DANCR在人胚胎干细胞向内胚层分化中的调控功能.pdf

第 45卷 第1期2024 年 1月Vol.45 No.1January 2024中山大学学报（医学科学版）JOURNAL OF SUN YATSEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）DANCR在人胚胎干细胞向内胚层分化中的调控功能邓家成，彭丽妹，石颖鹏，钟小敏（中山大学中山医学院干细胞与组织工程研究中心，广东 广州 510080）摘要：【目的】探讨 DANCR 在人胚胎干细胞（hESC）向内胚层（DE）分化中的作用。【方法】建立体外诱导hESC向DE分化的体系，检测DANCR的表达水平与DE分化的相关性；利用慢病毒体系敲低hESC的DANCR表达水平，将敲低DANCR的hESC进行DE分化；用qPCR和Western blot方法检测DE分子标志物SOX17和FOXA2，以及原条分子标志物Brachyury（T），EOMES，MIXL1和GSC的表达水平；用Dual luciferase reporter assay和qPCR证明在DE分化过程中DANCR与WNT通路的相互作用。【结果】体外诱导hESC向DE分化的体系能够有效模拟体内DE分化，DANCR的表达水平随DE分化进程逐渐下降。建立敲低DANCR的hESC细胞株，DANCR表达水平相比对照组显著降低（P 0.001）。干扰DANCR表达使分化早期的原条分子标志物Brachyury（T），EOMES，MIXL1和GSC，以及分化后期的DE分子标志物 SOX17和FOXA2 的mRNA表达水平相比对照组显著降低（全部P 0.05）。并且，在DE分化过程中，敲低DANCR组的WNT通路的转录活性相比对照组显著降低（P 0.05），表现为WNT通路下游基因FZD5，FZD8，SFRP1，FRZB和ANKRD6 mRNA表达水平明显减少（P 0.05）。人为激活细胞内-CATENIN蛋白活性，能够有效回补由于敲低DANCR导致的DE分化缺陷。【结论】DANCR在DE分化过程中逐渐下调并促进DE分化发生，DANCR可能通过与WNT通路相互作用参与调控hESC向DE分化。关键词：内胚层；分化；长链非编码RNA；DANCR；WNT信号通路中图分类号：R34 文献标志码：A 文章编号：1672-3554（2024）01-0045-09DOI：10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ（med.sci）.20240004.007DANCR Regulates hESC Differentiation Towards Definitive EndodermDENG Jiacheng，PENG Limei，SHI Yingpeng，ZHONG Xiaomin（Center for Stem Cell Biology and Tissue Engineering，Zhongshan School of Medicine，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China）Correspondence to：ZHONG Xiaomin；E-mail：Abstract：【Objective】To explore the function of DANCR during the differentiation of human embryonic stem cells（hESC）toward definitive endoderm（DE）.【Methods】The in vitro DE differentiation system was established and its efficiency was verified.The correlation between the expression level of DANCR and DE differentiation process was detected.Using lentivirus system，we stably knocked down DANCR in hESC.The shDANCR hESC line was applied to DE differentiation，using qPCR and Western blot to detect the expression of DE marker genes SOX17 and FOXA2，and that of primitive streak marker genes Brachyury（T），EOMES，MIXL1 and GSC.Dual luciferase reporter assay and qPCR were used to confirm the interaction between DANCR and the WNT pathway during DE differentiation.【Results】The in vitro differentiation system mimicked DE differentiation efficiently.And the expression of DANCR was gradually downregulated during differ 基础研究 收稿日期：2023-09-06 录用日期：2023-10-18基金项目：科技部国家重点研发计划（2017YFA0105501）；广州市科技计划项目（202102080397）。作者简介：邓家成，第一作者，研究方向：干细胞与再生医学，E-mail：；钟小敏，通信作者，副教授，博士生导师，E-mail：第45卷中山大学学报（医学科学版）entiation.DANCR was efficiently knocked down in the shDANCR hESC line（P 0.001）.Compared with those in the control group，the expression levels of primitive markers Brachyury（T），EOMES，MIXL1 and GSC，as well as DE markers SOX17 and FOXA2，were significantly decreased in shDANCR groups（P 0.05）.Furthermore，the transcriptional activity of the WNT pathway in shDANCR groups was lower than that in the control group（P 0.05）.And RNA levels of downstream genes of the WNT pathway，FZD5，FZD8，SFRP1，FRZB and ANKRD6，were significantly decreased in shDANCR groups（P 0.05）.Forced activation of-CATENIN rescued DANCR knock down-induced deficiency in DE differentiation.【Conclusions】The expression of DANCR decreases during DE differentiation.DANCR may promote DE differentiation through modulating the activity of the WNT pathway.Key words：definitive endoderm；differentiation；long non-coding RNA；DANCR；the WNT pathwayJ SUN Yatsen Univ（Med Sci），2024，45（1）：45-53内胚层（definitive endoderm，DE）是胚胎发育过程中由多能性细胞分化而来的三个胚层（外胚层、中胚层和内胚层）之一，它起始形成于原肠胚阶段1。DE可以进一步发育产生人体的很多组织器官，例如肝脏、胰脏和小肠等。DE的分化潜能使其有望成为细胞替代治疗中的重要细胞来源。因此，对调控DE分化的分子机制的深入研究有助于促进其在再生医学方面的应用。已有文献报道2-3，转化生长因子（transforming growth factor-，TGF）信号通路和WNT信号通路在DE分化过程中发挥重要作用。原条（primitive streak，PS）是中胚层和内胚层的共同祖细胞，在原肠胚阶段，WNT信号通路和 TGF 信号通路共同刺激 PS 相关基因【如 B（T）（brachyury）和 EOMES（eomesodermin）】的 表达，从而促进多能干细胞分化为PS4。随后，TGF信号通路能够促进DE分子标志物【如性别决定区Y 盒转录因子 17（sex determining region on Y-box transcription factor 17，SOX17）和叉头框蛋白 A2（forkhead box A2，FOXA2）】的表达，诱导 PS 进一步分化为 DE5。在 WNT、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）信号的诱导下，DE可继续分化为前肠和中后肠，产生肝脏、胰腺和胃肠道等。基于上述研究结果，有文献报道通过同时激活WNT信号通路和TGF信号通路，能够在体外诱导人胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESC）分化为DE细胞6。利用这种体外分化体系，很多工作对DE分化的分子机制进行了广泛研究，例如-连环蛋白（-CATENIN）、SMAD2/3、八聚体结合转录因子 4（octamer-binding transcription factor 4，OCT4）和NANOG等蛋白质可以通过分子间相互作用，控制WNT信号通路和TGF信号通路活性，从而对DE分化进行调控4，7。但是，对于长链非 编 码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在hESC向DE分化过程中的作用，目前研究还相对较少。lncRNAs是一类长度超过200个核苷酸的内源性RNA分子，大多数没有蛋白质编码能力，在细胞分化、胚胎发育、肿瘤发生和免疫调节中发挥广泛的作用8-9。lncRNA 分化拮抗非蛋白编码 RNA（differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR）已被报道可参与多种生理过程，如干细胞维持、肿瘤耐药、癌细胞生长、转移和凋亡等10-16。尽管对DANCR在肿瘤生物学中的作用已有广泛的研究，但DANCR对hESC分化的调控功能却鲜有报道。在本研究中，我们发现DANCR在未分化的 hESC 中表达量非常丰富。虽然对于维持hESC的多能性不是必需的，但是DANCR参与了调节 hESC 向 DE 分化的过程。敲低 DANCR 能够降低WNT信号通路活性，进而阻碍DE分化。此外，直接激活细胞内的-CATENIN能回补敲低DANCR 导致的 DE 分化缺陷。综上所述，本研究发现DANCR和 WNT信号通路之间的相互作用可影响DE分化的效率，DANCR可能成为调控hESC向DE分化的新型分子靶点。46第1期邓家成，等.DANCR在人胚胎干细胞向内胚层分化中的调控功能1 材料与方法1.1细胞株、质粒人胚胎干细胞系H9细胞：购自ATCC公司；人胚肾上皮 293FT 细胞：Invitrogen 公司。pMDG、pRSV 和pMDLg/pRRE：Addgene 公司；慢病毒干扰对照质粒 IMIRXPress：SBI 公司；慢病毒干扰质粒shDANCR#1和shDANCR#2：由前期已发表工作构建；TOP-Flash、FOP-Flash、pRL-TK：Addgene 公司。1.2细胞培养1.2.1 293FT细胞培养 使用DMEM培养基（Gibco，美国），添加10%胎牛血清（北京元亨圣马生物科技有限公司，中国）及双抗（100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素）（Cytiva，美国），置于37，体积分数5%CO2细胞培养箱内培养。1.2.2 H9细胞培养 细胞种在预先铺好 Matrigel胶（CORNING，美国）的六孔板上，使用mTeSR 培养基（Stem cell，加拿大），含双抗（100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素）（Cytiva，美国），置于37，体积分数5%CO2细胞培养箱内培养。1.2.3 诱 导 H9 细 胞 分 化 为 DE H9 细 胞 以5104 cells/cm2 密度传代到预先铺好 Matrigel 胶的六孔板上，细胞贴壁生长24 h后换为DE诱导第1天的培养基，配方为：RPMI 1640（Gibco，美国）添加 2%B-27（Gibco，美国）、100 ng/mL ACTIVIN A（Novoprotein，中国）和 50 ng/mL WNT3a（Novoprotein，中国）。细胞继续贴壁生长24 h后换为DE诱导第 2-4天培养基，配方为：RPMI 1640（Gibco，美国）添加 2%B-27（Gibco，美国）、100 ng/mL ACTIVIN A（Novoprotein，中国）。此后每隔24 h换液，直到第4天细胞分化为DE细胞。诱导过程中，细胞均置于37，体积分数5%CO2细胞培养箱内培养。1.3建立稳定敲低DANCR的H9细胞株1.3.1 病毒包装 在 T75 细胞培养瓶转染 293FT细胞，细胞密度为 80%到 90%。慢病毒包装质粒pMDG、pRSV和pMDLg/pRRE按1：1：2比例混匀加至900 L Opti-MEM（Gibco，美国）中，混匀后室温静置5 min，加入lipo8000转染试剂（上海碧云天生物技术有限公司，中国），混匀后室温静置15 min，加入到T75中的293FT细胞，置于37、5%CO2的培养箱中培养。12 h 后换液，收集换液后 48 h 和72 h的细胞培养液上清，将上清以3 000g，4，离心10 min。去除细胞沉淀，用0.45 m滤器过滤去除上清中的细胞碎片。取滤液以50 000g，4，高速离心90 min浓缩病毒。去除上清后用1mL无血清培养基重悬病毒沉淀，将病毒分装，直接用于感染细胞或者保存于-80 备用。1.3.2病毒感染H9细胞H9细胞在感染病毒前一天铺板，感染时密度为 20%到 30%。病毒从-80 拿出后置于冰上融化，3 000g离心2 min，取上清加至细胞培养基中，并加入 polybrene使其终浓度为8 g/mL。放入37、5%CO2的培养箱中培养，感染病毒24 h后更换培养基，继续培养。1.3.3 嘌呤霉素筛选阳性细胞 慢病毒干扰对照质粒 IMIRXPress、慢病毒干扰质粒 shDANCR#1和shDANCR#2 都具有嘌呤霉素抗性，因此可以使用嘌呤霉素筛选阳性细胞。使用mTeSR 培养基，含双抗（100 U/mL 青霉素和 0.1 mg/mL 链霉素）和1 g/mL嘌呤霉素筛选细胞 48 h，PBS洗涤两遍后换液mTeSR 培养基继续培养。1.4细胞总RNA提取、逆转录和qPCR1.4.1 细胞总 RNA提取 移除细胞培养基，加入500 L RNAzol RT（MRC公司，美国）裂解10 min，将裂解液体转移至1.5 mL EP管中；向每份样品中加入200 L DEPC水，充分混匀，冰上静置15 min；4，12 000g离心15 min，用200 L RNase-free枪头分次吸取共600 L上清至RNase-free EP管中；向吸出的上清加入600 L 异丙醇，充分混匀，冰上静 置 15 min 使 RNA 沉 淀；4 ，12 000g 离 心15 min，此时可见管底有白色沉淀，沉淀即为RNA，小心去除上清，加入 75%乙醇洗涤沉淀，4，5 000 g离心5 min，小心去除上清；加入75%乙醇再次洗涤沉淀，4，5 000g离心5 min。彻底吸除上清，开盖置于冰上晾干至沉淀边缘透明，加入适量 DEPC 水溶解沉淀，于冰上溶解 15 min，使用Nanodrop测定RNA浓度及纯度。1.4.2 逆转录 取 1g RNA用 RNase-free水调整体积至10 L，42 5 min 去除基因组DNA。加入10 L 2NovoScript Plus 1st Strand cDNA 混 合 均匀，50 15 min；75 5 min终止反应。（逆转录试剂盒，Novoprotein，中国）。47第45卷中山大学学报（医学科学版）1.4.3 qPCR 取 1 L cDNA、1 L qPCR-F（0.5 mol/L）、1 L qPCR-R（0.5 mol/L）、5 L 480mix（2）、2 L ddH2O 配制 qPCR 反应体系；反应条件是：95 反应10 min，95 反应10 s，60 反应20 s，72 反应20 s，设置40个循环。（荧光定量PCR试剂，Roche公司，瑞士）。本文所用引物由生工生物工程有限公司合成，引物序列见附表1。1.5细胞总蛋白提取和蛋白免疫印迹1.5.1 细胞总蛋白提取 移除细胞培养基，用PBS洗涤两次，用EDTA消化细胞，收取细胞沉淀，每六孔板收集细胞加入150 L RIPA裂解液（Millipore，美国），裂解液在使用前加入蛋白酶抑制剂混合物（上海碧云天生物技术有限公司，中国），冰上裂解10 min。10 000g，4 离心15 min，将上清转移至新的 1.5 mL EP管中。使用 BCA试剂盒（Thermo，美国）测定蛋白质样品浓度。向蛋白质样品中加入4loading buffer，使loading buffer终浓度为1，95 变性 5 min，直接进行 Western blot 检测或保存于-80 待用。1.5.2 蛋白免疫印迹 根据Bio-rad预混液配方配制分离胶和浓缩胶进行SDS-PAGE电泳，200 V恒压电泳约 30 min。电泳结束后，将蛋白转移到PVDF膜（Millipore，美国）上，200 mA 70 min转膜。转膜结束后，用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜60 min。用5%BSA配制一抗，4 孵育过夜，取出室温摇床上再继续孵育30 min后，用 TBS/T洗 3次，5 min每次；加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育 1 h。用 TBS/T洗 3次，5 min/次，加入化学发光底物 ECL，使用 Bio-Rad成像系统检测条带。本文 所 使 用 抗 体 如 下：GAPDH、SOX17、FOXA2、NANOG 抗体（CST，美国）；OCT4、SOX2 抗体（Abcam，英国）。1.6细胞免疫荧光染色将细胞种植于已铺有圆玻片的24孔板，置于37，体积分数5%CO2细胞培养箱内培养。待细胞生长到合适时间，取出24孔板，弃去培养基，PBS洗涤2次，吸走液体，40 g/L多聚甲醛固定液室温固定20 min。PBS洗涤3次。0.3%Triton X-100室温静置穿透15 min。PBS洗涤3次。加入适量山羊血清封闭，37 孵育 30 min，弃去液体。加入一抗，4 过夜。PBS洗涤3次。加入二抗，37 避光孵育 1 h。PBS 洗 涤 3 次。加 入 DAPI，室 温 孵 育4 min。PBS洗涤3次。将圆玻片挑出，用Dako液封片于载玻片上，使用荧光显微镜（Leica，德国）进行拍照。所使用抗体如下：SOX17、FOXA2抗体（CST公司，美国）。1.7双荧光报告基因检测转染shDANCR和shNC慢病毒的H9细胞以5104 cells/cm2密度传代到预先铺好 Matrigel的 24孔板上，分别按 TOP-Flash：pRL-TK 为 3：1、FOP-Flash：pRL-TK 为 3：1 配制质粒混合液，使用 lipo3000（Thermo，美国）转染H9细胞，置于37，体积分数5%CO2细胞培养箱内培养。细胞贴壁生长24 h后换液为DE诱导第1天培养基，培养24 h后，弃去培养液，用PBS洗涤两遍，使用Dual Luciferase Reporter Assay Kit（Vazyme，中国）检测 Luciferase活性。1.8统计分析统计分析采用 SPSS 25.0完成。两组计量资料的比较采用独立样本t检验，多组计量资料的比较进行单因素方差分析，方差分析有统计学意义时多重比较采用 LSD、Dunnetts t检验，检验水准=0.05。2 结 果2.1DANCR在hESC中高表达并且与DE分化相关DANCR是一种在成体干细胞和肿瘤中表达量较高的lncRNA。本研究发现，DANCR在未分化的hESC中也高度富集。为了探讨DANCR在hESC向DE分化中的作用，我们参考文献6建立了体外诱导hESC分化为DE细胞的培养体系（图1A）。细胞免疫荧光染色结果显示，分化第 4 天能够检测到DE分子标志物 SOX17和FOXA2表达（图1B）。qPCR结果显示，随着DE分化的进行，原条和DE的分子标志物的表达水平被显著诱导上调。在DE分化第1天，原条标志物 B（T）的表达量是未分化hESC的（589389）倍，中位数（四分位数间距）为 544（243980），EOMES 的表达量是未分化 hESC 的（461349）倍，中位数（四分位数间距）为370（184829）。DE 标志物 SOX17和 FOXA2的表达量分别是未分化 hESC 的（7 5604 446）倍和（1 113686）48第1期邓家成，等.DANCR在人胚胎干细胞向内胚层分化中的调控功能倍（DE分化第4天），证明该诱导体系的有效性（图1C）。为了验证DANCR和DE分化是否相关，我们利用上述分化体系检测了DANCR的表达变化。如图1D所示，DANCR表达随着DE分化进程逐渐下降，在分化第4天时DE细胞中的表达量是未分化hESC的（0.450.17）倍，中位数（四分位数间距）为0.38（0.350.63），提示DANCR与DE分化具有密切关系。2.2DANCR 不影响hESC的多能性基因表达为了进一步研究DANCR与DE分化的关系，我们通过慢病毒体系建立稳定敲低DANCR的hESC细胞株。如图2A所示，两个含有独立靶向DANCR的shRNA的hESC细胞系shDANCR#1组和shDANCR#2 组，其 DANCR 表达水平分别为对照细胞系shNC 组的（0.1490.031）倍和（0.1180.038）倍。3组样本量分别为 5，单因素方差分析 F=1 545.71，P 0.001，3 组 DANCR 表达水平差异有统计学意义。LSD检验结果表明，shDANCR#1组与shNC组相比较，P 0.001；shDANCR#2 组与 shNC 组相比较，P 0.001。荧光倒置显微镜观察显示，敲低DANCR的hESC经过多次传代仍然能以不分化的克隆形态生长，shRNA载体自带的GFP蛋白荧光信号也能长期保持（图 2B）。为了进一步确定 hESC的多能性分子标志物的表达水平是否有变化，Western blot 检 测 了 hESC 中 的 OCT4、SOX2 和NANOG，结果显示敲低DANCR后上述三种蛋白的表达水平均无显著变化（图2C）。2.3敲低DANCR阻碍hESC向DE分化图1D提示DANCR与DE分化密切相关，因此我们用稳定敲低DANCR的hESC细胞株诱导DE分化进行研究。qPCR结果如图3A所示，DE分化第4天时，shNC组、shDANCR#1组和 shDANCR#2组中的 SOX17 表达水平分别为未分化 hESC 细胞的（78971939）倍，（3055709）倍 以 及（3323810）倍；FOXA2 表达水平分别为未分化 hESC 细胞的（788154）倍，（434102）倍，以及（26141）倍。单因素方差分析：SOX17（n=3，F=13.55，P 0.05）、FOXA2（n=3，F=18.21，P 0.05），组间差异具有统计学意义。LSD 检验结果表明，与 shNC 组相比，shDANCR#1组和 shDANCR#2组的 SOX17、FOXA2表达均明显降低，差异均具有统计学意义（P 0.05）。Western blot结果显示（图3B），敲低DANCR导致SOX17和FOXA2 蛋白表达水平下降。DE分化第1天时，qPCR检测原条分子标志物的结果显示（图3C），单因素方差分析：B（T）（n=5，F=31.63，A:Diagram for the differentiation protocol from hESC to DE.B:Immunofluorescence staining showed the expression of SOX17 and FOXA2 on DE day 4.Bar=50 m.C:qPCR demonstrated the expression levels of B(T),EOMES,SOX17 and FOXA2 on DE differentiation days 0,1,2,3 and 4.*P 0.05 compared with DE day 0.D:qPCR verified the expression pattern of DANCR on DE differentiation days 0,1,2,3 and 4.*P 0.05 compared with DE day 0.图1DANCR在hESC中高表达并且与DE分化相关Fig.1DANCR was enriched in hESC and involved in DE differentiation49第45卷中山大学学报（医学科学版）P 0.001），EOMES（n=4，F=23.16，P 0.001），MIXL1（n=4，F=19.61，P 0.05），GSC（n=3，F=9.73，P 0.05），组间差异具有统计学意义。LSD检验结果表明，与 shNC 组相比，shDANCR#1 组和shDANCR#2 组的 B（T），EOMES，MIXL1 和 GSC 表达均明显降低，差异均具有统计学意义（P 0.05）。Western blot结果显示（图3D），敲低DANCR导致B（T）和EOMES蛋白表达水平下降。2.4DANCR在DE分化过程中调控WNT通路活性为了进一步探讨DANCR对DE分化调控作用的分子机制，我们分别检测了 DANCR 与 TGF 通路和WNT通路之间的关系。首先，我们检验了DANCR是否能够通过调节TGF 通路影响 DE 分化。Western blot 检测了 DE分化第0天和第4天的SMAD2/3 和p-SMAD2蛋白水平，两个shDANCR组相比shNC组并没有显著的变化（图4A）。Western blot条带的灰度值计算如图4B所示，SMAD2/3 蛋白水平在DE分化第0天和第4天，shNC、shDANCR#1和shDANCR#2组做单因素方 差 分 析 分 别 为 F=2.41，P=0.17 和 F=0.94，P=0.44。p-SMAD2蛋白水平在DE分化第0天和第4天，shNC、shDANCR#1 和 shDANCR#2 组做单因素方 差 分 析 分 别 为 F=1.01，P=0.42 和 F=0.20，P=0.82。SMAD2/3 和p-SMAD2的蛋白水平在各组间A:qPCR demonstrated the expression levels of DANCR in shNC and shDANCR hESC Lines.*P 0.05 compared with shNC group.B:Bright field and green fluorescence of hESC with shNC,shDANCR#1 and shDANCR#2 three weeks after shRNA transfection.Bar=100 m.C:Western blot validated the protein expression of OCT4,SOX2,NANOG upon DANCR knock down in hESC.图2DANCR 不影响hESC的多能性基因表达Fig.2DANCR knock down had no influence on the pluripotent genes expression of hESCA:qPCR showed the decrease in SOX17 and FOXA2 expression upon DANCR knock down on DE day 4.*P 0.05 compared with shNC group.B:Western blot validated the decrease in SOX17 and FOXA2 expression upon DANCR knock down on DE day 4.C:qPCR showed the decrease in B(T),EOMES,MIXL1 and GSC expression upon DANCR knock down on DE day 1.*P 0.05 compared with shNC group.D:Western blot validated the decrease in B(T)and EOMES expression upon DANCR knock down on DE day 1.图3敲低DANCR阻碍hESC向DE分化Fig.3DANCR knock down impeded hESC differentiation towards DE50第1期邓家成，等.DANCR在人胚胎干细胞向内胚层分化中的调控功能的差异不具有统计学意义。其次，我们检测了DANCR对WNT通路的活性是否具有调节作用。带有TCF/LEF结合位点的报告基因质粒（TOPFlash）可检测 WNT 通路活性。Dual luciferase reporter assay 结果如图 4C 所示，在DE分化第1天时，瞬转TOPFlash的shDANCR#1组和 shDANCR#2组的检测数值水平分别为 shNC组的（0.2970.073）倍和（0.550.25）倍。单因素方差分析（n=3，F=16.32，P 0.05），3组差异有统计学意义。LSD检验结果表明，与shNC组相比，shDANCR#1组和shDANCR#2组的WNT通路活性明显降低，差异均具有统计学意义（P 0.05）。然而瞬转阴性对照（FOPFlash）的shDANCR#1组、shDANCR#2组和shNC组，单因素方差分析（n=3，F=0.47，P=0.646），差异无统计学意义。另外，为了进一步确认DANCR对WNT通路的活性具有调控作用，qPCR检测DE分化第4天WNT通路下游基因的表达，结果如图4D所示，FZD5（n=3，F=15.85，P 0.05），FZD8（n=3，F=18.06，P 0.05），SFRP1（n=3，F=13.35，P 0.05），FRZB（n=3，F=29.53，P 0.05）和ANKRD6（n=3，F=18.98，P 0.05）的组间比较均有显著差异。与shNC组相比，shDANCR#1组和shDANCR#2组的FZD5、FZD8、SFRP1、FRZB 和 ANKRD6 的表达均明显降低，差异均具有统计学意义（P 0.05 compared with shNC group.C:Dual luciferase reporter assay showed the WNT pathway activity was suppressed by DANCR knock down on DE day 1.*P 0.05 compared with shNC group.D:qPCR detected decreased expression of the WNT pathway genes FZD5,FZD8,SFRP1,FRZB,ANKRD6 upon DANCR knock down on DE day 4.*P 0.05 compared with shNC group.图4DANCR在DE分化过程中调控WNT通路活性Fig.4DANCR modulated the activity of the WNT pathway during DE differentiation51第45卷中山大学学报（医学科学版）的激活剂）代替 WNT3a 对 shDANCR 细胞进行 DE诱导。结果表明（图5A），WNT3a诱导的shDANCR细胞中原条分子标志物 B（T），EOMES，MIXL1 和GSC的表达显著低于对照细胞；然而在CHIR99021处理的shDANCR细胞中仅观察到这些基因的轻微下降。因此，直接激活-CATENIN 能回补敲低DANCR 导致的 DE 分化缺陷。综上所述，DANCR可以通过调控WNT通路的配体和受体基因表达在DE分化过程中发挥调节作用（图5B）。3 讨 论DANCR已被报道能够参与多种肿瘤的发生、发展和成体干细胞的维持，但 DANCR 在多能性hESC中的生物学功能尚需更多研究探索。虽然在未分化的hESC中DANCR表达丰富，本研究发现它对于维持多能性不是必需的。同时，我们揭示了DANCR在hESC分化为DE过程中具有未被报道的功能，即DANCR可以通过调控WNT通路的活性调节DE分化。我们推测hESC中DANCR的高表达增强了hESC对DE分化诱导信号的敏感性，促进其从多能性状态向分化状态的转变。通过对WNT通路活性的调控，DANCR可能进一步促进hESC在诱导后定向分化为DE。有趣的是，尽管DANCR对DE分化有正向调节作用，DANCR的表达量在DE分化过程中却逐渐下调。我们推测，DANCR表达量下调可能有利于细胞分化从原条阶段向DE阶段推进，因为DE分化后期并不需要激活WNT通路。通过降低DANCR表达量来下调WNT通路，可能是确保DE诱导信号维持在合适水平的一种巧妙的方式。尽 管 已 有 研 究 报 道 DANCR 通 过 稳 定ID2 mRNA，抑制脂肪来源的间充质干细胞形成内胚层17，本研究发现DANCR能通过调节WNT通路活性来促进hESC向DE分化。DANCR在内胚层形成中的不同作用可能取决于特定的细胞环境。本研究表明，WNT通路的转录活性在敲低DANCR后被减弱（图 4A，B），而直接激活-CATENIN 能够回补敲低DANCR引起的DE分化缺陷（图5A）。在肝 细 胞 癌 中 的 研 究 表 明，DANCR 能 够 调 节-CATENIN 的表达以维持肿瘤干细胞的干性18。因此，在DE分化过程中进一步研究DANCR与WNT通路的效应分子（如-CATENIN）之间的相互作用，可帮助阐明 DANCR 调控DE分化的详细分子机制。A:qPCR compared the relative expression levels of primitive streak marker genes induced by CHIR99021 with those induced by WNT3a.Both treatments were in combination with ACTIVIN A for one day.*P 0.05 compared with shNC group.B:A schematic diagram for the regulatory function of DANCR on the WNT pathway durin