海月水母生殖细胞的观察及精子的冷冻保存研究.doc

青岛理工大学毕业设计（论文）青岛理工大学学士学位毕业论文海月水母生殖细胞的观察及精子的冷冻保存研究院 系: 环境与市政工程学院 专 业: 环 境 科 学 学生姓名: 唐雨慧 学号:200805013论文地点: 中国科学院海洋研究所 指导教师: 李 捷 职称:教授 2012年6月目录摘要I英文摘要II引言1第一章 海月水母的研究概述31.1 海月水母的形态及生活习性31.2 海月水母的分布和生境41.3 海月水母的生活史41.4全球海月水母爆发事件及其危害5第二章 研究材料与方法92.1 海月水母生殖细胞的观察92.2 海月水母精子冷冻保存可行性探究92.3 海月水母人工受精可能性探讨10第三章 实验结果与分析113.1 海月水母生殖细胞的观察113.2 海月水母精子冷冻保存可行性探究133.3 海月水母人工受精可能性探讨14第四章 总结19参考文献20致谢236海月水母（Aurelia aurita)生殖细胞的观察及精子的冷冻保存研究摘要 海月水母（Aurelia aurita），是广泛分布于世界各海区的一种大型水母，主要在暖海和温带，我国大连、烟台、威海和青岛等地沿海均有分布，成体伞径一般为100200毫米。海月水母作为刺胞动物门（Cnidaria)、钵水母纲（Scyphozoa)的代表，是生物学教学和科研的良好材料，也可作为水族馆的观赏动物。本文通过对养殖海月水母的取样并在显微镜下观察到，雌性海月水母的卵子在生殖腺中分批成熟，大小不一，成熟的卵子的大小在100m左右，近似圆形，分布较稀疏；雄性海月水母的精子存在于精子囊中，而精子囊存在于生殖腺中，排列较紧密，形状不规则，大小一般不到100m，当精子囊破裂时，精子会从精子囊流出，精子的头部呈长棒状，尾部有很长的鞭毛，总长度在5070m左右，运动活跃，并做不规则运动。将雄性海月水母的生殖腺适当破碎并与适当浓度的冷冻保护液（如二甲亚砜）以1：4或1：5的比例混合均匀后，用液氮冷冻10分钟后取出，放入370C的恒温水浴箱中解冻，待冷冻的混合液全部融化后，生殖腺中的精子仍然有活力。这说明，海月水母的精子在遇到液氮如此低的温度时，在冷冻保护剂二甲亚砜的作用下，低温会导致精子休眠，并不会导致其死亡。若采用适当的方式解冻，可以使精子复苏，重新恢复活力。由卵子与精子的混合实验结果可以证实，海月水母的受精方式是体内受精，即雄性海月水母排出的精子进入雌性海月水母的生殖腺中与成熟的卵子结合成受精卵。关键词 海月水母，生殖腺，卵子，精子，人工受精，冷冻保存The Observation of Germ Cells of Aurelia aurita and the Cryopreservation of Its SpermAbstract Aurelia aurita，also known as water jellyfish, is a large jellyfish which widely distributed in the sea areas of the world and mainly distributed in warm sea and temperate zone. They also distributed along the coast of Dalian, Yantai, Weihai , Qingdao and other places of China. The umbrella diameter of mature individuals is generally from 100 to 200 mm. Aurelia aurita is the representative of Cnidaria and Scyphozoa, can be regard as a good material for biological teaching and research, and the aquarium ornamental animals. In this paper, take samples from the cultured Aurelia aurita and observed under a microscope, it can be seen that in the gonad of the female Aurelia aurita, the eggs mature in batch with different size, and the size of the mature eggs is about 100m. The eggs are nearly circular, and distributed sparselyin. The sperm of the male Aurelia aurita present in the antheridum in the gonad. The antheridums arranged closely, the shape are irregular, and the sizes are generally less than 100m. The sperm will outflow from the antheridum when they are ruptured. The head of the sperm is elongated rod-like, and the tail with very long flagella, and the total length of it is about 5070m. They do irregular movement and are very active. Do some appropriate broken to the gonads of the male Aurelia aurita and mix with the appropriate concentration of cryoprotectant solution (such as dimethyl sulfoxide) to a ratio of 1:4 or 1:5. After freezing them in liquid nitrogen for 10 minutes, removing and putting them in 37oC thermostat water bath to thaw them. When all the frozen mixture is melted, the sperm in the gonad is still viable. This shows that, when the sperm of Aurelia aurita under such a low temperature of liquid nitrogen, they would not be killed but be in dormant with the effect of the cryoprotectant dimethyl sulfoxide. If thaw them in the proper way , the sperm would recovery and regain their vitality. By the result of the egg and sperm mixing experiment can be speculated that the way of the fertilization of Aurelia aurita is in vivo fertilization, that is the excreted sperm of the male Aurelia aurita enter the gonads of the female ones combined with the mature eggs into the fertilized eggs.Keyword Aurelia aurita , gonad, egg, sperm, cryopreservation - 7 -前 言水母作为胶质浮游动物的一大类群，包括刺胞动物门（Cnidaria）的水螅水母（Hydromedusae）、管水母（Siphonophore）、钵水母（Scyphomedusae）、立方水母（Cubomedusae）以及栉水母门（Ctenophora）的栉水母（Ctenophore）5大类。目前全球已鉴定出大约840种水螅水母，200种管水母，190种钵水母，20种立方水母，以及150种栉水母。根据已有资料（刘瑞玉主编中国海洋生物最新种类名录）。我国近海已经记录的水母420多种，约占全球已记录种类的三分之一。由于水母种类多、数量大、分布广，因此它们在浮游动物群落中占有相当重要的地位。 近年来，在全球一些近岸高生产力海湾或海区，由于越来越多的人类活动及气候变化使海洋生态环境发生了很大的变化，不同种类的水母在全球许多海域中的数量增加甚至出现了暴发的事件（Jellyfish and ctenophore bloom），使得部分能量传递从原来的鱼类到了水母类。比如：白令海东部大型水母啡海刺水母(Chrysaora melanaster)的生物量20世纪90年代比80年代增长了10倍，黑海的海月水母（Aurelia aurita）20世纪80年代末达到了大约35亿吨。同样，地中海、纳米比亚、南非西海岸、墨西哥北部湾及南大洋等海域均不同程度地呈现水母数量增多的现象，对当地造成了严重的经济和生态损失。在东亚海域，1990年以后，日本濑户内海的超富营养化（N：P比例很高），使得水母大量旺发，相应海域的渔业产量由1982年至1993年12年间下降了43%。自20世纪90年代中后期起，我国渤海辽东湾、东海北部和黄海南部海域也相继出现了大型水母暴发的现象，并有逐年加重的趋势，尤其是2003年可谓是“水母年”，因之而起的网具暴破、网眼堵塞、传统渔场无法生产等情况已严重影响了东、黄海夏秋汛的海洋渔业生产。由于水母和许多鱼类及其仔鱼存在摄食竞争，因此当水母大量增长时，水域中浮游生物的数量在短时间内急剧下降，甚至可降至为零，从而可能造成仔、稚鱼饥饿甚至死亡，使本来业已匮乏的渔业资源更得不到及时的补充。由此可见，水母数量的增长已经成为一种海洋生态灾害，其危害可与赤潮相比1。 海月水母( Aurelia aurita )是海洋中大型的浮游动物，隶属钵水母纲旗口水母目洋须水母科海月水母属2 ，在70N40S海区的浅海海域均有分布，但海流稳定的温带浅海海域是其最适和最主要的分布区域3。在我国大连、烟台、威海和青岛等地沿海均有分布4。近半个多世纪以来，在全球许多海域都发生过海月水母爆发事件，引起了各种各样的社会、经济和生态问题，2007 年6 9月初，山东烟台港及威海近海海面发生了大规模的海月水母爆发事件。海月水母和其它大型胶质状浮游动物一样，它们的爆发会对海洋生态系统造成巨大的危害，对海洋渔业经济等造成恶性影响。在过去的100年里,学者们已对海月水母进行了广泛的研究，但国内目前专门针对海月水母的研究较少。虽然目前很多研究和商业部门的科研人员通过不断观察与试验，已经掌握了海月水母繁殖过程的关键技术环节，实现了人工繁殖，为使水母长期展示与科普提供了一定的保障。但对于海月水母雌雄生殖细胞及人工受精方面的研究较少。为了解决雌雄水母个体的生殖细胞成熟不同步的问题，本文将对海月水母雌雄生殖细胞的形态、受精卵的卵裂增殖及浮浪幼虫的形态作详细描述，并对海月水母的精子做冷冻保存做初步研究。第一章 海月水母的研究概述1. 1 海月水母的形态及生活习性海月水母体为圆盘状，无色透明，直径为1040 cm，身体水的含量达98%，水母体主要由外伞、内伞、口腕和胃囊四部分组成，成熟个体的胃囊的底部还有生殖腺，从伞的顶部即可看到体内4个马蹄形褐色生殖腺。伞的边缘生有触手，并有8个缺刻，每个缺刻中有1个感觉器即触手囊，囊下面有缘瓣，缘瓣上有感觉细胞和纤毛；在内伞的中央有1个呈四角形的口，4个口角处称主辐，有4条分枝的主辐管;主辐之间为间辐，有4条分枝的间辐管；主、间辐之间为从辐，有8条不分枝的从辐管；这16条辐管均连于伞缘的环管，构成复杂的胃循环腔。口的四角上伸出4条口腕(图1.1)4，口腕上有许多刺细胞，可放出刺丝麻痹猎物，再将它吞入口中。海月水母主要以浮游动物为食，如：桡足类、软体动物、枝角类、鱼卵和鱼仔，有时它们也吃小的水螅水母类和栉水母类。水母体依靠外伞有节奏地跳动来浮游，浮游时外伞向上内伞向下，并保持其伞始终接近水表面，使触手最大限度地展开，以便更好地捕捉食物。不同种群伞径大小相差较大，Lucas认为当种群数量较大时伞径小，而种群数量小时伞径大3。 图1.1 海月水母的结构(口面观) 4Fig. 1.1 The structure of A. aurita (oral view ) 41.2 海月水母的分布和生境海月水母目前是1种全球性分布的物种，广泛分布于70N40S海区的浅海海域。这些海域的港湾、海峡和入海口等处因有适合螅状体生存的底层物质，是海月水母容易聚集的场所，海流稳定的温带浅海海域是其最适和最主要的分布区域3。有学者认为它原是仅限于北大西洋的1个物种，19世纪和20世纪频繁的海运活动把它们带到了世界各地5。比较了海月水母生存的海域环境状况后发现,这些海域的潮流、水深、温度、盐度和营养情况等差别较大(表1.1）6，说明海月水母对环境的适应能力较强。海月水母对温度和盐度的适应范围极广，如瑞典Gullmarfjord湾的海月水母种群要经历冬季的冰封期7，而帕劳的水母湖中的海月水母种群却生活在表层水温度常年维持在3132 的水体中8；海月水母既分布于S为1422的丹麦Kertinge Nor9，也存在于S高达38的希腊Elefsis湾中10，Russell还发现了生存于S小于10的海月水母种群11。从表1中还可以推测出，海月水母对生存水体的营养输入量、生产率和食物可利用率的要求也很宽泛，如英国Horsea湖没有河流输入来提供营养,浮游动物在数量和种类上都少，但海月水母的生物量仍可达43 mg C m-312；另一方面，海月水母在受污染(英国Southampton Water)13、富营养化且底层水缺氧(希腊Elefsis湾)10的水系中亦大量存在。但学者研究还发现，在水体小、水深浅、半封闭或全封闭且潮流交换受限的水体系统中，水母体种群数量较大，而在开放或较深的水域中种群数量要小很多，因为频繁的潮流交换会使海水变得混浊，初级产物较少，不利于水母体的摄食和繁殖，而稳定的水体环境对螅状体的底栖生活和水母体的浮游生活都很有利14。1.3 海月水母的生活史海月水母的生活史包括2种不同形态的生活世代(图1.2)15 ：营固着生活的无性水螅体世代和营浮游生活的有性水母体世代。水母体雌雄异体，精子由雄性个体的口排出，经雌性个体口腔进入体内和卵结合，受精卵顺水流至口腕边缘，并在此发育成浮浪幼虫；浮浪幼虫离开雌性水母，以前端附着外物，发育成早期的螅状体；螅状体以出芽生殖不断形成新的螅状体，并经过一段较长的营养时期，发育为钵口幼体，开始连续进行横分裂，形成叠在一起的许多节盘，称为横裂体；横裂体节盘脱落产生碟状体，进一步发育为幼水母体，约经80d可达性成熟16 。世界各地海月水母种群的生活史都相同，但因所处环境不同，发育时间有所不同，呈现出明显的地域差异(表1.1)。但总体而言，碟状体的出现多集中在11月到翌年3月，消失多集中在2月到5月，只有帕劳的水母湖(Jellyfish Lake)中的碟状体全年都存在；水母体出现大都始于4 、5月份，6到10月消失，但在5个海域(水母湖、黑海、台北湾、日本的Urazoko 、Tokyo 湾)全年都可见到水母体。水母体的寿命一般为48个月，但Yasu2da17和Hamner18分别于1971和1974年报道了在日本Kago shima湾和帕劳的水母湖有寿命超过1a的水母体；Miyake在1997年则称在日本Kagoshima湾中有寿命超过2a的水母体，且能2次排卵19。海月水母种群增长有3个典型阶段，在冬季和春季大部分时间，增长较慢；在温度和食物较充足的春末时进入指数增长期；在夏季和秋季水母体一旦生殖后种群数量便很快萎缩。 图1.2 海月水母生活史15Fig. 1.2 Life history of A . Aurita151.4全球海月水母爆发事件及其危害水母爆发属一种自然现象，因其生长具有季节性，即使在未受干扰的情况下表1.1 全球海月水母种群的主要栖息地环境状况及其碟状体、水母体出现时间6Table1.1 Habitat s and their environment of A. auri ta population and timing of ephyrae and medusae occurrence in the world6 地点 类型 特点 水深/m 最高丰度个m-3 碟状体出现月份 水母体出现月份Gullmarfjord ,瑞典 开放海峡 冬季结冰 120 14. 96 10 翌年4月 5 8Jellyfish Lake ,帕劳 半封闭咸水湖 含硫化物 30 0. 30 全年 全年Kertinge Nor ,丹麦 半封闭海峡 23 300 2 3 4 9Elef sis Bay ,希腊 半封闭海湾 缺氧 33 44 1 4 5 10Horsea Lake ,英国 半封闭咸水湖 无河流 67 24. 9 11 翌年6月 1 12Southampton Water ,英国 半封闭入海口 工业污染 15 8. 71 2 5 4 6Kiel fjord , Kiel Bight ,德国 开放海峡 8 0. 33 11 翌年6月 4 10Eckernfrde Bay , Kiel Bight ,德国 开放海峡 20 0. 33 无数据 无数据Kiel Bight ,德国 开放水域 无数据 0. 16 11 翌年8月 4 11Black Sea 开放水域 淡水水母入侵 200 211 3 5 全年Vagsbpollen ,挪威 半封闭海湾 12 22. 3 无数据 无数据Isefjord ,丹麦 开放海峡 冬季结冰 9 无数据 11 翌年3月 4 10Wadden Sea ,荷兰 开放水域 北海 510 0. 49 3 5 4 8Urazoko Bay ,日本 半封闭海湾 无数据 71 12 翌年5月 全年Tokyo Bay ,日本 开放海湾 无数据 1. 53 3 5 全年Tapong Bay ,中国台湾 半封闭海湾 2. 2 14. 15 12 翌年4月 全年威海海域,中国 半封闭海湾 富营养化 11 21. 42 无数据 6 9也可能发生爆发。但在过去几十年中受人类活动的影响，海洋生态系统正发生着变化。一些海域出现了前所未有的水母爆发现象，引起了各种各样的社会经济问题，在国际上引起了广泛的关注20，日本海域尤为严重。早在1891年在日本海域就发现了海月水母的存在21，1950年日本海海月水母爆发引起了渔场生产受阻22，20世纪60年代，日本多次发生海月水母阻塞沿海发电厂水循环系统并引起发电厂发电受阻事件，甚至引发了全日本的发电厂临时停止工作23。此类事件已波及全球，如韩国、印度、沙特阿拉伯、澳大利亚、菲律宾等海域24。此外，引人注目的还有发生于希腊Elefsis海湾、丹麦Kertinge Nor 、英国Horsea湖、挪威Vagsbpollen和黑海的海月水母爆发事件给当地带来的不小的经济损失。2007年69月，我国山东省烟台和威海沿海也曾发生十分罕见的海月水母大规模爆发事件25，2009年7月在青岛又发生了海月水母“围攻”青岛发电厂事件26。事实上，除海月水母外，霞水母(Cyanea nozaki)27也是我国黄渤海海域易爆发的水母种类。海月水母的爆发会破坏海洋生态系统的物种结构。海月水母是海洋生态系统中浮游动物的主要捕食者之一，也是一种高效且贪婪的捕食者，爆发时大量掠食浮游动物，会对沿海浮游动物生物量有显著的控制作用28。而浮游动物又是以浮游植物藻类为食，故浮游动物的减少降低了藻类的被取食压力，从而将会引起藻类的大量增加和浮游生物群落结构的变化，而藻类的增加,最终可能导致赤潮出现，也间接加剧了水体富营养化29。海月水母的爆发对海洋渔业也有十分严重的危害。通过对海月水母胃含物的分析发现，海月水母会以许多重要的经济鱼类的幼鱼为食30，它们不仅直接捕食幼鱼，而且间接和幼鱼争夺食物资源而影响经济鱼类的固有储存量31。实验证实，胶质状的水母对鱼卵和幼鱼有致命的威胁，导致鱼类产量下降32，还会导致渔场生产受阻22。因此，面对近半个世纪以来海月水母的频繁爆发，对海月水母的研究迫在眉睫，且具有重要的意义。虽然目前对于海月水母的生活史已经明确，但是肉眼并不能区分海月水母的性别，只能通过显微镜观察其生殖细胞来判断其雌雄，而对于海月水母生殖细胞形态的描述很少涉及；大部分的研究者都认为海月水母是体内受精，但也还是有人认为海月水母可以体外受精，即在性成熟时，雌性和雄性的海月水母分别将卵子和精子排放到海水中，形成受精卵后再发育成水母幼体；海月水母受精之后从受精卵到囊胚、原肠胚和浮浪幼虫各阶段由于体型小和时间短，不容易观察和控制，因此很难得到某阶段纯的水母体，如纯的浮浪幼虫，所以对海月水母人工受精可行性的探究具有重要的意义。本文将通过文字和照片的方式详细描述海月水母生殖细胞和浮浪幼虫的形态；将精子冷冻后再复活，观察冷冻精子的存活情况；将精子和卵子人为混合后，验证海月水母是体外受精还是体内受精。第二章 研究材料与方法2.1 海月水母生殖细胞的观察观察的海月水母样品采自中科院海洋研究所水族楼水母养殖室。尽量采集成熟的雌体或雄体。把海月水母样品放在解剖盘中，用解剖剪刀剪开水母体上的一个胃，刮下一小块生殖腺组织，用塑料吸管将刮下来的生殖腺组织吸到载玻片上，并用解剖针将其划开，放到显微镜下观察。若用4的镜头观察到细胞为圆形，直径在100200m，再转换到10的镜头，观察到细胞里面没有黑色的并不断运动的点，用牙签涂开之后，没有东西从破裂的细胞中流出，则可以判断为卵细胞，此水母为雌性；若用4的镜头观察到的细胞形态是很不规则的肾型，大小一般不到100m，再用10的镜头观察到细胞内有黑色点点，则可初步判断为精子囊，此水母为雄性；用牙签将精子囊戳破，并涂抹开，若能观察到大量黑点从破裂的精子囊内流出，并运动活跃，则为精子；盖上盖玻片并滴上松柏油，再用20的镜头观察精子的形态，并用精子专用分析软件观察载玻片上海月水母精子的活力。若以上两种情况在某一只水母体内都没有观察到，则说明这只水母还未发育成熟，或已过繁殖期。观察后，将没有生殖细胞的水母放回缸中，再将雌性和雄性水母分开养殖起来，以待后期使用。2.2 海月水母精子冷冻保存可行性探究由于精子的结构简单，且活力很强，因此海月水母精子的冷冻保存存活可行性就依赖于冷冻后精子的存活能力及运动活力。用吸管吸取适量性发育成熟的雄性海月水母的生殖腺到50ml小烧杯中，加入适量海水，先取少量生殖腺到载玻片上，用牙签挑破涂开后，放到显微镜下，镜头转换器转换到20的镜头上，并用精子活力系统观察精子的活力。将烧杯中剩余的生殖腺放到50C的生化培养箱里培养12h后，拿出烧杯，用同样的方法观察烧杯中生殖腺内精子的活力。用吸管吸取发育成熟的雄性海月水母的生殖腺，并加入适量海水，用小研钵做适当研磨后作为精液。用吸管吸取适量精液到载玻片上，观察精子的活力，作为此精液中精子的活力。液氮（-1960C)作为冷冻剂，二甲亚砜（DMSO)为冷冻保护剂。取3支2ml的塑料试管，分别以精液：冷冻保护剂（二甲亚砜）为1：1，1：4和1：5的比例向3支试管中加入精液和二甲亚砜，编号分别为、。用一根足够长度的绳子将3支试管绑在一起，缓慢地放入液氮中冷冻10分钟。10分钟后，将3支试管取出，放在370C的恒温水浴箱中解冻，使精子复活,待混合液全部融化后取出。分别取3支试管中冷冻后的精液适量到载玻片上，用显微镜观察精子的活力。若冷冻后仍有大量精子存活，且活力较好，则说明海月水母的精子冷冻保存具有可行性。2.3 海月水母人工受精可能性探讨取适量雌性海月水母的生殖腺到25ml小烧杯，加入适量海水，为使卵子分散开来，做适当破碎后，作为海月水母的卵子；取适量雄性海月水母的生殖腺到25ml小烧杯，加入适量海水，为使精子分散开来，做适当破碎后，作为海月水母的精子。再取3个50ml的小烧杯，标号为、，在号和号烧杯中分别加入5ml卵子和5ml精子，再加入20ml海水；在号烧杯中加入10ml的卵子，再加入20ml海水。将3个烧杯放在室温（2010C）条件下培养，12小时后分别从三个烧杯中取适量培养液到载玻片上，用显微镜观察，每个烧杯取三次观察。如此重复两次。第三章 实验结果与分析3.1 海月水母生殖细胞的观察在实验过程中，共从种海月水母缸中取出15只水母进行观察，发现在这15只水母中，雌性水母7只，雄性水母7只，雌雄比为1：1，还有一只卵子和精子囊都没有观察到，推测为不成熟个体。在海月水母中，胃和生殖腺连在一起，所以在取生殖腺样时，难免会带下一些胃丝，胃丝能用肉眼看到，长度在1mm左右；在显微镜下，胃丝细长形，呈丝状，一端较粗，一端较细，并在较粗的一端有弯曲，长度在400500m之间，内部除组织液外，还有一些点状物，如图3.1所示。图3.1 10显微镜下观察到的海月水母生殖腺中的胃丝在雌性海月水母中，生殖腺弯曲盘旋并紧贴在胃囊壁上，呈乳白色。用显微镜观察，在10的镜头下，大量的卵子由膜包裹，排列较分散，近似圆形，大小不一，这说明卵子是分批成熟的，大的成熟的卵子直径在100m左右，如图3.2所示。图3.2 10显微镜下观察到的海月水母的卵子在雄性海月水母中，生殖腺的生长方式和雌性的相同，也是弯曲盘旋并紧贴在胃囊壁上，呈乳白色。用显微镜观察，在10的镜头下，观察到由膜包裹着大量的精子囊，排列较紧密，形状不规则，大小一般不到100m，如图3.3a，3.3b所示。转换到20的镜头，观察到一个个的精子囊里面有大量黑色的点在不断运动。用牙签将载玻片上的生殖腺挑破并涂抹开，盖上盖玻片，并在盖玻片上滴上一滴香柏油，用20的镜头观察，在载玻片上的溶液中，存在大量的精子，并还有很多精子正从破裂的精子囊中流出。精子的头部呈长棒状，尾部有很长的鞭毛，总长度在5070m左右，运动活跃，并做不规则运动。由于鞭毛很长，所以当精子数量很多时，精子的鞭毛会缠绕在一起，而形成一簇一簇的精子团，如图3.3c，3.3d所示。图3.3 a，b为10显微镜下观察到的海月水母的精子囊；c，d为20显微镜下观察到海月水母的精子3.2 海月水母精子冷冻保存可行性探究在雄性生殖腺放入50C生化培养箱之前，生殖腺中的大部分精子活力都较强。在50C生化培养箱里面培养12h后，精子的活力与放入之前相比相差不大。在冷冻之前，用研钵研磨后的生殖腺溶液中的精子的存活率在80%左右，且活力都较强。这是因为有部分精子并没有成熟，或由于研磨的作用导致其活力较弱甚至没有活力。冷冻后，分别从三只试管中取适量混合液在显微镜下观察精子的存活率及活力，如表3.1所示。表3.1 精子冷冻前后的存活率编号 精子混合液 二甲亚砜 精子混合液：二甲亚砜 冷冻前精子存活率 冷冻时间 冷冻后精子存活率 0.20ml 0.20ml 1:1 80% 10min 2030% 0.20ml 0.80ml 1:4 80% 10min 45% 0.20ml 1.00ml 1:5 80% 10min 55% 在号试管中，冷冻后精子的存活率只有2030%，活力也较弱，效果并不理想；在号试管中，精子的存活率在45%左右，其中约有一半的精子有较强的活力，效果比较理想；在号试管中，精子存活率在55%左右，其中有一半以上的精子都有较强的活力，效果较理想。以上结果表明，将雄性海月水母的生殖腺研磨释放出精子后与适当浓度的冷冻保护液（二甲亚砜）以1：4或1：5的比例混合均匀后，用液氮冷冻10分钟后取出，放入370C的恒温水浴箱中解冻，待冷冻的混合液全部融化后，生殖腺中的精子仍然有活力。这可以说明，海月水母的精子在遇到液氮如此低的温度时，在冷冻保护剂二甲亚砜的作用下，低温会导致精子休眠，并不会导致其死亡。冷冻后采用适当的方式解冻，可以使精子复活，重新恢复活力。因此我们可以推测，当雄性海月水母的精子与适当浓度的冷冻保护液（如二甲亚砜）以某一范围内的比例混合后，用液氮冷冻，精子会在冷冻保护剂的作用下进入休眠状态。待需要时，将其取出，并在合适的温度范围内解冻，可以使精子复活，恢复活力。这说明海月水母精子的冷冻保存是具有可行性的。3.3 海月水母人工受精可能性探讨号和号烧杯中为精子和卵子的混合液，号烧杯中为卵子。将、和号烧杯中的混合液放在室温（2010C）条件下培养12h后，取样观察，如表3.2所示。表3.2 卵子与精子的混合实验中各烧杯中观察到的卵裂的受精卵、前期的浮浪幼虫及浮浪幼虫的个数实验次序 编号 烧杯内 取样观察次数 卵裂的受精卵 前期的浮浪幼虫 浮浪幼虫第一次 精子+卵子 3 0 0 0第一次 精子+卵子 3 1 0 0第一次 卵子 3