DB34∕T 3487-2019 水稻品种选育花药培养快速纯合技术(安徽省).pdf

TCS 65.020.99 B 05 DB34.l-.文徽省山巳ET且，万标准DB 34/T 3487-2019 水稻品种选育花药培养快速纯合技术Rapid homozygous technique of anther culture for rice variety selection 2019-12-25发布2020-01-25实施安徽省市场监督管理局发布目IJ1=1 本标准按照四月1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省质量和标准化研究院提出O本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。DB34/T 3487-2019 本标准起草单位:合肥丰乐种业股份有限公司、安徽省农业科学院水稻研究所。本标准主要起草人:徐丽暖、吴晓亮、周桂林、冯睿熙、丛夕汉、周贤达、黄书伟、范家萌、周红英、董伟、徐四静、夏泽静、徐晓莉、胡娜、高守宜、王笑见、i罩娟、王兆贤、王浩波。DB34/T 3487-2019 水稻品种选育花药培养快速纯合技术1 范围本标准规定了水稻品种选育花药培养快速纯合技术的术语和定义、培养流程及操作程序。本标准适用于水稻(柏稻、梗稻、柏相交)杂合世代材料的快速纯合选育。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，叉所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求NY/T 2306 花卉种苗组培快繁技术规程3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 水稻花药培养快速纯合技术Rapid homozygous technique of Rice Anther Culture 利用植物细胞全能性，对单核靠边期的水稻花药进行培养，通过适宜的愈伤诱导、分化、生根培养基培养成苗，并自然加倍成为纯合二倍体植株，快速得到纯合水稻单株，提高育种效率。4 技术流程图见图10l1tg ILF副培养基5 培养条件7T嘻l川，岛白二，iLZE二画出培养基图1流程图水稻花药培养各阶段培养条件见表10最:民鉴与纯系利用DB34/T 3487-2019 表1水稻花药培养各阶段培养条件培养阶段温度j显度光强光照时间CC)(%)(lux)(h/d)愈伤诱导(暗培养)25士150-60 O O 分化、生根(光培养)28士155-65 1500-3000 14 6 培养基组分用量及配制方法6.1 培养基组分用量水稻花药培养各阶段使用培养基组分及用量见表20表2培养基组分及用量试剂名称用量(mg/U诱导愈伤培养基分化培养基生根培养基(NH,),SO,201 NH.1No.,16.50.825 KNo.,2320.190.0.950.CaCL 0 2H,o.166 440 220 MgSO生o7H,O 255 370 185 KH,PO,700 170 85 FeSO,o7H,O 42 27.8 27.8 Na,oEDTA 62 37.2 37.3 MnSo.104H二。12 22.3 11.15 ZnSo.107H二。3 8.6 4.3 HJBo.2 6.2 6.2 3.1 K1 0.83 0.83 0.415 Na2Mol0 2H2o.0.25 0.25 O.25 CuSo.,o5H2o.O.025 0.02.5 O.025 CoCLo6H2o.O.025 0.02.5 O.025 甘氨酸5.0 2.0 盐酸硫肢素B12 O.1 O.1 盐酸口比哆醇B61 O.5 O.5 烟酸1.5 O.5 O.5 肌醇100 100 2,4-D 2.0 KT 1.0 2.0 NAA 2.0 O.5 O.25 E?，糖60000 30000 30000 琼脂粉6000 6000 5000 pH 5.8 5.8 5.8 注一表示不需要添加。2 DB34/T 3487-2019 6.2 配制及分装6.2.1 使用去离子水洛解震、糖，按表2培养基组分用量要求依次加入相关试剂，待培养基内所有组分充分溶解后，使用容量瓶定容，井用pH计测试pH值并调节至5.8，最后加入琼脂粉，整个过程持续进行磁力搅拌。6.2.2 将搅拌好的培养基分装在培养瓶内封口后进行高压蒸汽灭菌，诱导愈伤培养基在100m1培养瓶内分装25m!，分化培养基在100m1培养瓶内分装50 m1，生根培养基在3cm直径试管内分装256.2.3 灭菌应符合NY/T2306的规定。6.3 培养基的存放6.3.1 灭菌结束后，将培养基放在无菌室内进行冷却，冷却后标明培养基的配制日期，按培养基类型和配制时间依次放好O6.3.2 灭菌后的培养基在培养室放置3d，观察无污染现象再使用，每次配制的培养基需在14d内用完。7 材料选择及处理7.1 培养材料的选择7.1.1 田间取材使用显微镜镜检所需水稻花药材料，显示花粉母细胞处于单核靠边期方可进行培养。外观观察以稻苞抽出叶枕距长短进行取材。7.1.2 不同类型水稻长短不同，例如一季稻，柏稻在稻苞抽出叶枕距15cm左右，梗稻在12cm左右，革山梗交材料在12cm15 cm之间。7.2 取材时间取材时间一般在晴天上午9:0012:00之间，可根据当天天气情况和材料类型调整时间。7.3 预处理首先登记所取稻苞品种信息、编号，其次对稻苞进行表面清洁，最后使用湿纱布包好按顺序放在冰箱内进行低温预处理，预处理温度610C，处理时间为710do 7.4 幼穗灭菌从完成预处理的稻苞中取出幼穗，直接将幼穗放入有盖容器中，倒入75%酒精浸没幼穗，静置305后将酒精倾去，继续使用浓度为0.1%的升示浸没幼穗，静置10min后取出，使用无菌水冲洗3次，幼穗转移无菌干燥瓶内。7.5 实验室生物安全应按照GB19489的规定执行。8 培养流程8.1 花药转接方法及每瓶转接量3 DB34/T 3487-2019 8.1.1 转接过程在无菌操作台上进行，每个培养瓶内转接lOO150枚花药，转接后标明转接日期和材料编号。柏稻花药转接流程:使用慑于将水稻颖壳分开，夹取花药直接放入诱导培养基上。一一根稻花药转接流程:距颖壳基部1/5位置处剪断，用慑于夹住颖壳，将花药倒入诱导培养基上。8.1.2 柑桔交材料按照材料偏制或者偏梗情况从上述两种方法中选择一种进行操作。8.2 愈伤组织培养将接好花药的培养瓶放在暗培养室内进行培养，静置培养至愈伤组织生长为直径3mm以上。8.3 分化培养在无菌操作台上将直径3mm以上愈伤组织挑取至分化培养基内，每个培养瓶内转接45枚愈伤组织。瓶身标明材料编号，放入光照培养室内进行分化培养。8.4 生根培养使用慑子将分化至5cm以上的无根幼苗转接至生根培养基，每个试管中转接I株幼苗，瓶身标明材料编号，放入光照培养室进行生根培养。8.5 炼苗将主根长至2cm以上的幼苗从培养基中取出洗净，将幼苗放入含营养土的营养钵中，自然阴凉环境炼茵2周，按需补充水分，至幼苗长出新的根系O9 移栽筛选9.1 移栽过程按照正常水稻幼苗田间移栽方法进行，田间花培苗抽穗期进行单穗套袋白交，长至成熟期进行筛选。9.2 对长势、结实正常单株继续利用，淘汰结实差，畸形槽，矮化株，不育等类型的单株。10 倍性鉴定与纯系利用10.1 经过田间筛选得到的花药培养种子进行单穗收获。10.2 第二代材料穗行种植，通过显做镜鉴定材料倍性，选择正常二倍体材料，并根据田间表现对可用穗行进行扩繁利用。4