DB64_T 1682-2019 包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测方法(宁夏回族自治区).pdf

ICS 67.050 X04 宁夏回族自治区地方标准DB64/T 1682-2019 包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测方法li-1 2019-12-18发布2020-03-17实施宁夏回族自治区市场监督管理厅发布DB64/T 1682-2019 本标准是按照GB/T1.1-2009 标准化工作导则第1部分:标准的结构和编写给出的规则编写。本标准由宁夏回族自治区食品检测研究院提出。本标准由宁夏回族自治区市场监督管理厅归口并组织实施。本标准起草单位:宁夏回族自治区食品检测研究院、宁夏回族自治区食品药品审评查验中心。本标准主要起草人:邓军、高俊峰、夏莉娟飞冯秀娟、赵艳、李雯、董川I0 目IJ11刊号LHEt-zhra巳卜，unANU叫纠纠刃A司叫日出明nuMUU叫问时目问门23月svuau句，叫吐吐吼叫4日U川口川41口叫Nrt川同叫引川川口;2uh闪hUU叫h门口U叫川h-n川-J到叶川川-u斗ali-门，hic-u川ih-i川江川川。可叫句:.6ref-川勺lt|I 胃口门川川寸，iiuu川叫民1，DB64/T 1682-2019 包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测方法范围本标准规定了包装饮用水、饮用天然矿泉水中铜绿假单胞菌检测的环介导恒温核酸扩增(LAMP)的方法。本标准适用于包装饮用水、饮用天然矿泉水中铜绿假单胞菌的定性检测。规范性引用文件2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB 8538-2016食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测缩略语3 DNA(deoxyribonuclelc add):脱氧核糖核酸。dNP(deoxyribonucleoside triphosphate):脱氧核昔三磷酸。LAl在P(loop-mediated isothennal alnplification):环介导恒温扩增。OprL:编码OprL蛋白(肤聚糖相关外膜脂蛋白)的基因。TritonX-100:聚乙二醇辛基苯基醋。-at-J-fh对川叶也-FauufA!WEt!ZEE-)5=52、?NeZEM-uut2225PEt-.，MM-feKE-JJe刀川叫以川日MH叫斗mmrg材UHF扩inhhLHE-妇钊叫nUUUHMHh问nn口-A叮uChr-4dN3h14lu-F，.，rtuhr:巳川川&!生物安全措施4 按照GB19489中的有关规定执行。防污染措施5 防止污染措施应符合GB/T27403的规定。原理6 根据铜绿假单胞菌特异OprL基因序列参见附录A)设计的两对特殊的内、外引物及一对环状引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，利用BstDNA聚合酶启动循环链置换反应。BstDNA聚合酶具有强链置换能力，能在630C这一恒温条件下实现对目标基因的扩增，在铜绿假单胞菌OprL特异基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成很多类似花椰菜结构的茎环DNA混合物。1 D864/T 1682-2019 当发生扩增反应时，反应体系中添加的染色剂(SYBR Green 1)能以嵌入方式结合到扩增出来的DNA混合物小沟处，随着双链DNA的增加，SYBR Green 1染料荧光信号随之增强，通过荧光定量PCR仪实时监测产物扩增情况，从而达到检测目的基因是否得到扩增。根据Ct值以及是否有S型扩增曲线判定结果o7 试剂与材料7.1 引物外引物扩增片段长度:269bp 外引物1(F3,5-3):GCGTTGCCGCCAACAATG 外引物2(B3,5-3):CATGCGGGCAACCTCTC 内引物1(FIP,5-3):GTTGTCACCCCACCTCCGGGCGGCAACGTTCCTCC 内引物2(BIP,5-3):CTCCGTGCAGGGCGAACTGCAGGCGAGCCAACTC 环状上游引物(LF，5-3):ACCTGCCGTGCCATACC 环状下游引物(LB，5):GTTCATGCAGCTCCAGCAG 7.2 试剂材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯;实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。一一脑心浸液肉汤(BHI);一-DNA提取试剂:细菌基因组DNA提取试剂盒:一-BstDNA聚合酶:酶浓度8U/L;一-dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP，每种核昔酸浓度10mmol/L;一-10 xThermoPol缓冲液含:0.2 mol/L Tris HCl,0.1 mol/L氯化饵，0.1 mollL硫酸馁，20 mol/L 硫酸馍，1%TritonX-100;一一硫酸镇:50 rnmol/L;一一甜菜碱:51noVL;一一显色液:SYBR Green 1荧光染料，0.01 mM;一一阳性对照:铜绿假单胞菌标准菌株或等效标准菌株;一一无菌玻璃器皿(90mm培养皿、500mL三角瓶、1rnL移液管、涂布棒);一-1000mL无菌均质袋;一-1.5mL塑料离心管，200LPCR反应管:一一也可采用等效的铜绿假单胞菌LAl1P检测试剂盒，具体操作按照试剂盒说明书进行操作，有关试剂盒的相关要求参见附录Bo8 仪器与设备2 仪器与设备包括:一一恒温培养箱:360C土1:一一移液器:量程0.5，L-10，L;量程10，L-100L;量程100，Lr-1000.L;一一高速台式离心机:二三13000r;一一金属浴:1000C土lDC:一一计时器:回寸3口叫1才Jl-1门叫i川叫吁JDB64/T 1682-2019 一一荧光定量PCR仪。9 检测程序铜绿假单胞菌检测程序见图10水样取250mL水样过滤分别将滤膜移放在CN平板和假单胞显色平板上360C士lOC24 h-48 h 挑取培养后的可疑菌落提取DNALAMP反应结果观察生ESt,阴报告图1铜绿假单胞菌检测程序10 操作步骤iali-4.10.1 样品制备与增菌培养按照GB8538-2016中57进行样品制备和培养。铜绿假单胞菌标准菌株直接接种到BHI培养基，360C土10C培养18h24 h，做阳性对照。10.2 模板DNA的制备|-4伽3 DB64/T 1682二201910.2.1 标准菌株增菌液模板DNA的制备直接取增菌液100L加到1.5mL无菌离心管中，涡旋震荡混匀，1000C土lOC条件下热浴5min-10 min,3000 r离心3min，上清液即为模板DNAo若不能当天检测，吸取上清液于无菌离心管中，置-20oC以下保存备用o也可用细菌基因组提取试剂盒提取细菌DNA，按照说明书进行操作。10.2.2 可疑菌落DNA的制备用1L接种环挑取Baird-Parker琼脂平板上的可疑菌落，悬浮在100L0.85%灭菌生理盐水中，充分打散制成菌悬液，之后按10.2.1步骤进行操作。10.3 环介导恒温核酸扩增10.3.1 扩增试剂准备在试剂配制区进行，在低温条件下进行体系配制。每个样品测试反应体系配制见表2(25L反应体系):表1铜绿假单胞菌反应体系组份工作液浓度加样量(L)ThermoPol缓冲液10 x 2.5 外引物1(F3)20rnrnollL 0.25 外引物2(B3)20mmollL 0.25 内引物1(FIP)20 rnrnol/L 1.0 内引物2(BIP)20rnrnol/L 1.0 环状上游引物(LF)20mmollL 0.5 环状下游引物(LB)20mmol/L 0.5 dNTPs 10mmollL 4.0 硫酸侯50mmol/L 1.0 甜菜碱5rnrno1/L 4.0 BstDNA聚合酶8 U/L 0.5 显色液0.01 mM 0.5 DNA模板2 去离子水7 10.3.2 加样在样品制备区进行。反应体系终浓度1x 0.2mmol/L 0.2mmol/L 0.8mmol/L 0.8nnnoL 0.4mmollL 0.4mmol/L 1.6mmollL 2.0mmollL 0.8mmol/L 0.16 U/L 在各设定的PCR反应管中分别加入制备好的模板DNA溶液2阵，盖紧管，离心5s-10 So 10.3.3 反应过程在扩增区进行。将10.3.2中离心后的PCR反应管放入荧光定量PCR检测系统内，记录样本摆放顺序。630C恒温扩增451nin，反应程序为:63 oC 15 s,63 oC 45 s作为一个循环，每个循环从16sr-.-60 s收集荧光信号，总计45个循环。检测结束后，根据扩增曲线和起峰时间判定结果。4 D864/T 1682-2019 空白对照、阴性对照、阳性对照设置10.3.4 每次扩增反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。空白对照以灭菌水替代DNA模板。阴性对照以提取非目标菌DNA代替模板DNAo阳性对照制备:按10.1、10.2.1步骤进行操作。，质量控制10.3.5 以下条件有一条不满足时，实验视为无效:a)空白对照:曲线为直线，无S型扩增曲线:b)阴性对照:由线为直线或轻微斜线，无S型扩增曲线;c)阳性对照:呈s型扩增曲线。结果与表述结果的判定10.4 空白对照、阴性对照以及阳性对照实验结果正常。待检样品若有s型扩增曲线，则判断样品检测结果为阳性:若无s型扩增曲线，或呈一条直线或倾斜的直线，且检测出峰时间为0，判断样品检测结果为阴性G结果的表述结果表述为:250 mL样品中检出或未检出铜绿假单胞菌。10.5 废弃物处理1 1 检测过程中的废弃物，收集后经紫外照射30min，高压灭菌，1210C,30 mino l寸1，.，二,LJJJJJJl汀JffdL1习叫斗J413叶咱川，q.，.J1lll-5 D864/T 1682一-2019附录A资料性附录铜绿假单胞菌Opr基因特异序列A.1 铜绿假单胞菌OprL基因序列CAccessionl1o.GU198148)6 1 atggaaatgc tgaarttygg taaatttgct gcgctggctc tggccatggc tgtagctgta 61 ggttgctcgt ccaaaggcgg cgacaacgcc ggtgaaggtg ctgttgatcc aaacgctggt 121 tacggcgcaa acactggtgc ag仕gacggctccctgagcg aagaagctgc tctgcgcgca 181 atcaccacct tctacttcga atacgacagc tcggacctga agccagaagc catgcgcgct 241 ctggacgttc acgccaagga cctgaaagcc aacggcaacC gcgttaccct ggaaggcaac 301 accgacgaac gtggtactcg tgagtacaac atggctctgg gcgagcgtcg tgcgaaagcc 361 gttcagcgct acctggtact gcaaggtgtt tccccagctc agctggaact ggtttcctac 421 ggcgaagagc gtccagttgc taccggcaac gacgancagt cntgggctca 同PJrruJJUn附UD864/T 1682-2019 附录B资料性附录)铜绿假单胞菌LAIvIP检测试剂盒试剂盒组成B.1 每个试剂盒可做24个反应(25L/反应)，包括表B.l的成分:试剂盒成分和规格表B.l组份名称规格x数量反应液550Lxl支BstDNA聚合酶30Lxl支密封液500Lxl支阳性对照20Lxl支阴性对照20Lxl支说明8.2 试剂盒需于一200C以下保存。反应液中含有反应所需dNTP混合液、引物、缓冲液、核酸染料等，反应液应避光保存。功能8.3 本试剂盒可用于铜绿假单胞菌的鉴定o使用时的注意事项B.4 请严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰上操作。反应液中的成分对光敏感，应避光保存。反复冻融可能降低试剂盒灵敏度，请按检测频次将反应液以适当体积分管保存o7 川HM引川叮罚叫叫叫到叫MVEZEP-dEld-MJMFV-E-2，vJJdJJJJJJJJPJJJJ-22424、12，api-JJJ-Ed卫叫叶，叫叮吁叮叮叫司叫卫习11叫叫司司司叫叫42川汀町叫11J叶司司4245avfizz-a川才才du121叫dfrFEJ，川A4J44d引TFJMi-dhhahM叫TV41hub44卢川hhL卜r.t4.川川aJJiJlllH川Hr-a