基于点扫描的高时空分辨荧光显微成像技术进展.pdf

专题:华南师范大学建校暨物理学科建立 90 周年基于点扫描的高时空分辨荧光显微成像技术进展*潘彬雄1)#弓晟1)#张鹏1)刘子叶1)皮彭健1)陈旺1)黄文强2)王保举1)詹求强1)1)(华南师范大学,华南先进光电子研究院,广州510006)2)(华南师范大学物理学院,广州510006)(2023年 6月 1 日收到;2023年 8月 23 日收到修改稿)激光点扫描荧光显微镜凭借高分辨率、高灵敏度、高特异性、可光学层切三维成像和动态成像等优势,已成为生命科学研究中广泛应用的重要工具.随着研究者对生命科学研究的逐渐深入,由于受光学衍射极限影响和逐点扫描探测的限制,传统点扫描共聚焦显微镜的时空分辨率已无法完全满足相关研究需求,在实际应用中面临诸多挑战.近二十年来,超分辨荧光显微成像技术取得了重要进展,研究人员发展了多种高空间分辨率、高时间分辨率的点扫描荧光显微成像技术,对于生物成像等具有重要意义.然而,有关该领域最新进展的综述论文较少,系统地讨论、总结基于点扫描的高时空分辨荧光显微成像技术的研究进展,对于其未来研究发展极为重要.本文主要从时间分辨率与空间分辨率两个维度分别介绍了各类点扫描荧光显微成像技术的基本原理及相关进展,并介绍了高时空分辨显微成像技术及应用,最后讨论展望了高时空分辨点扫描荧光显微镜的未来发展趋势和挑战.关键词：点扫描共聚焦,超分辨显微成像,荧光显微镜,时空分辨率PACS：42.40.Lx,42.15.Eq,87.64.M,87.64.mkDOI:10.7498/aps.72.202309121引言dmin=0/(2NAobj)Zmin=20/(NAobj)2dminZmin0NAobj光学显微镜将人类视野从宏观拓展到了微观领域,为探究物质构成与生命起源发挥了重要作用.1873 年,德国科学家 Abbe 提出传统光学显微镜的分辨率由波长和物镜数值孔径决定,其理论公式为横向分辨率 ,轴向分辨率 1,2.其中,是横向分辨最小距离;是轴向分辨最小距离;是光波长;是物镜数值孔径.因此,在可见光波段,传统光学显微镜分辨率,横向约 200nm,轴向约 500nm.然而,为进一步揭示蛋白分子相互作用,亚细胞器动态变化等机理,光学显微镜分辨率需要由百纳米量级跨越至几十纳米甚至几纳米量级.为实现上述目标,研究者提出多种突破衍射极限的远场光学显微超分辨成像技术,其中代表性技术有:基于单分子定位显微镜(single-moleculelocalizationmicroscopy,SMLM)的光激活定位显微镜(photo-activatedlocalizationmicroscopy,PALM)3和随机光学重构显微镜(stochasticopticalreconstru-ctionmicroscopy,STORM)4,基于频域扩展的结构光照明显微镜(structuredilluminationmicro-scopy,SIM)5,以及基于点扫描成像的受激辐射损*国家自然科学基金(批准号:62335008,62122028,11974123,62105106)、广东省基础与应用基础研究基金(批准号:2023B1515040018,2022A1515011395)、广州市基础与应用基础研究基金(批准号:202201010376)和中国博士后科学基金(批准号:2021M691089,2023T160237)资助的课题.#同等贡献作者.通信作者.E-mail:通信作者.E-mail:2023中国物理学会ChinesePhysicalSocietyhttp:/物理学报ActaPhys.Sin.Vol.72,No.20(2023)204201204201-1耗显微镜(stimulatedemissiondepletion,STED)6.这些代表性技术在空间分辨率与时间分辨率方面各具优势.例如,单分子定位显微镜(SMLM)核心思想为“闪烁”、“定位”与“重构”79,通过每次激发少量探针以达到高定位精度,横向分辨率最高可达 10nm,但需要大量原始图像进行重构计算,因此时间分辨率通常在分钟量级,难以实现活细胞快速动态成像.SIM 技术采用结构光照明方式,提取目标图像的高频信息,需 59 张原始图像重构计算出高分辨图像10,11,其时间分辨率相对较高,但空间分辨率有限,仅比宽场显微镜提高 2 倍.相较于上述两类技术,STED 技术的空间分辨率显著高于 SIM,一般为 2050nm6,12,13,时间分辨率也明显高于 SMLM,因此在兼具高时空分辨率方面具有优势(表 1).为应对当前科学研究需求,研究者对现代显微技术的时空分辨率均提出了更高要求,实现高时空分辨率显微成像技术已成为显微成像领域的重要研究方向.本文主要介绍了多种基于点扫描成像的技术原理及相关进展,从时间分辨率与空间分辨率两个维度分别讨论了各类技术的发展与应用,总结了基于点扫描的高时空分辨显微成像技术进展及应用,最后分析讨论了高时空分辨点扫描荧光显微镜的未来发展趋势和挑战.2传统点扫描共聚焦显微成像早期,传统光学显微成像系统以宽场显微镜为主,即整个样品被同时激发,所产生的荧光信号被相机收集的同时,也包括了未聚焦的背景信号(图 1(a)和图 1(b).因此,宽场显微镜的轴向分辨率很差,无法实现清晰的三维成像(图 1(e)和图 1(f).共聚焦激光扫描显微镜(confocallaserscanningmicroscopy,CLSM)通过空间针孔阻挡了离焦光,进而提高了分辨率和对比度,使其具备光学切片的能力,能够实现清晰的三维成像(图 1(c)(f)14,15.因此,共聚焦激光扫描显微镜凭借具有非接触、非侵入性、操作简便等优势,得到了广泛应用,且已实现了商业化16,17.为提高共聚焦显微镜分辨率,1988 年 Shep-pard19提出了在不牺牲信噪比的情况下,获得两倍分辨率提高的点扫描共聚焦成像方式,其原理为使用阵列探测器替代单像素探测器,每个像素都充当一个针孔,用于记录分辨率增强但信号低和偏移的共焦图像,如图 2(a)所示.通过将检测到的荧光向照明轴重新分配来校正偏移并恢复信号,如图 2(b)所示,从而减少信号损失的情况下提高了分辨率.与反卷积算法结合,横向分辨率可以达到120nm,该成像系统已有商业化产品,即蔡司的Airyscan 显微镜20.然而,逐点串行扫描方式会导致时间分辨率相对较差.例如,同样成像视野(512512 像素),宽场成像单帧时间为 20ms,共聚焦点扫描单像素驻留时间为 10s,整个成像视野则需 2.6s.3高时间分辨率点扫描成像技术3.1 基于多焦点阵列提高成像速度为提高共聚焦显微镜成像速度,2010 年 Mll-er 和 Enderlein21提出了基于面阵探测器(CCD)的单焦点激光扫描共聚焦显微成像技术,并将其命名为图像扫描显微技术(imagescanningmicros-copy,ISM).其将传统的共焦激光扫描显微镜与快速宽场 CCD 检测相结合,同时通过上述像素重定位方法和反卷积算法实现分辨率提升.在对荧光珠成像中,传统共聚焦显微镜实现了 244nm 分辨率,而 ISM 的分辨率可至 150nm,相比于 CLSM 分辨率提高了约 1.63 倍(图 2(a)(c).为解决 ISM表1SMLM,SIM,STED 超分辨技术的关键性能指标对比Table1.TechnicalcomparisonofSMLM,SIM,STEDsuper-resolutionmicroscopy.技术横向分辨率/nm轴向分辨率/nm二维时间分辨率激光类型激光强度/(Wcm2)激光波段荧光漂白程度重构算法SMLM3,4,7,810304070110min(20m20m)CW1000可见光需要SIM10,1190110300110ms(40m40m)CW1100可见光需要STED6,12,13205040150120s(50m50m)fs/ps1091010可见光无需物理学报ActaPhys.Sin.Vol.72,No.20(2023)204201204201-2技术单点扫描成像速度有限的问题,York 等22在2012 年提出了多焦点结构光照明显微镜(multi-focalstructuredilluminationmicroscopy,MSIM).该技术原理如图 2(d)所示,采用高速数字微反射镜器件(digitalmicromirrordevice,DMD)同时实现多焦点结构光的产生和扫描,通过数字像素重定位和反卷积技术进行图像重构,在45.6m45.6m的超大视野成像中获得了 1Hz 时间分辨率,并以此实现三维层切成像,其中成像深度可达 48m,同时具有横向约 145nm、轴向约 400nm 的空间分辨率,如图 2(e)和图 2(f)所示.该技术相比单点扫描 ISM 技术不仅具有高时间分辨率,还同时具有深层三维成像能力,为活体厚样品的三维成像提供了强有力的工具.为进一步提高 MSIM 成像深度,2014 年,Ingaramo 等23引入近红外脉冲光实现了多光子激发的 MSIM 技术,将成像深度提高至 100m,同时兼顾了高时间分辨率与高空间分辨率的优势.3.2 基于微透镜阵列提高成像速度由于多焦点光场的光强严重受限于数字微镜阵列和空间光调制器的反射效率.为生成高效率多焦点光场,有研究者提出利用微透镜阵列产生并行多焦点聚焦光斑.转盘共聚焦显微镜(spinningdiskconfocalmicroscopy,SDCM)正是利用此概念,如图 3(a)所示,该系统核心器件由两个分别带有微透镜阵列和针孔阵列的转盘组成.当用准直光照射时,每个微透镜都会产生一个聚焦光点,微透镜阵列产生约 1000个焦点对样品进行实时扫描成像26,27.在相同信噪比下,转盘共聚焦显微镜的成像速度是传统共聚焦显微镜的 10100 倍28.此外,转盘共聚焦显微镜还具有降低光漂白,细胞光毒性低,可长时程活细胞成像的优势2931.转盘共聚焦显微镜虽然借助微透镜阵列提高了成像速度,但其分辨率相较于传统共聚焦显微镜并未改善.为了提高转盘共聚焦显微镜分辨率,同时兼顾其高速成像的优势,York 等32在 2013 年提出了一种基于微透镜阵列的实时多焦点结构光超分辨技术(instantaneousstructuredilluminationmicr-oscope,Instant-SIM),其原理为:首先利用微透镜阵列生成多焦点激发模式,与之相匹配的针孔阵列在共焦面抑制离焦荧光信号,再利用一个共轭且匹配的微透镜阵列局部缩小每个透过针孔的荧光焦Focus areaBackgroundCellOptical sectionCoverslipWidefield2D imageConfocal2D imageWidefield3D volumeConfocal3D volumeCoverslipStacks ofoptical sectionsStacks ofwidefield imagesCell(a)(b)WidefieldConfocalSingle plane(e)WidefieldConfocal3D rendering(f)(c)(d)CameraPinholeTubelensFilterFocalplaneDichroicmirrorDetectorConfocalWidefield图1宽场和共聚焦显微成像技术对比(a)宽场显微镜系统简化图;(b)宽场显微镜荧光信号采集方式18;(c)共聚焦显微镜系统简化图;(d)共聚焦显微镜荧光信号采集方式18;(e)二维切面图对比18;(f)三维重构图对比18Fig.1.Comparisonofwide-fieldandconfocalmicroscopy:(a)Simplifiedsystemschematicofwide-fieldmicroscopy;(b)fluorescentsignalacquisitionofwide-fieldmicroscopy18;(c)simplifiedsystemschematicofconfocalmicroscopy;(d)fluorescentsignalacquisi-tionofconfocalmicroscopy18;(e)comparisonoftwo-dimensionalsectionimages18;(f)comparisonofthree-dimensionalreconstruc-tionimages18.物理学报ActaPhys.Sin.Vol.72,No.20(2023)204201204201-3点至原来尺寸的 1/2,通过硬件实现像素重定位效果,最后再由振镜控制激发点阵扫描整个视场,并将缩小后的荧光点阵反射到 CCD 对应的位置,叠加形成实时超分辨图像(图 3(b).Instant-SIM 将MSIM 需要后处理的步骤完全在硬件中实现,使其具备了对活体样品进行高分辨率实时观测的能力.同时,Instant-SIM 的横向和轴向的分辨率分别为145nm 和 350nm,采集速度高达 100Hz,并在活体肺成纤维细胞中以更高的三维分辨率且 10 倍于转盘共聚焦显微镜的成像速度获取双色超分辨图像(图 3(c).Qin 等25,33还通过将传统转盘共聚焦显微镜与 ISM 的超分辨方法相结合,提出了分辨率更高的 CSD-ISM 技术,其显著优势在于可简单实现,如对现有共聚焦旋转盘装置进行光源调制,使旋转盘与照明和成像相机同步,从而很容易地升级到 ISM.4超高空间分辨率点扫描成像技术4.1 点扫描超分辨成像技术研究者提出的上述多种方案提高了成像速度,但依然面临空间分辨率有限的问题.为实现共聚焦超分辨成像(100nm),Hell 和 Wichmann6在(a)(d)to microscopeto microscopef=50 mmf=75 mmf=30 mmf=200 mmDMDPivot axisSHDC120 images224 images418 imagesSingle or multiple excitation beamsScanningmirrorPSFexPSFemPSFsystemTube lensCameraPhotonreassignmentPSFsystem=PSFexPSFemSampleObjectiveDichroic(b)Raw imageISM imagePhysicalsizeRaw imageISM imageFourier filteredISM image(c)MSIM=1.4 mmWide-field=1.4 mm(e)=12.6 mmTT45.6 mmT45.6 mmT48.2 mm(f)图2基于多焦点阵列的快速成像技术示意图(a),(b)像素重定位原理24,25;(c)共聚焦显微镜和 ISM 对 100nm 直径荧光球的成像对比21;(d)MSIM 照明系统22;(e)MSIM 和宽场显微镜的活细胞双色成像对比22;(f)MSIM 的活细胞三维成像22Fig.2.Schematicdiagramoffastimagingtechnologybasedonmultifocusarray:(a),(b)Principleofpixelreassignment24,25;(c)im-agingcomparisonofconfocalmicroscopeandISMon100nmdiameterfluorescentspheres21;(d)illuminationsystemforMSIM22;(e)dual-colorimagingcomparisonofMSIMandwide-fieldmicroscopeonlive-cell22;(f)3DimagingoflivecellsbyMSIM22.物理学报ActaPhys.Sin.Vol.72,No.20(2023)204201204201-4d=0/2NAobj1+ISTED/Isatd1994 年提出了受激辐射损耗显微术(STED).该技术通过缩小有效激发光斑的尺寸来实现衍射极限的突破,其基本原理如图 4(a)所示,STED 超分辨成像系统通常由两束激光构成,一束为高斯光,也称作激发光,另一束为“甜甜圈”状的空心光,也称作损耗光,将两束光在空间上精准耦合对齐,仅中间空心位置可发出荧光,实现减小激发光斑的效果,进而获得超分辨成像能力34,35.STED 分辨率由公式 所决定,其中 为横向分辨最小距离,ISTED为损耗光光强;Isat为损耗光的饱和光强,其含义为使荧光强度降低为初始大小 1/2 时的损耗光强度.由上述公式可知 STED 光强越高,则分辨率越高(图 4(a).因此,理论上 STED 分辨率可达无限小36.例如,有研究者利用 NV 色心证实在 3.7GW/cm2的损耗光强下实现了 2.4nm 的分辨率(图 4(b)37.传统染料和荧光蛋白饱和光强较高,其所需损耗光光强通常在 MW/cm2GW/cm2量级,仅能实现 4060nm 的分辨率.同时,传统商业染料和荧光蛋白无法承受高光强损耗光,极易出现光漂白现象,同时高光强损耗光也会对细胞造成严重光毒性,影响细胞活性38.因此,在实际应用中 STED的损耗光强难以无限提高.为了降低损耗光光强,进而减少光漂白和光毒性,研究者提出了基态损耗(groundstatedepletion,GSD)技术39,该技术相较 STED 大大降低了光功率,可以实现连续光激发与损耗.GSD 技术的损耗光强相比传统 STED 功率降低了 3 个数量级40,更适合生物组织细胞成像.同时,为了减少扫描成像过程中的无效照明,研究者探究了许多方法,如MINFIELD 成像技术41,通过仅对提前确定的亚衍射区域照射来尽可能地减少光损伤;又如 Dy-MIN 成像技术42,使用像素停留时间的一小部分来驱动位于 STED 光束的环形波峰上的荧光团进(a)Lens discMicrolens arrayBarrierfilterMonochromeCCD cameraPinhole(Nipkow)diskExcitation and emission lightDichromaticbeam splitterTube lensSpecimenSweeppatternEmissionlightShaped and collimatedlaser illumination50 mmpinhole arrayMultifocal excitationPinholingLocal scalingSummingCameraGalvo1T0.5TPinhole arrayConverging microlensarray(b)(c)TFAM-GFPTom20-mCherryInstant SIMSpinning-disk confocal2.5 s 7.5 s10 s25 s45 s0 s12 s24 s36 s48 s图3基于微透镜阵列的快速成像技术示意图(a)转盘共聚焦系统简化图;(b)实现 Instant-SIM 的关键步骤32;(c)Instant-SIM和转盘共聚焦显微镜的活细胞双色成像对比32Fig.3.Schematicdiagramoffastimagingtechnologybasedonmicrolensarray:(a)Simplifiedschematicofthespinningdiskcon-focalsystem;(b)keystepsinimplementingInstant-SIM32;(c)dual-colorimagingcomparisonofInstant-SIMandspinningdiskcon-focalmicroscopeonlive-cell32.物理学报ActaPhys.Sin.Vol.72,No.20(2023)204201204201-5入暗状态.相比传统 STED 技术,该成像技术将损耗光强降低了 1/20.尽管已提出多种成像技术降低损耗光光强,但是 STED 技术仍然面临着损耗光强高、光路难以校准、成像方法复杂等问题.PSFFED=PSFsolid rPSFdoughnutPSFFEDPSFsolidPSFdoughnut为解决上述难题,Kuang 等43提出荧光差分技术(fluorescenceemissiondifferencemicroscopy,FED)来降低空心光光强并降低光路复杂性.该技术分别利用实心光斑和空心光斑扫描样品获得两张图像,并将两张图像相减,最终得到差分超分辨图像(图 4(c),(d),其原理公式可表示为 ,分别为 FED、实心光斑和空心光斑的点扩散函数(pointspreadfunction,PSF),r 为相减系数47,48.与 STED类似,当产生荧光非线性饱和时,FED 技术的分辨率可进一步提高49.相比 STED 技术,FED 方法具有无荧光染料限制、成像系统简单、后期处理方便的优势.FED 技术虽具有光强低的优势,但存在分辨率相对较低的问题,一般而言,FED 技术分辨率难以突破 100nm.为追求超高分辨率,进一步降低损耗光强,研究者提出了基于光开关属性的可逆饱和光转移荧光超分辨显微技术(reversiblesaturableDM1DM2Obj.SampleFluorescenceExcitationExcitationSTED laser powerFluorescenceGroundstatesExcitedstatesSTEDSTED(a)Negative confocalFEDConvolutionwith pinholeConvolutionwith pinholeConfocalDetection:Excitation:Subtraction(c)(b)Confocal0167021STED50 nmIntensity norm.1.00.50-150-1010010-10 00150STED4.2 nm6.8 nmConfocal160 nm/nm/nm/nmIntensity norm.1.00.50-100-101000100STED2.4 nmConfocal/nm/nmIntensity/arb.units1.00.20.40.60.800 100300500700Distance/nmIntensity/arb.units1.00.20.40.60.800200 400 600Distance/nmConfocalFEDSolidDoughnutFED(d)(e)Switch onSwitch offRead outMove one pixel(f)ConfocalResolftResolft21Photon counts20406000200 300/nm10036 nm2Photon counts20406000200400/nm41 nm1SolidFEDSolidFEDDoughnut330 nm253 nm77 nm54 nm68 nm图4点扫描超分辨成像技术示意图(a)STED 原理图;(b)STED 在 NV 色心上实现 2.4nm 分辨率37;(c)FED 原理图43;(d)单颗粒 FED 成像44;(e)RESOLFT 原理图45;(f)共聚焦显微镜和 RESOLFT 的细胞成像对比46Fig.4.Schematicdiagramofpointscanningsuper-resolutionimagingtechnology:(a)STEDschematic;(b)STEDachieves2.4nmresolutiononNVpoint37;(c)FEDschematic43;(d)UCNPs-FEDsingleparticleimaging44;(e)RESOLFTschematic45;(f)cellimagingcomparisonofconfocalmicroscopeandRESOLFT46.物理学报ActaPhys.Sin.Vol.72,No.20(2023)204201204201-6opticalfluorescencetransitions,RESOLFT)50,51,RESOLFT 首先使用 405nm 激发光激活衍射受限光斑区域内的蛋白分子,使其发光,再使用一束488nm 环形光使偏离中心的蛋白分子转化为非发射状态,最后收集荧光信号(图 4(e).与 STED 相比,在获得相同分辨率的情况下,该技术所需要的光强可降低 8 个数量级.然而,该技术的成像速度取决光开关转换速率.例如,基于绿色荧光蛋白rsEGFP 实现 RESOLFT 技术,其成像的激发功率密度仅为 1kW/cm2,实现了约 36nm 的成像分辨率,但该技术的单像素驻留时间却需 1020ms.为提高 RESOLFT 技术成像速度,研究者发展了绿色荧光蛋白 rsEGFP2,该蛋白的光转换速率较快,扫描速度提升 25250 倍52.但是,RESOLFT荧光探针依然存在着成像时间长、光漂白等缺点.为进一步提高成像分辨率与降低光毒性及光漂白等问题,有研究者提出基于最少光子数的纳米尺度定位技术(minimalphotonfluxes,MINFLUX)作为一种新兴纳米级超高分辨显微技术53,54,使用空心光束作为泵浦光,调节光束中心的位置,当荧光强度最小时,荧光分子就被认为在空心光束中心位置.其成像方式实现了 13nm 的超高空间分辨率.随后研究者在 MINFLUX 的基础上又发展了MINSTED 技术,更是让分辨率突破纳米量级,获得0.23nm 的定位精度55.MINFLUX 和 MINSTED技术在空间分辨率上有着巨大优势,但耗时很长.为彻底解决光漂白问题,降低光毒性,实现超长时程的超分辨成像,本课题组提出了上转换超分辨显微技术.上转换荧光纳米探针(upconvertingnanoparticles,UCNPs)具有近红外激发、非线性强、光谱丰富可调、无荧光漂白等独特优势,在解决传统 STED 面临的激光光强过高、荧光漂白快、无法长时程观测、光毒性大、超快激光系统复杂等方面问题具有很大的潜力.2015 年,Wu 等56首次实现了近红外光束调控上转换荧光损耗现象,获得了 30%的荧光损耗效率,为实现超低功率、无光漂白的上转换超分辨开辟了新思路,提供了重要理论基础.2017 年,为实现上转换超分辨显微技术,Zhan 等57利用“同种离子间交叉弛豫”构建了高效的荧光损耗机理(图 5(a),实现了 96%的极高损耗效率和分辨率为 66nm 的超分辨显微成像(图 5(b),其所需损耗光强相比传统 STED 降低了至少 2 个数量级,克服了光漂白现象,并首次实现了上转换探针标记的亚细胞结构成像.同年,Liu 等58报道了类似的相关现象和上转换超分辨显微技术.为追求更极致的超分辨成像性能,2022 年,Guo 等59结合上转换发光的多光子非线性泵浦依赖特性,提出了受激辐射诱导激发损耗技术(stimulated-emission induced excitation depletion,STExD),可实现传统 STED 所不具有的荧光损耗非线性放大的独特效应,逐级降低高能级荧光损耗所需要的饱和光强,将损耗饱和光强陡降至 42kW/cm2量级,较传统 STED 技术下降 3 个数量级,并获得了34nm 的超分辨成像结果.同年,Pu 等60基于上转换“光-物质-能量吸收体”的荧光损耗理论,提出了表面迁移荧光损耗技术(surface-migrationemis-siondepletion,SMED),将传统的损耗光引起受激辐射与激发光进行低效率竞争,转变为引导荧光能量向高容量能量吸收体转移(图 5(c),实现了极高效的荧光损耗,损耗效率可达 95%,且饱和光强仅为 18.3kW/cm2量级,较传统 STED 技术下降 34 个数量级.同时,仅利用毫瓦级、近红外、连续激光实现了分辨率高达 17nm 的超分辨显微成像(图 5(d).d=0/(2NAobjN)dmin0NAobj上转换荧光除了可以被低光强激光实现高效荧光损耗外,还有具有超饱和非线性(n1)效应.基于上转换非线性效应也可有效调制激发光斑,进而改变成像点扩散函数实现超分辨显微成像.Wu 等62提出了利用单个低功率、波长为 808nm 激光引发掺铒上转换探针产生超饱和非线性激发效应(n=0.59),实现了无光漂白的荧光差分显微技术的超饱和激发上转换超分辨成像,分辨率达到了 80nm.同年,Chen 等63将该成像技术应用深层成像,在 93m厚的组织成像中,实现了 50nm的分辨率.Huang等44构建了激发正交的上转换探针,在低光强、超饱和非线性激发下,实现了铥-蓝光和铒-绿光双通道、无串扰的检测,实现了单次扫描的荧光差分超分辨成像,分辨率高达 54nm 的超分辨成像,同时其成像时间缩短了 1/2.为降低饱和荧光差分超分辨成像技术中对空心光束的依赖,仅用简易的高斯光来实现超分辨成像,有研究者提出基于非线性多光子效应提高成像分辨率,其理论为 ,其中 是横向分辨最小距离;是光在真空中的波长;是物镜数值孔径,N 为非线性多光子数.然而,传统高阶非线性多光子(N1)成像技物理学报ActaPhys.Sin.Vol.72,No.20(2023)204201204201-7术受限于激发波长与非线性阶数 N 彼此依赖的倍数关系,在发射波长不变的情况下,多光子激发过程阶数 N 越高,则需要波长为 N 倍的高功率脉冲光激发实现,这对于实现超分辨率成像存在理论上的困境.为克服这个难题,本课题组提出基于上转换钕、镱和铥三种掺杂的上转换体系,实现了短波长激发的高阶非线性多光子发光.具体地,利用30W,730nm 连续光激发实现了超衍射极限的高阶非线性四光子(n=4)荧光成像,分辨率达到了 161nm.如同非线性效应可在二维上压缩点扩散函数,同样也可将该思路扩展至三维成像.Denkova 等64利用 980nm 激发实现了非线性四光子荧光,获得了三维高分辨成像.基于多光子激发的非线性可直接提高分辨率,是一个重要的、简单的超分辨成像方法,但是长久以来传统上转换非线性阶数并不高,一般多光子 n=45,进而无法实现 100nm 以内的超分辨成像.近期,Lee 等65在铥离子上转换体系中利用近红外 1064nm 激发实现了基于纳米光子雪崩效应,并据此实现了横向70nm 的超分辨成像.但该探针荧光辐射波长为 800nm,绝大部分探测器在此波段探测效率较低,不利于成像,此外,该体系雪崩荧光响应时间慢(608ms),难以应用于生物成像.同一时期,本课题组基于镱和镨两种掺杂离子实现了非线性阶数为 26 阶的光子雪崩非线性效应,实现了约62nm 的超分辨成像(图 5(e),(f),同时基于镱、镨和铥三种离子掺杂上转换体系提出了迁移光子雪崩概念,并结合能量传递及级联激发实现了光子雪崩效应放大,获得了超高 46 阶非线性成像,实现了多细胞视野的实用超分辨成像技术.非线性阶4035302520Energy/(103 cm-1)1510502F5/2975810810810595383455661650700106418001470475STED2F7/2Yb3+Tm3+CR2975 nmexcitationCrossrelaxation810 nmco-exc.810 nmdepletionEmissionCR1CR3CR43P23P13P01I61D21G43F23F33H43H53F43H6(a)2F5/22F7/23H63F41G41D21I63P28S7/24035302520Energy/(103 cm-1)15100975SMEDYb3+CR512455650475Tm3+Gd3+6P7/2Gd3+Surfacequenchers(c)2F5/23P13P01D21G43F3,43F23H63H53H41GSA 852GSA 852ESA 852609642525484231235647Photon avalancheCross-relaxation2F7/2Yb3+Pr3+252015Energy/(103 cm-1)1050(e)(b)(d)(f)500 nmCW 975 nm800 nmCW 975 nm2250 nmCW 975&730 nm2250 nmCW 975&730 nm800 nm15600 Count15100 Count15180 Count15100 Count100 nm1000975 nm975&810 nm5000/nm1.00.866 nm0.60.40.20Intensity/arb.units0.80.60.40.205016.7 nm40302010Photon counts0.80.60.40.20Distance/mm21 nm40 nm23.2 nm80100604020Photon counts200289 nm62 nm0-200/nm10Intensity/arb.units80400Frequerncy/mm-167 nm10FRC图5上转换超分辨成像技术示意图(a)交叉弛豫传能荧光损耗机制57;(b)上转换 STED 超分辨成像结果57;(c)表面迁移荧光损耗机制60;(d)SMED 超分辨成像结果60;(e)Yb3+/Pr3+共掺杂纳米颗粒的光子雪崩机制61;(f)光子雪崩超分辨成像结果61Fig.5.Schematicdiagramofup-conversionsuper-resolutionimagingtechnology:(a)Cross-relaxationenergytransferfluorescencelossmechanism57;(b)up-conversionSTEDsuper-resolutionimagingresults57;(c)surfacemigrationfluorescencelossmechanism60;(d)SMEDsuper-resolutionimagingresults60;(e)photonavalanchemechanismofYb3+/Pr3+co-dopednanoparticles61;(f)photonavalanchesuper-resolutionResolutionimagingresults61.物理学报ActaPhys.Sin.Vol.72,No.20(2023)204201204201-8数的大幅度提升使多光子成像成为突破衍射极限且分辨率可达 60nm 的超分辨成像技术,同时成像系统具有极为简便、激光光强要求极低的优势61.4.2 点扫描三维超分辨成像技术细胞结构的动态变化并不仅仅局限于二维层面,而是往往发生在三维层面.2000 年,Klar 等66提出了利用加载了 0/环形相位的损耗光对荧光进行受激辐射损耗,获得 6 倍的轴向分辨率提高,实现了轴向分辨率为 110nm.Harke 等67报道的3D-STED 技术可实现 xyz 三个维度上的超分辨.通过同时引入 02 涡旋相位(横向调制)以及 0/环形相位(轴向调制)两束损耗光,对荧光 PSF 进行三维受激辐射损耗,如图 6(a),(b)所示.3D-STED实现了横向 43nm 和轴向 125nm 的分辨率,如图 6(d)所示.为矫正成像像差,实现光束调制的灵活性,耶鲁大学科研团队提出利用两个空间光调制器分别替代 02 涡旋相位以及 0/环形相位板,实现了具有自适应光学(adaptiveoptics,AO)优化像差能力的 AO-3DSTED,获得了更高的成像质量,提高了 3DSTED 深度成像的能力68.为减少空间光调制器的使用,Lenz 等69更是通过巧妙的光路设计,仅利用一个 SLM 实现了 AO-3DSTED,如图 6(c)所示.尽管 3D-STED 能实现三维超分辨,但横向和轴向的分辨率通常相差 23 倍.为解决此难题,2008 年,S