海南花梨木dna条形码序列测定毕业论文.doc

毕 业 论 文（设计）

题 目：海南花梨木DNA条形码序列测定
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海南花梨木DNA条形码序列测定

摘 要
DNA条形码作为生命体所固有的遗传物质，客观存在于细胞内的物质，不受人为因素干扰，能准确的反映出物种最基本的信息。
为了验证国际生命条形码联盟推荐的MatK，trnH-psbA，ITS2三个候选条形码，在珍贵木材降香黄檀(Dalbergia odorifera T. Chen)又名花梨木DNA条形码测定中的有效性。从基地采摘的降香黄檀叶片中提取DNA，用特异性引物进行PCR扩增，得到三条候选条形码的目的片段，扩增成功的DNA片段可用于进一步测序分析。以PCR扩增成功率和测序成功率初步评价候选DNA条形码片段，评选出最优的条形码片段，为今后利用DNA条形码鉴定木材和构建木材分子条形码数据库提供理论依据。
实验结果：只有ITS2的条形码片段测序成功，得到对应的序列。通过NCBI查询黄檀属其他物种的ITS2序列，得到：降香黄檀的ITS2分子序列与黄檀属植物均不同，其中与越南黄檀差异最小，其次是多裂黄檀。多重比对后构建该序列的进化树结果说明降香黄檀与越南黄檀、多裂黄檀有着较近的亲缘关系，但又不属于同一植物类群，且三者有着稳定的遗传差异性。建议把ITS2序列作为鉴定降香黄檀的候选条形码序列。
关键词：降香黄檀；DNA条形码；ITS2；分子鉴定

I

I
降香黄檀DNA条形码序列测定
Abstract
DNA barcode as the genetic materialin life inherent that objectively existed in the cell, without artificial interference. It could accurately reflect the most essential information for species.
In order to verify three candidate barcodes of the MatK, trnH – psbA and ITS2 recommended by CBOL and the effectiveness in Dalbergia odorifera ’s DNA barcode. Extracted DNA of its leaves from the base,using specific primers for PCR amplication. The purpose of the three candidates from bar code fragments were obtained and the targeted segment was amplified successfully to be used for sequencing analysis. PCR amplification and sequencing success rate could be used for the preliminary evaluation the bar code fragments of candidate DNA ,Selected the best bar code fragment,which provided theoretical basis for using DNA identification of wood and wood construction molecule.
The results were as follows : only ITS2 coded fragment was successfully sequenced. and the corresponding sequence was gained. By searched ITS2 of other species which belong to Dalbergia from NCBI. We got the consion conclusion that: ITS2 of Dalbergia odorifera were different,with Dalbergia tonkinensis minimum, followed by Dalbergia rimosa Multiple comparison after building the sequence of the evolutionary tree result showed that Dalbergia odorifera Dalbergia tonkinensis and Dalbergia rimosa had the close relationship. Though they are not belong to the same group of plants, and they have a stable genetic diversity. So ITS2 sequence can be uesd to identified candidate barcode of Dalbergia.
Keywords:Dalbergia odorifera T.Chen; DNA barcoding; ITS2; molecular identification

14
降香黄檀DNA条形码序列测定
目 录
1 前言 1
1.1分子条形码序列测定及其在木材应用方面的研究进展 1
1.2研究的目的与意义 2
2 材料与方法 3
2.1材料 3
2.2试剂药品 3
2.3主要仪器设备 3
2.4 实验步骤 3
2.4.1条形码片段的 PCR 扩增 3
2.4.2 条形码片段的纯化与检测 5
2.4.3克隆 6
2.4.4 测序 7
3结果与分析 7
3.1条形码片段 PCR 扩增结果 7
3.2条形码片段测序结果 8
3.3序列分析 10
4结论与讨论 11
4.1结论 11
4.2讨论 11
致谢 13
参考文献 14

I

1 前言
降香黄檀(Dalbergia odorifera T. Chen.)又名花梨木为黄檀属植物,异花授粉，翅果，主要靠种子繁殖。以其枝干、根、心材干燥后入药，具行气活血、止血、止痢功效，是国家药典收载名贵南药之一。现代研究还发现降香黄檀具有抗氧化[1]、抑制中枢[2]等的作用[3]。降香黄檀心材极耐腐，切面光亮，且香气经久不灭，可用于高档家具、工艺品等。
野生的降香黄檀大多分布于我国海南省中部和南部，且多生于中海拔地区[4]，一般成片生长，形成了以降香黄檀为上层树种的植物群落类型[5]。品种的种质背景复杂和由各居群所处地理位置不同而产生的水热条件差异，都是降香黄檀具有丰富遗传多样性的影响因素。
降香黄檀生长较为缓慢，从种植到心材出现需要多年的时间，近年来其野生资源已遭毁灭性的破坏，濒于灭绝急需保护[6]。研究表明，降香黄檀表现较高的遗传多样性，且其适应环境能力强，因此导致其濒危的主要原因可能是其极高的药用价值和工艺价值越来越得到人们重视，导致用量急剧增大，人为乱采滥挖所至[7]。原有文献记载的有野生分布点区域，现已很难再找到该植物，比如2004年在三亚的南山附近零星有分布降香黄檀小树,到2006年时，该处已无降香黄檀。现在降香黄檀只有在少数的保护区有少量分布，及部分植物园引种、收集保存和农民种植所保留下来的，数量十分有限[8]。为保护降香黄檀种质资源和遗传多样性,不只需要宣传保护意识，还要大量地收集现有的降香黄檀种群的种质资源，并加强管理措施，保持其种群中丰富的遗传多样性。采取就地保护、繁殖，遗传性高且面积较小的群体[9]。相关的职能部门应加大对偷采滥伐的监管力度，尽量保护每株野生降香黄檀种质资源；全力开展对降香黄檀种质保存及扩大繁殖的研究,扩大居群规模；同时通过高新技术的应用，建立核心种质库的方式提高种质资源管理的质量和效率[10]。
1.1分子条形码序列测定及其在木材应用方面的研究进展
分子条形码作为生命体所固有的遗传物质，通过DNA水平鉴定技术已成熟地应用于动植物的鉴定[11-12]。作为客观存在于细胞内的物质，不受人为因素干扰，能更客观且准确的反映出物种的最基本信息[13]。
分子条形码技术的主要应用于筛选出适合的DNA片段，它的黄金时代开始于 2003年。现在已成立的生命条形码联盟CBOL，一个国际自发组织的联盟，在于支持 DNA 条形码的发展，旨在促进全球的标准化以及相应的 DNA 条形码研究。分子条形码技术研究的领域集中于针对具体的科属，针对性地筛选合适的 DNA 条形码。它利用一段标准的DNA片段区域作为物种标识，进而快速准确地进行物种鉴定[14]。理想的 DNA 条形码应当满足：有变异性、丰富的系统进化学信息、标准化、片段短、稳定易获取5个标准[15]。在查看参考文献后从众多研究成果中，选择matK，trnH-psbA，ITS2三条国际生命条形码联盟所推荐的候选片段应用于本次研究[19]。
matK片段长度约为1500bp，位于叶绿体基因内含子内，是叶绿体DNA编码区进化速度最快的片段之一，编码一种参与转录RNA内含子剪切的成熟酶 [20]。其在种内种间变异，种内种间差异较大可以作为所研究的天南星科、柑橘以及近缘植物、姜科砂仁属植物植物DNA条形码分类条形码[21]。
trnH-psbA片段长度为318-322bp，是叶绿体间隔区进化速度最快的片段之一。该片段在很多研究中表现出很好的物种鉴定效果比如洋金花及其混伪；也可以鉴定山麦冬及其近缘种；在桉属可用于潜在的条形码鉴定研究[22]。
ITS2片段长度为500-750bp,是核糖DNA的内转录间隔区，为主要应用于系统发生学标记的片段之一。由于该片段进化速度快，被很多的国内外学者所重视，协和医院陈士林科研组在研究了大量的植物样本后提议把ITS2片段作为药用植物DNA条形码[23]。科学家发现豆蔻属药用植物、葫芦科和景天属药用植物等等都发现ITS2序列可以作为所研究对象的DNA条形码[24]。如今ITS2序列已成立了独立的数据库，数据正不断地在扩充。根据其二级结构保守性，科学家可以通过软件预测出ITS2的二级结构，比较其结构的差异同样可以完成鉴定工作[25]。
1.2研究的目的与意义
降香黄檀野生资源已被大量破坏，濒临灭绝，但因其药用和商业价值很高[26]，所以部分不良商贩受利益驱使，用黄檀属其他树种冒充降香黄檀进行销售，因它们密度、材色以及构造与降香黄檀极非常相似[27]，专业技术人员用传统的识别方法很难鉴定，普通消费者更是无法区分和识别，这给消费者造成了巨大的经济损失，也给林业检查和海关人员的识别工作增加了难度[28]。
在本次研究中，为了验证国际生命条形码联盟推荐的MatK，trnH-psbA，ITS2三个候选条形码对降香黄檀分子条形码测定的有效性，用特异性引物对降香黄檀DNA进行PCR 扩增，扩增成功的DNA片段用于进一步测序分析，测序成功的条形码片段可用于降香黄檀的研究鉴定。以 PCR 扩增成功率和测序成功率初步评价候选 DNA 条形码片段，为今后利用 DNA 条形码鉴定木材和构建木材分子条形码数据库提供理论依据。
2 材料与方法
2.1材料
基地种植的降香黄檀，采摘树叶提取的DNA作为实验模板。
2.2试剂药品
琼脂糖，TAE，Goldview,TaKaRa Ex Taq，6×10 Loading Buffer，dNTP Mixture，灭菌ddH2O，AL2000 MarKer。
2.3主要仪器设备
电子天平；量筒；烧杯；PCR仪；凝胶成像系统；高速冷冻离心机；低温冰箱；移液枪（eppendprf：2.5µL；10µL；20µL；50µL；100µL）；移液管；微波炉；紫外分光光度计（NanoDrop ND-1000）；涡旋仪（IKA）；恒温摇床；电泳仪、电泳槽；恒温水浴锅；恒温培养箱；超净工作台；手掌型离心机。
2.4 实验步骤
2.4.1条形码片段的 PCR 扩增
（1）扩增引物
特异性的 PCR 扩增也同样要求引物的特异性，产物的特异性程度依赖于扩增引物和模板的互补程度。在本次研究中采用的引物长度为20至23，GC的含量为40%-60%，且没有连续排列的5个碱基[29]。引物名称和序列见表1。
表1 候选条形码片段的扩增引物
Table1. Primers for each candidate barcoding sequences amplification
扩增片段
Target segments
引物名称
Primer name
引物序列5’-3’
Primer sequence 5’-3’
MatK
M1
CGATCTATTCATTCAATATTTC(22)
M2
TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT(22)
trnH-psbA
T1
GTTATGCATGAACGTAATGCTC(22)
T2
CGCGCATGGTGGATTCACAATCC(23)
ITS2、
I1
ATGCCTCAATCCAGAGAGACCC(22)
I2
TAGCCCCGCCTGACCTGAG(19)
（2） PCR反应体系
采用25μL反应体系，各反应成分：0.12μL TaKaRa Ex Taq，2.5μL 6×10 Lodaing Buffer，2μL dNTP Mixture，1μL上游引物，1μL下游引物，1μL DNA模板，加入17μL灭菌ddH2O至总体系25μL。
（3）PCR反应条件

表2 候选条形码片段的PCR反应条件
Table2.PCR conditions for candidate barcoding sequences
扩增片段
PCR反应条件
MatK
94℃ 4min ，
94℃ 1 min，48℃ 1 min，72℃ 1 min，30 cycles
72℃ 7 min
trnH-psbA
94℃ 1 min，
94°C 1 min,61.1℃45s， 72℃ 1 min，30 cycles
72℃ 7 min
ITS2
94℃ 4 min
94℃ 1 min，56.4℃ 1 min，72℃ 1min，30 cycles
72℃ 7 min
配置25μL反应体系，用0.5%的琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA，左边第一孔用移液枪注入5μL AL2000做对照。取1μL 6×10 Lod aing Buffer，5μL样本DNA混合点样于胶孔中。设置电泳仪U=120V，I=220mA，25分钟后取出凝胶置于凝胶成像系统中紫外灯源下观察PCR产物条带。
2.4.2 条形码片段的纯化与检测
（1）条形码片段的纯化
采用天根柱式核酸纯化试剂盒纯化PCR产物（根据电泳检测结果灵活确定待纯化条形码片段的PCR量）。
①在紫外灯源下，用锋利的手术刀片将单一的目的条形码PCR产物条带切下，置于灭菌离心管中，并称重。
②取500μL平衡液BL活化CA2吸附柱。
③按所切下的产物凝胶质量，加入3倍体积溶胶液PN。
④50℃水浴10min，期间上下颠倒数次，确保胶块充分溶解。若依旧有未溶胶块，补加适量溶胶液或延长水浴时间，直至胶块完全溶解。
⑤待冷却至室温的胶块溶解液加入一个吸附柱 CA2 中，室温放置 2min，13000*g离心力离心45s，丢弃流出液。
⑥加入600μL漂洗液 PW 到吸附柱CA2中，13,000*g离心力离心1min。丢弃流出液，将吸附柱CA2放入收集管中。重复本操作一次。
⑦将吸附柱CA2放置收集管中，14000*g离心2min，除尽漂洗液。
⑧室温放置吸附柱CA25min，彻底地晾干，避免残留的漂洗液对下一步的实验造成影响。
⑨将吸附柱CA2置于一个干净离心管中，加入35μLddH2O(pH8.0)到吸附膜中间位置，室温放置2min。13000*g离心2 min收集DNA流出液。
⑩将离心所得溶液重新加回吸附柱中，室温放置 2min，13000*g 再次离心 2min，得到纯化后的条形码PCR产物。
（2）电泳检测纯化后的条形码PCR产物
用0.5%的琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的条形码PCR产物。取5μL AL2000做对照,取5μL纯化产物与1μL 6×10 Lodaing Buffer混合后，点样于凝胶孔中，设置电泳仪U=120V，I=220mA，25分钟后取出凝胶置于凝胶成像系统中紫外灯源下观察PCR产物条带。
2.4.3克隆
（1）纯化产物低温连接
于超净工作台上吸取4µL纯化后的条形码PCR产物、1µL T Vector和连接液SolutionⅠ至同一PCR管中，轻弹管壁，使各组混合均匀，用手掌型离心机快速离心，集中溶液，然后置PCR管于PCR仪上，16℃连接20min。反应结束后将离心管置于冰上。
（2）大肠杆菌转化
①在超净工作台上，取50µL感受态细胞并同时加入5µL连接产物(在感受态细胞刚刚解冻时加入链接产物)，轻弹混匀后于冰中30min；
②结束后，42℃水浴，热激30S，迅速再次冰浴2min；
③向混合液离心管中加入250µL灭菌LB培养基（不含氨苄青霉素），混合均匀后，于震荡培养箱37℃200转/min 震荡培养 1h，可使得大肠杆菌复苏；
④取 80µL 2mg/mlIPTG和40mg/mlX-gal混合，并均匀地涂布在准备好的平板上，在37℃培养箱中放置30min；
⑤待IPTG和X-gal被吸收后，取200µL菌液均匀地涂在平板上，在37℃培养箱中过夜培养（为得到更多的克隆，4000转/min离心1min,弃掉部分上清，保留100-150µL，轻弹悬浮菌液，取全部菌液涂板）。
（3）蓝白菌斑筛选
超净工作台上挑选白色单菌落，置于 LB 培养基中(含氨苄青霉素)，37℃恒温震荡培养 5-6h；鉴定阳性克隆需要以培养的菌液为模板，菌液 PCR 扩增目的条形码片段。PCR反应体系与反应以鉴定阳性克隆，PCR反应体系及条件与以叶片DNA PCR扩增目的片段体系条件一致。
2.4.4 测序
将鉴定转化后的菌液中的11, 22, 25, 30, 34, 40, 43共七个样品寄送深圳华大基因科技有限公司实验室测序，采用ABI 3730XL测序仪，采用正反双向测序确保测序结果的可信度，采用DNAStar Lasergene 6软件处理返回的序列，拼接和去引物。得到各样本的片段序列信息。
3结果与分析
3.1条形码片段 PCR 扩增结果
DNA条形码鉴定研究工作的核心在于筛选和鉴定，探索出合适的扩增引物，摸索建立起高效的扩增条件体系，然后评估对候选条形码序列的PCR扩增成功率，以及测序所得高质量的序列的测序成功率。这是对条形码片段的初步评估。扩增，测序成功率的高低直接影响了后续条形码序列分析。
通过实验得到三种引物PCR扩增结果如下图，matK片段的扩增成功率低，在凝胶成像图中找不到条带。trnH-psbA片段和ITS2片段，均有结果。而经过纯化后的产物凝胶显示ITS2的条带更为清晰。

图1. 三种引物的PCR扩增产物电泳分析
Figure1. Electrophoretic analysis of three kinds of primers for PCR products
M: DNA marker ( AL2000)
1-2: ITS2; 3-4: trnH-psbA,; 5-6: MatK

图2. PCR扩增产物纯化电泳分析
Figure2.Electrophoretic analysis of purified PCR products
M: DNA marker ( AL2000)
1-3 :ITS2; 4-6 :ITS2; 7-9: trnH-psbA
3.2条形码片段测序结果
将回收得到的trnH-psbA 片段、ITS2片段进行克隆，菌液PCR验证（图3），挑取检测效果较好的条带测序。
测序结果中:样品DNA的 trnH-psbA 片段均未得到对应序列，只得到ITS2序列长度为654bp如下：
ACCTGAGGTCGCGTCGTGGGCGATCGACATCGCTCGCGGGTCGCTGGGTACGGAGCTGGTGGAGGCCGCCCTCATGACTGGCCTCGAGAACACGCTCAACCACCGTCTGTCATGGCGCTGCATCCACCACGAACCCGATTTTCAGCCAGCCGCGAGGCGGTGCTCACGGGAGGCCAGCATTCGCCCCGCTCCGTGGCCGGAGGCACAGGGGTTGGGGCGGCGATTGGTGACACCCAGGCAGGCGTGCCCTTGGCCTAGTGGCTTCGGGCGCAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCGCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCGAGATATCCGTTGCCGAGAGTCGTTTTGGACTCGAGTGTTGCGACGTCGCCCGTGCGAGCACCGTTTCCGGGCCGACGGGACGCGCTCTGCGATTGTTGATTCCTTGGCGCTTTCCGCGCCGGGGTTTGTTGGTTGTTTCGCCGGGACGAGAGGCCGCGGGGCGCGGCTCCGTCCCGACTTTGAGGGAAGGCGAGCTGCTGGGCAGCTTCGTCTGTCCCGGGTGTTGAAACGTGTCCGCGGGTCTCTCTGGATTGAGGCATAAGGGCAATTCTGCAGATATCCATCACACTGG

图3克隆菌液PCR产物电泳检测
Figure3. Electrophoretic analysis of PCR products of cloning escherichia coli
M: DNA marker ( AL2000)
ITS2: 1-38 ; trnH-psbA: 39-48
3.3序列分析
根据 NCBI中已登录的黄檀属分子的ITS2序列，用DNAMAN做比对。样品ITS2分子序列黄檀属其他植物均不同，其中与越南黄檀差异最小有8个位点碱基不同，其次是多裂黄檀有15个碱基不同。
表1.降香黄檀、越南黄檀和多裂黄檀的特异性鉴别位点
Table 1 Identification sites of Dalbergia odorifera T. Chen, Dalbergia tonkinensis and Dalbergia rimosa Roxb in different origin sites
N0.
位点
32
70
78
345
406
435
441
530
597
635
636
637
638
639
642
645
样品
C
G
T
A
G
T
C
G
G
G
G
G
C
A
T
G
越南黄檀
C
T
T
A
G
T
C
G
G
C
A
A
T
G
C
T
多裂黄檀
T
G
G
G
T
G
T
C
A
C
A
A
T
G
C
T

通过NCBI中已登录的黄檀属其他13个树种和国槐属植物国槐的ITS2序列，所得序列进行多重比对后采用邻接(NJ)法构建系统进化树(见图4)。结果显示，外类群槐属植物的国槐单独聚为一枝，与传统分类结果相一致。系统发育树结果说明降香黄檀与越南黄檀有着较近的亲缘关系其次才是多裂黄檀，但它们又不属同一植物类群，且三者有着稳定的遗传差异性。
图4 降香黄檀ITS2 序列与其他物种该序列的进化树分析
Figure4.Phylogeny tree obtained by method based on the ITS sequnence

4结论与讨论
4.1结论
实验结果表明降香黄檀DNA片段，用三种特异性引物扩增MatK，trnH-psbA，ITS2片段，其中trnH-psbA，ITS2均有扩增产物但只有ITS2通过 PCR 扩增成功，且扩增成功的 DNA 片段可用于测序分析，对降香黄檀分子条形码测定的有效性最高。
通过NCBI查询降香黄檀ITS2序列和其他黄檀属植物不同，其中与越南黄檀差异最小其次是多裂黄檀，多重比对后构建降香黄檀、越南黄檀和多裂黄檀的系统发育树显示了三者有相当近的亲缘关系又不属于同一物种。建议把ITS2作为鉴定降香黄檀的候选片段。
4.2讨论
随着社会的不断进步和经济的高速发展，人们对木质材料，特别是高档木材制品的需求日益增加，出现了大量的非法采伐和过度采伐的现象。同时由于高档珍稀木材与普通木材在价格上有着大较的差异，在经济利益的驱使下，高档木制品市场上出现了大量的假冒伪劣产品，给消费者造成了非常大的经济损失。因此，为维护消费者合法利益，规范木材贸易市场，以及保护生态环境，对木材进行快速、准确、科学的识别鉴定就显得十分重要和迫切。
本研究以基地种植的降香黄檀（Dalbergia odorifera T.Chen）为研究对象，通过叶片DNA提取、纯化和ITS序列测序，从而揭示降香黄檀和越南黄檀、多裂黄檀DNA序列之间的差异，为降香黄檀木材种属鉴定提供可靠的分子标记依据。
本研究中有一些后续仍需要改进的地方，比如：运用了较为易于提取DNA的叶片，可以为苗木鉴定提供可行的检测手段，但在实际应用中市场上辨别木材是很难找到对应的叶片用于检测，而木材DNA的提取与扩增相对于叶片比较困难。
致谢
岁月如梭，如歌。转眼间，大学四年美好的学习时光已接近尾声。感谢一直在身边陪伴着我，呵护我成长的父母；衷心的感激这些年来对我悉心教导，诲人不倦的老师们；感谢在学习中给予我支持与帮助的同学；感谢在四年宿舍生活中，包容我，鼓励我的舍友们。感谢这一路走来都有你们，能让我能在遇到困难的时候，有勇气克服困难，爬起来继续往前走。
毕业论文得以顺利完成，我要衷心的感谢W老师，感谢老师在在繁忙的授课与科研中抽出时间给予耐心的教导和帮助。此外我还要感谢实验室的师兄师姐，特别是L师姐对我耐心的帮助，悉心的指导。在此我还要感谢和我一起做《降香黄檀分子条码确定》的M同学花了一个暑假的时间提出了降香黄檀的DNA。谢谢你们。我知道明天有风雨也有彩虹，我有勇气、自信和能力经历风雨迎接彩虹，不辜朋友，老师和家人的期望！
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