 ()科相对丰度 科相对丰度 产碱菌科 乳杆菌科 拟杆菌科 艰难杆菌科 双歧杆菌科 帕拉普氏菌科 梭菌科 消化链球菌科 红蝽杆菌科 普雷沃氏菌科 肠杆菌科 瘤胃球菌科 肠球菌科 科 丹毒丝菌科 链球菌科 梭杆菌科 韦荣氏球菌科 毛螺菌科 属水平相对丰度 由表 可知在属水平上比格犬肠道菌群主要包括 个属、未分类和其他属分别是安德克氏菌属()、别样棒菌属()、厌氧弧菌属()、拟杆菌属()、双歧杆菌属()、劳特氏菌属()、布雷德菌属()、丁酸球菌属()、链型杆菌属()、醋酸杆菌属()、芽胞梭菌属()、柯林斯氏菌属()、戴阿利斯特杆菌属()、肠球菌属()、埃希氏杆菌属()、真杆菌属()、粪杆菌属()、梭杆菌属()、吉米菌属()、乳杆菌属()、巨单胞菌属()、消 化 链 球 菌 属()、考拉杆菌属()、普氏菌属()、瘤胃球菌属()、斯莱克氏菌属()、链球菌属()、萨特氏菌属()、韦荣球菌属()相 对 丰 度 前 位 的 分 别 是 梭 杆 菌 属()、别 样 棒 菌 属()、普 氏 菌 属()、考 拉 杆 菌 属()、乳 杆 菌 属()、柯 林 斯 氏 菌 属()、粪 杆 菌 属()、醋 酸 杆 菌 属()、巨 单 胞 菌 属()、劳特氏菌属()其中别样棒菌属、考拉杆菌属、乳杆菌属、粪杆菌属、巨单胞菌属和劳特氏菌属属于厚壁菌门普氏菌属属于拟杆菌门梭杆菌属属于梭杆菌门醋酸杆菌属属于变形菌门柯林斯氏菌属属于放线菌门表 肠道菌群属水平上的群落组成和相对丰度 ()属相对丰度 属相对丰度 安德克氏菌属 真杆菌属 别样棒菌属 粪杆菌属 厌氧弧菌属 梭杆菌属 研 究 论 文 卷续表属相对丰度 属相对丰度 拟杆菌属 吉米菌属 双歧杆菌属 乳杆菌属 劳特氏菌属 巨单胞菌属 布雷德菌属 菌属 丁酸球菌属 消化链球菌属 链型杆菌属 考拉杆菌属 醋酸杆菌属 普氏菌属 芽胞梭菌属 瘤胃球菌属 柯林斯氏菌属 斯莱克氏菌属 戴阿利斯特杆菌属 链球菌属 肠球菌属 萨特氏菌属)埃希氏杆菌属 韦荣球菌属 讨论本试验结果显示 月龄健康比格犬肠道菌群主要以厚壁菌门()、梭杆菌门()、拟杆菌门()、放线菌门()、变形菌门()为优势菌群菌门类别与已报道的试验结果基本一致 由于肠道菌群结构是在动物机体与外界环境相互作用下处于动态平衡中不同动物受年龄、品种、饲养环境、饮食情况、健康状况等因素的影响肠道菌群结构在门水平上的相对丰度表现出较大差异 舒迎霜等使用 岁比格犬研究黄芪多糖对犬盲肠菌群的影响结果显示非处理组试验犬肠道微生物在门水平上主要由 个优势菌门组成相对丰度分别为拟杆菌门()、厚壁菌门()、梭杆菌门()、变形菌门()和放线菌门()曹护群等同样使用 岁比格犬研究犬源复合益生菌对脾气虚犬盲肠菌群的影响结果显示非处理组试验犬肠道微生物在门水平上主要由 个优势菌门组成相对丰度 分 别 为 厚 壁 菌 门()、拟 杆 菌 门()、梭 杆 菌 门()和 变 形 菌 门()家犬肠道菌群中最丰富的菌门为厚壁菌门()其次为变形菌门()、梭杆菌门()和拟杆菌门()宠物犬肠道菌群中最丰富的菌门为厚壁菌门()其次是拟杆菌门()、梭杆菌门()、放线菌门()和变形菌门()肠道微生物在营养物质消化吸收、肠道免疫中具有重要作用对动物的生长和健康至关重要 不同菌门对动物健康的作用不同 一般而言厚壁菌门和拟杆菌门是健康宿主的优势菌门在纤维物质消化过程中起主要作用 厚壁菌门产生糖苷水解酶帮助多糖发酵从而促进能量吸收拟杆菌门则是对类固醇、胆汁酸和多糖起代谢作用促进多糖吸收和蛋白质合成梭杆菌门能够更好地帮助机体消化脂肪和脂肪酸但梭杆菌门内细菌大部分也是条件致病菌一定情况下可能会导致某些疾病的发生放线菌门属于潜在益生菌能够抵抗多种耐药性病原微生物变形菌门多数为病原菌易引起疾病损害机体健康 动物建立的菌群多样性越高菌群之间的相互依赖性就越强耐受应激反应能力越强能够较好地保持菌群的相对平衡 随着宠物经济的发展益生菌等调节家庭宠物犬肠道菌群结构的功能性产品不断出现广泛 期卢 炜等:基于高通量测序分析健康比格犬肠道菌群结构用于改善犬的食欲、消化、吸收和粪便状态用于探索疾病诊断和治疗的新思路辅助肠道相关疾病治疗与鼠、猪相比犬被当作伴侣动物与人类共享食物和生存环境犬的肠道菌群结构和功能与人类相似优势菌群均集中在厚壁菌门和拟杆菌门不同在于犬中梭杆菌门的相对丰度比人类高使得犬成为研究人类肠道菌群的理想模式动物 比格犬由于性格温顺、容易调教、遗传性疾病少、实验重复性好适合药理、循环生理、眼科、毒理、外科学等的研究被国际医学、生物学界公认为较理想的实验用犬 本试验中尽管与 岁比格犬相比 月龄比格犬肠道菌群在门、纲、目、科、属分类水平上的相对丰度存在差异但试验数据表明 月龄的比格犬已建立稳定的肠道菌群结构其中乳酸杆菌属()、双 歧 杆 菌 属()、瘤 胃 球 菌 属()、链球菌属()等有益菌群以及梭杆菌属()、萨特氏菌属()、埃希氏杆菌属()等有害或条件致病性菌群均已达到较高相对丰度 这些菌群相对丰度的变化可以作为菌群紊乱引发的腹泻疾病模型、益生菌调节肠道菌群结构、营养物质消化吸收等相关研究的重点观测指标综上所述本试验提供了幼龄比格犬肠道菌群结构基础数据显示 月龄的比格犬肠道已建立稳定的肠道菌群结构该年龄段的幼犬能够用于肠道菌群结构调整的相关试验研究参考文献:蒋辉李银银李长龙等.封闭群比格犬微卫星的筛选及初步应用.实验动物科学():.陈双双司华哲穆琳琳等.高通量测序技术分析蓝狐肠道菌群多样性.动物营养学报():.舒迎霜贺濛初桂雪儿等.黄芪多糖对犬盲肠菌群的影响.甘肃农业大学学报():.曹护群贺濛初舒迎霜等.犬源复合益生菌对脾气虚犬盲肠菌群的影响.动物营养学报():.():.().:.张庚鑫杜海洋王平等.基于 测序研究葛根芩连汤对菌群失调性腹泻大鼠肠道菌群结构的影响.中国实验方剂学杂志():.段春慧王兴金李婉萍等.基于宏基因组学研究分析黑叶猴肠道微生物的多样性.中国兽医杂志():.臧晓明景彩肖宁等.基于 基因测序技术分析不同身体质量指数人群的肠道菌群结构差异.中华中医药杂志():.():.():.():.陆江朱道仙刘莉等.不同蛋白质水平饲粮对肥胖犬体况、血清生化指标、粪便短链脂肪酸浓度及肠道菌群结构的影响.动物营养学报():.陆江朱道仙刘静等.轮状病毒患犬与健康犬肠黏膜通透性及肠道菌群的差异性分析.扬州大学学报(农业与生命科学版)():.项夫杨晓雯王家伟等.胰腺炎患犬肠道菌群构成的多样性分析.中国兽医杂志():.徐海燕.益生菌对不同 年龄 犬的健 康及肠 道菌群 的影响.呼和浩特:内蒙古农业大学.