染色体显微操作技术.ppt

染色体显微切割染色体显微切割引言：引言：在大部分人类肿瘤和某些特定人类遗传病在大部分人类肿瘤和某些特定人类遗传病中存在染色体重排。肿瘤特定的染色体异常会中存在染色体重排。肿瘤特定的染色体异常会导致原癌基因产物的激活、肿瘤特异融合蛋白导致原癌基因产物的激活、肿瘤特异融合蛋白的产生或肿瘤抑制基因的失活。的产生或肿瘤抑制基因的失活。一个癌细胞的染色体共一个癌细胞的染色体共104条，包括许多异常的染色体条，包括许多异常的染色体 Ph染色体示染色体示9；22易位易位（9q34;22q11）;fi 22q-;示示9+Burkitt淋巴瘤的淋巴瘤的14q+染色体染色体8q24;14q32易位易位 一些肿瘤常见的染色体异常一些肿瘤常见的染色体异常病名病名染色体异常染色体异常慢性粒慢性粒细胞白血病胞白血病 Burkitt淋巴瘤淋巴瘤急性非淋巴急性非淋巴细胞白血病胞白血病慢性淋巴慢性淋巴细胞白血病胞白血病急性淋巴急性淋巴细胞白血病胞白血病恶性淋巴瘤性淋巴瘤小小细胞肺癌胞肺癌卵巢乳卵巢乳头状腺癌状腺癌神神经母母细胞瘤胞瘤脑膜瘤膜瘤Wilms瘤瘤睾丸癌睾丸癌畸胎瘤畸胎瘤Ph,即即t(9;22)t(8;14),t(2;8),t(8;22)+8;7q,5q或或-5t(8;21),t(15;17),t(9;22)；t(11;14),+12t(?;11),t(1;9),t(7;12),t(9;14)t(8;14),t(4;11),+21t(4;11),+1214q+,+12del(3)(p14-23)t(6;14)del或或t(1;?)(p 32-36;?)13q-22,22q11p1(12p)1(12p)染色体显带技术的建立，肿瘤非随机性染染色体显带技术的建立，肿瘤非随机性染色体异常的细胞遗传学分析已成为许多人类肿色体异常的细胞遗传学分析已成为许多人类肿瘤诊断和预后不可或缺的指标，但常规显带染瘤诊断和预后不可或缺的指标，但常规显带染色体分析不能确定所有的细胞遗传学染色体重色体分析不能确定所有的细胞遗传学染色体重排。排。该技术的局限性阻碍了许多人类肿瘤，该技术的局限性阻碍了许多人类肿瘤，尤其是实体瘤核型的确定，但这种情况已被尤其是实体瘤核型的确定，但这种情况已被染色体显微切割和染色体显微切割和FISH技术所弥补。染色体技术所弥补。染色体显微切割已经成为由细胞遗传学分析快速过显微切割已经成为由细胞遗传学分析快速过渡到分子检测的有力工具。渡到分子检测的有力工具。细胞核移植技术：细胞核移植技术：就是将供体细胞核移入除去核的就是将供体细胞核移入除去核的卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无卵母细胞中，使后者不经过精子穿透等有性过程即无性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供性繁殖即可被激活、分裂并发育成新个体，使得核供体的基因得到完全复制。以供体核的来源不同可分为体的基因得到完全复制。以供体核的来源不同可分为胚细胞核移植与体细胞核移植两种。胚细胞核移植与体细胞核移植两种。1 切开卵母细胞透切开卵母细胞透明带明带2 挤出卵母细胞细挤出卵母细胞细胞核胞核3 注入供体细胞核注入供体细胞核4 电融合仪融合电融合仪融合5培养培养12345显微操作仪显微操作仪嵌合体技术嵌合体技术嵌合体嵌合体 (chimera)(chimera)一词源于古希腊神话，一词源于古希腊神话，其意是指狮头、羊身、龙尾等部分拼凑起其意是指狮头、羊身、龙尾等部分拼凑起来的怪兽。来的怪兽。嵌合在生物学上是指同一个体中，基因型嵌合在生物学上是指同一个体中，基因型相异的细胞或组织混合存在的状态。相异的细胞或组织混合存在的状态。现代的胚胎工程技术中，也有一种叫胚胎嵌合的技现代的胚胎工程技术中，也有一种叫胚胎嵌合的技术。它是将个胚胎细胞（同种或异种动物胚胎）术。它是将个胚胎细胞（同种或异种动物胚胎）合并，共同发育成个胚胎，即合并，共同发育成个胚胎，即“嵌合胚胎嵌合胚胎”，然，然后将这个胚胎移植给受体，让其妊娠产仔。如果产后将这个胚胎移植给受体，让其妊娠产仔。如果产下来的幼仔具有以上种动物胚胎的细胞，则称其下来的幼仔具有以上种动物胚胎的细胞，则称其为为“嵌合体动物嵌合体动物”。例如，用同一种类的黑鼠和白鼠胚胎嵌合，可生下例如，用同一种类的黑鼠和白鼠胚胎嵌合，可生下黑白相间的花小鼠黑白相间的花小鼠；不同种类的；不同种类的绵羊和山羊胚胎细绵羊和山羊胚胎细胞嵌合，可生下绵山羊，它既有绵羊的特征，又有胞嵌合，可生下绵山羊，它既有绵羊的特征，又有山羊的特征。山羊的特征。1 1 囊胚显微注射法：囊胚显微注射法：用显微操作技术将供胚的全用显微操作技术将供胚的全部内细胞团注入除去部分内部内细胞团注入除去部分内细胞团的受胚囊胚腔中，或细胞团的受胚囊胚腔中，或将供胚的部分内细胞团注入将供胚的部分内细胞团注入受胚的受胚的囊胚腔囊胚腔中，也可以向中，也可以向受胚囊胚腔中（或卵周间隙）受胚囊胚腔中（或卵周间隙）注入注入1616细胞至桑甚胚的卵裂细胞至桑甚胚的卵裂球、胚胎干细胞或已分化的球、胚胎干细胞或已分化的细胞，使其发育为嵌合胚胎细胞，使其发育为嵌合胚胎的方法即为囊胚注入法的方法即为囊胚注入法。2.2.聚合法聚合法是指将是指将去除透明带的两枚去除透明带的两枚8 8细胞至桑葚期胚胎，细胞至桑葚期胚胎，或来自两个不同胚胎的卵裂球，或卵裂球与胚或来自两个不同胚胎的卵裂球，或卵裂球与胚胎聚合胎聚合在一起的方法。在一起的方法。胚胎移植胚胎移植1.1.概念概念:将雌性动物的早期胚胎将雌性动物的早期胚胎,或者通过其或者通过其他方式得到的胚胎他方式得到的胚胎,移植到同种的移植到同种的.生理状生理状态相同的其他雌性动物的体内态相同的其他雌性动物的体内,使之发育为使之发育为新个体的技术新个体的技术.供体：提供胚胎的个体。供体：提供胚胎的个体。受体：接受胚胎的个体。受体：接受胚胎的个体。染色体显微切割分染色体显微切割分手工切割手工切割和和激光切割激光切割法，倒置显微镜上装配切割臂，安上硅化玻法，倒置显微镜上装配切割臂，安上硅化玻璃针，找到分散良好的分裂相来切割所需染璃针，找到分散良好的分裂相来切割所需染色体片段。色体片段。显显微微切切割割图图例例1.染色体显微切割技术的发展染色体显微切割技术的发展 染色体显微切割最早起源于从一个特定的染色体染色体显微切割最早起源于从一个特定的染色体区域分离出区域分离出DNA标记，并首先成功地应用于果蝇多线标记，并首先成功地应用于果蝇多线染色体和小鼠染色体的研究。染色体和小鼠染色体的研究。1981年，德国的欧洲分子生物学实验室年，德国的欧洲分子生物学实验室（EMBL）Scalenghe等切割了果蝇唾液腺多线期等切割了果蝇唾液腺多线期X染色体第染色体第3段的几个片段，通过蛋白酶消化、酚抽提、段的几个片段，通过蛋白酶消化、酚抽提、EcoR I酶切进行重组克隆。酶切进行重组克隆。多线染色体：多线染色体：1984年染色体显微切割应用小鼠；年染色体显微切割应用小鼠；1986年年Bates等切割了人的等切割了人的2号染色体短臂。号染色体短臂。但当时由于所切割的染色体但当时由于所切割的染色体DNA量少，通常要切割量少，通常要切割上百条染色体，且其文库也只含几百个微克隆。上百条染色体，且其文库也只含几百个微克隆。由于无法直接扩增染色体由于无法直接扩增染色体DNA，所以必须在显，所以必须在显微镜下反复切割若干拷贝的染色体，才能满足实微镜下反复切割若干拷贝的染色体，才能满足实验的要求这不仅费力耗时，而且要求实验操作人验的要求这不仅费力耗时，而且要求实验操作人员必须具备熟练的染色体分带和鉴定经验，才保员必须具备熟练的染色体分带和鉴定经验，才保证实验的准确性。证实验的准确性。显微切割技术的突破在于它与显微切割技术的突破在于它与PCR的的结合，结合，1989年年Ludecke等切割了人类等切割了人类G显带显带染色体，结合染色体，结合PCR技术进行体外扩增，使技术进行体外扩增，使其工作量大大减小。其工作量大大减小。对于同一条染色体，只要切割和收集对于同一条染色体，只要切割和收集5 10个拷贝，通过个拷贝，通过PCR扩增，即可满足实验要扩增，即可满足实验要求。从而极大地提高了实验技术的可行性和求。从而极大地提高了实验技术的可行性和准确性。准确性。在在1989年，年，Ludecke等建立了一个显著提高克等建立了一个显著提高克隆效率的方法。隆效率的方法。该方法首先用该方法首先用Rsa I酶切显微切割的酶切显微切割的DNA，连接，连接到一个用到一个用Sma I酶切的酶切的pUC载体，然后用载体，然后用PCR扩增插扩增插入位点两侧的载体序列。入位点两侧的载体序列。P C R扩扩 增增 随后的研究对该方法进行完善，显微切割随后的研究对该方法进行完善，显微切割DNA经经酶切后连接到一个由酶切后连接到一个由24碱基或碱基或20碱基的寡核苷酸组成碱基的寡核苷酸组成的的5，端突出连接头。用端突出连接头。用20个碱基连接头作为引物进个碱基连接头作为引物进行行PCR扩增显微切割的扩增显微切割的DNA，限制酶切扩增产物并克，限制酶切扩增产物并克隆到质粒载体中去。隆到质粒载体中去。替代方法：替代方法：该方法用简并寡核苷酸引物直接用该方法用简并寡核苷酸引物直接用PCR扩扩增显微切割增显微切割DNA。该方法在显微切割的。该方法在显微切割的DNA进进行行PCR扩增前增加了拓扑异构酶扩增前增加了拓扑异构酶I处理，大大简处理，大大简化了显微切割的程序。化了显微切割的程序。优点：优点：通过减少显微切割通过减少显微切割DNA的拷贝数降低显微的拷贝数降低显微切割的操作时间和难度，同时也降低了外源性切割的操作时间和难度，同时也降低了外源性DNA污染的风险。污染的风险。2.染色体显微切割的应用染色体显微切割的应用2.1 感兴趣区域感兴趣区域DNA克隆的构建克隆的构建2.2 FISH探针的制备探针的制备2.3 染色体重排的检测染色体重排的检测2.4 区域特异性区域特异性cDNA的选择的选择2.染色体显微切割的应用染色体显微切割的应用2.1 感兴趣区域感兴趣区域DNA克隆的构建克隆的构建 显微切割在人类基因组计划启动之前主要是分显微切割在人类基因组计划启动之前主要是分离填补离填补物理作图物理作图缺口的染色体区域特有的缺口的染色体区域特有的DNA标记。标记。定位克隆计划已经建立了几个区域的特异文库。定位克隆计划已经建立了几个区域的特异文库。2.2 FISH探针的制备探针的制备2.3 染色体重排的检测染色体重排的检测2.4 区域特异性区域特异性cDNA的选择的选择 物理作图物理作图 要完成真核生物基因组测序的巨大工程，要完成真核生物基因组测序的巨大工程，通常首先需要把基因组分解成为许多较小的通常首先需要把基因组分解成为许多较小的DNA片段，然后分别测序，再综合组装。片段，然后分别测序，再综合组装。物理作图物理作图就是要把基因组分解成为许多较就是要把基因组分解成为许多较小的小的DNA片段，然后再把这些片段，然后再把这些DNA片段连接起片段连接起来，来，构建一个由构建一个由DNA片段重叠群组成的物理图片段重叠群组成的物理图（physical map）。物理图谱：物理图谱：描绘描绘DNA上可以识别的标记的位上可以识别的标记的位置和相互之间的距离（以碱基对的数目为衡量单位，置和相互之间的距离（以碱基对的数目为衡量单位，即物理距离），这些可以识别的标记包括限制性内即物理距离），这些可以识别的标记包括限制性内切酶的酶切位点，分子标记及功能基因等。切酶的酶切位点，分子标记及功能基因等。构建作图文库构建作图文库建立克隆重叠群建立克隆重叠群重叠群重叠群长度确定长度确定作图片段锚定作图片段锚定整合图谱整合图谱染色体染色体DNADNA作图文库作图文库物理图谱物理图谱大分子大分子DNADNA的提取的提取大片段大片段DNADNA的克隆的克隆物理作图物理作图物理作图的主要环节物理作图的主要环节2.染色体显微切割的应用染色体显微切割的应用2.1 感兴趣区域感兴趣区域DNA克隆的构建克隆的构建2.2 FISH探针的制备探针的制备 为了检测以前不可辨认的肿瘤和遗传病的染色体为了检测以前不可辨认的肿瘤和遗传病的染色体异常，已普遍采用全染色体探针的荧光原位杂交技术。异常，已普遍采用全染色体探针的荧光原位杂交技术。为满足日益增多的高质量染色体涂染探针的需求，染为满足日益增多的高质量染色体涂染探针的需求，染色体显微切割已用于许多色体显微切割已用于许多FISH探针的制备，包括所有探针的制备，包括所有人类的人类的染色体涂染探针染色体涂染探针、染色体臂涂染探针染色体臂涂染探针和和区带特区带特异性涂染探针异性涂染探针。2.3 染色体重排的检测染色体重排的检测2.4 区域特异性区域特异性cDNA的选择的选择 染色体涂染技术染色体涂染技术 染色体涂染技术染色体涂染技术即将整条染色体、某条染即将整条染色体、某条染色体臂（长臂或短臂）或者染色体某个片断的色体臂（长臂或短臂）或者染色体某个片断的DNA制备成探针制备成探针，然后用，然后用荧光原位杂交荧光原位杂交的方法，的方法，将探针杂交到中期分裂相染色体上，在荧光显微将探针杂交到中期分裂相染色体上，在荧光显微镜下观察荧光素在染色体上标记的颜色，从而分镜下观察荧光素在染色体上标记的颜色，从而分析和研究染色体的重组、畸变以及同源基因等的析和研究染色体的重组、畸变以及同源基因等的一种新技术。一种新技术。染色体涂染染色体涂染 染色体涂染技术染色体涂染技术1.染色体染色体DNA探针的制备探针的制备2.荧光原位杂交荧光原位杂交流式细胞分类法；流式细胞分类法；克隆基因库或体细胞杂交株；克隆基因库或体细胞杂交株；染色体显微切割和染色体显微切割和PCR扩增等途径。扩增等途径。1.染色体染色体DNA探针的制备探针的制备 流式细胞分类法流式细胞分类法（flow cytometryflow cytometry）该法用一种或多种荧光染料将悬浮液中的中期分裂该法用一种或多种荧光染料将悬浮液中的中期分裂该法用一种或多种荧光染料将悬浮液中的中期分裂该法用一种或多种荧光染料将悬浮液中的中期分裂相染色体染色。由于染色体大小、形态、组成和结构的相染色体染色。由于染色体大小、形态、组成和结构的相染色体染色。由于染色体大小、形态、组成和结构的相染色体染色。由于染色体大小、形态、组成和结构的不同，所染色的特征有其特异性，从而可以通过流式细不同，所染色的特征有其特异性，从而可以通过流式细不同，所染色的特征有其特异性，从而可以通过流式细不同，所染色的特征有其特异性，从而可以通过流式细胞术将特定的染色体收集起来。胞术将特定的染色体收集起来。胞术将特定的染色体收集起来。胞术将特定的染色体收集起来。局限性：局限性：局限性：局限性：如果受试物的染色体形态单一、数目较如果受试物的染色体形态单一、数目较如果受试物的染色体形态单一、数目较如果受试物的染色体形态单一、数目较多多多多,仅根据染色体的形态和大小很难将所有的染色体准仅根据染色体的形态和大小很难将所有的染色体准仅根据染色体的形态和大小很难将所有的染色体准仅根据染色体的形态和大小很难将所有的染色体准确地区分开来。确地区分开来。确地区分开来。确地区分开来。局限性：局限性：局限性：局限性：如果受试物的染色体形态单一、数目较如果受试物的染色体形态单一、数目较如果受试物的染色体形态单一、数目较如果受试物的染色体形态单一、数目较多，如牛多，如牛多，如牛多，如牛 (2n=60)(2n=60)和狗和狗和狗和狗(2n=78)(2n=78)的所有常染色体及绵的所有常染色体及绵的所有常染色体及绵的所有常染色体及绵羊羊羊羊(2n=54)(2n=54)和马和马和马和马(2n=64)(2n=64)的大部分常染色体都是端位着的大部分常染色体都是端位着的大部分常染色体都是端位着的大部分常染色体都是端位着丝点，因此，仅根据染色体的形态和大小很难将所有丝点，因此，仅根据染色体的形态和大小很难将所有丝点，因此，仅根据染色体的形态和大小很难将所有丝点，因此，仅根据染色体的形态和大小很难将所有的染色体准确地区分开来。的染色体准确地区分开来。的染色体准确地区分开来。的染色体准确地区分开来。1.染色体染色体DNA探针的制备探针的制备 克隆基因库或体细胞杂交株克隆基因库或体细胞杂交株 通过特定的克隆基因文库或者特异性的体细胞杂交通过特定的克隆基因文库或者特异性的体细胞杂交通过特定的克隆基因文库或者特异性的体细胞杂交通过特定的克隆基因文库或者特异性的体细胞杂交细胞系制备某条染色体整个或部分细胞系制备某条染色体整个或部分细胞系制备某条染色体整个或部分细胞系制备某条染色体整个或部分DNADNA探针。该法特异探针。该法特异探针。该法特异探针。该法特异性强，准确性高，且可与功能遗传学的研究结合起来，性强，准确性高，且可与功能遗传学的研究结合起来，性强，准确性高，且可与功能遗传学的研究结合起来，性强，准确性高，且可与功能遗传学的研究结合起来，但对实验室要求较高，取材来源和研究范围有所限制但对实验室要求较高，取材来源和研究范围有所限制但对实验室要求较高，取材来源和研究范围有所限制但对实验室要求较高，取材来源和研究范围有所限制 。染色体显微切割和染色体显微切割和PCR扩增扩增 通过该方法制备的染色体通过该方法制备的染色体通过该方法制备的染色体通过该方法制备的染色体DNADNA探针，相对而言，探针，相对而言，探针，相对而言，探针，相对而言，具有直接、准确、具有直接、准确、具有直接、准确、具有直接、准确、简便和应用范围广等优点。简便和应用范围广等优点。简便和应用范围广等优点。简便和应用范围广等优点。2.荧光原位杂交（荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridazation,FISH）原位杂交原位杂交是基于是基于DNA分子复制原理而发展分子复制原理而发展起来的一种技术。用带有标记（放射性同位素、起来的一种技术。用带有标记（放射性同位素、荧光染料等）的荧光染料等）的DNA或或RNA片段作为核酸探针片段作为核酸探针,与组织切片或细胞内待测核酸与组织切片或细胞内待测核酸(RNA或或DNA）片段进行杂交，然后用放射自显影等方法予以片段进行杂交，然后用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的显示，在光镜或电镜下观察目的mRNA或或DNA的存在及定位。的存在及定位。2.荧光原位杂交荧光原位杂交 荧光原位杂交是在荧光原位杂交是在20世纪世纪80年代末在放射性年代末在放射性原为杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原为杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。而形成的一种新的原位杂交方法。探针首先与某探针首先与某种介导分子结合，杂交后再通过免疫细胞化学过种介导分子结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料。程连接上荧光染料。基本原理：基本原理：如果被检测的染色体或如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶纤维切片上的靶DNA与与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火退火-复复性，即可形成靶性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、进行定性、定量或相对定位分析。定量或相对定位分析。实验流程：实验流程：FISH样本的制备样本的制备探针的制备探针的制备探针探针标记标记杂交杂交（染色体显带）（染色体显带）荧光显微荧光显微镜检测镜检测结果分析。结果分析。优点优点:u 荧光试剂和探针经济、安全；荧光试剂和探针经济、安全；uu 探针稳定，一次标记后可在两年内使用；探针稳定，一次标记后可在两年内使用；uu 实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确；位准确；uu 可定位长度在可定位长度在1kb的的DNA序列，其灵敏度与放序列，其灵敏度与放射性探针相当；射性探针相当；uu 多色多色FISH在同一个核中显示不同颜色可同时检在同一个核中显示不同颜色可同时检测多种序列；测多种序列；uu 既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结的结构。构。缺点：缺点：u 不能达到不能达到100%杂交，特别是在应用较短的杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。探针时效率明显下降。染色体涂染技术的应用染色体涂染技术的应用 染色体涂染技术主要应用于动物分子细胞遗传学、染色体涂染技术主要应用于动物分子细胞遗传学、染色体涂染技术主要应用于动物分子细胞遗传学、染色体涂染技术主要应用于动物分子细胞遗传学、人类疾病、性染色体以及染色体进化等研究。人类疾病、性染色体以及染色体进化等研究。人类疾病、性染色体以及染色体进化等研究。人类疾病、性染色体以及染色体进化等研究。u19951995年以来，剑桥大学应用这项技术进行哺乳动物年以来，剑桥大学应用这项技术进行哺乳动物年以来，剑桥大学应用这项技术进行哺乳动物年以来，剑桥大学应用这项技术进行哺乳动物的染色体比对，他们运用了的染色体比对，他们运用了的染色体比对，他们运用了的染色体比对，他们运用了YACYAC等细胞的多种染色等细胞的多种染色等细胞的多种染色等细胞的多种染色体作探针，以研究重组染色体的断裂点。体作探针，以研究重组染色体的断裂点。体作探针，以研究重组染色体的断裂点。体作探针，以研究重组染色体的断裂点。u澳大利亚澳大利亚澳大利亚澳大利亚LatrobeLatrobe大学以染色体涂染技术探讨人的大学以染色体涂染技术探讨人的大学以染色体涂染技术探讨人的大学以染色体涂染技术探讨人的XYXY染色体的亲缘关系。染色体的亲缘关系。染色体的亲缘关系。染色体的亲缘关系。u美国美国美国美国AmbadyAmbady等人用显微切割术和等人用显微切割术和等人用显微切割术和等人用显微切割术和PCRPCR扩增建立了扩增建立了扩增建立了扩增建立了猪第猪第猪第猪第6 6号染色体号染色体号染色体号染色体DNADNA文库，寻找微星体，用于猪基因文库，寻找微星体，用于猪基因文库，寻找微星体，用于猪基因文库，寻找微星体，用于猪基因图的研究。图的研究。图的研究。图的研究。u国外实验室主要研究不同种属的动物国外实验室主要研究不同种属的动物国外实验室主要研究不同种属的动物国外实验室主要研究不同种属的动物(包括人包括人包括人包括人)或植或植或植或植物染色体物染色体物染色体物染色体(尤其是性染色体尤其是性染色体尤其是性染色体尤其是性染色体)的比较与进化，研究过的比较与进化，研究过的比较与进化，研究过的比较与进化，研究过的动物有鸡、狗、狐、猴、的动物有鸡、狗、狐、猴、的动物有鸡、狗、狐、猴、的动物有鸡、狗、狐、猴、猫、猿、鼠、兔、牛、猫、猿、鼠、兔、牛、猫、猿、鼠、兔、牛、猫、猿、鼠、兔、牛、羊、山羊以及其它鸟类、有袋类和哺乳类等。羊、山羊以及其它鸟类、有袋类和哺乳类等。羊、山羊以及其它鸟类、有袋类和哺乳类等。羊、山羊以及其它鸟类、有袋类和哺乳类等。2.染色体显微切割的应用染色体显微切割的应用2.1 感兴趣区域感兴趣区域DNA克隆的构建克隆的构建2.2 FISH探针的制备探针的制备2.3 染色体重排的检测染色体重排的检测 该方法最引人注目的特点之一是它可直接检测任该方法最引人注目的特点之一是它可直接检测任何细胞遗传学上可见到的染色体重排的染色体结构。何细胞遗传学上可见到的染色体重排的染色体结构。该方法已用于分析不同的染色体重排，包括缺失、易该方法已用于分析不同的染色体重排，包括缺失、易位、小的环状染色体和扩增。常规显带记为简单末端位、小的环状染色体和扩增。常规显带记为简单末端缺失的畸变，通过用显微切割方法重新分析，结果可缺失的畸变，通过用显微切割方法重新分析，结果可清楚地显示该缺失为中间缺失或易位。应用显微切割清楚地显示该缺失为中间缺失或易位。应用显微切割对包括同源染色区域和双微小体的基因扩增产物进行对包括同源染色区域和双微小体的基因扩增产物进行分析显示：这些区域通常是由多个染色体区段组成。分析显示：这些区域通常是由多个染色体区段组成。2.4 区域特异性区域特异性cDNA的选择的选择FISH检测（检测（chromosome painting)染色体易位染色体易位图图 染色体倒位图（染色体倒位图（SISH显示和电镜下观察）显示和电镜下观察）相互易位相互易位2.染色体显微切割的应用染色体显微切割的应用2.1 感兴趣区域感兴趣区域DNA克隆的构建克隆的构建2.2 FISH探针的制备探针的制备2.3 染色体重排的检测染色体重排的检测2.4 区域特异性区域特异性cDNA的选择的选择 从同源染色区域（从同源染色区域（HSR）显微切割）显微切割DNA技术技术的应用，使得从显微切割区域内分离转录序列的方的应用，使得从显微切割区域内分离转录序列的方法得以建立。显微切割结合选择性杂交已用于鉴别法得以建立。显微切割结合选择性杂交已用于鉴别骨肉瘤细胞系中骨肉瘤细胞系中12q11-q13.2HSR有关的基因。简有关的基因。简单地说，显微切割单地说，显微切割DNA的的PCR产物被固定在尼龙产物被固定在尼龙膜上，然后将从癌细胞系中用随机引物法制备的膜上，然后将从癌细胞系中用随机引物法制备的cDNA与靶与靶HSR进行杂交。经杂交和严格洗脱后，进行杂交。经杂交和严格洗脱后，特异性杂交的特异性杂交的cDNA克隆被洗脱并用克隆被洗脱并用PCR方法回收。方法回收。3.染色体显微切割策略染色体显微切割策略染色体显微切割染色体显微切割用拓扑异构酶用拓扑异构酶I处理切割的处理切割的DNA显微切割显微切割DNA的扩增的扩增荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）染色体显微切割染色体显微切割 用于显微切割的中期染色体是用用于显微切割的中期染色体是用植物血球植物血球凝集素（凝集素（PHA）刺激正常外周血淋巴细胞制备刺激正常外周血淋巴细胞制备的，中期分裂相滴在干净的盖玻片上并进行的，中期分裂相滴在干净的盖玻片上并进行G显带，通常显带，通常35个拷贝的靶染色体区域足以获个拷贝的靶染色体区域足以获得高质量探针。得高质量探针。染色体显微切割是用安装在倒置显微镜上染色体显微切割是用安装在倒置显微镜上的显微操作装置控制一个玻璃针来完成的。显的显微操作装置控制一个玻璃针来完成的。显微切割的染色体片段转移到微切割的染色体片段转移到5微升含拓扑异构酶微升含拓扑异构酶I的收集液中。的收集液中。用拓扑异构酶用拓扑异构酶I处理切割的处理切割的DNA 在在PCR扩增前，切割的扩增前，切割的DNA用拓扑异用拓扑异构酶构酶I处理，使得结构非常紧密的处理，使得结构非常紧密的DNA螺旋螺旋解旋。这种处理可以显著提高被切割解旋。这种处理可以显著提高被切割DNA序列的回收。序列的回收。收集到期望数量的被切割染色体区段收集到期望数量的被切割染色体区段后，显微切割的后，显微切割的DNA在在37度条件下用拓扑度条件下用拓扑异构酶异构酶I处理处理1小时。小时。显微切割显微切割DNA的扩增的扩增 扩增被切割扩增被切割DNA最困难的问题是最困难的问题是PCR反应的有效启动。反应的有效启动。Taq聚合酶对启动聚合酶对启动PCR不不是高效的，因为它的延伸温度是是高效的，因为它的延伸温度是72度，而度，而对部分简并引物的最佳退火温度大约是对部分简并引物的最佳退火温度大约是30度。为了解决这个问题，在度。为了解决这个问题，在PCR第第58个循个循环加入环加入T7 DNA聚合酶（测序酶），并且酶聚合酶（测序酶），并且酶是在每个循环的退火温度（是在每个循环的退火温度（30度）时加入。度）时加入。完成此种预扩增后，接着用完成此种预扩增后，接着用Taq聚合酶催化聚合酶催化的常规的常规PCR反应完成。反应完成。T7 DNA聚合酶聚合酶最初具有最初具有53聚合酶活性聚合酶活性以及单链和双链以及单链和双链35外切酶活性。外切酶活性。当当T7 DNA聚合酶用适当方法处理后聚合酶用适当方法处理后,可使可使35外切酶活力明显下降。改造后的外切酶活力明显下降。改造后的T7 DNA聚合酶又称聚合酶又称T7测序酶。测序酶。使用使用T7测序酶得到的测序数据具有在每测序酶得到的测序数据具有在每个碱基位置都有相对均匀的配对参入。因此，个碱基位置都有相对均匀的配对参入。因此，放射自显影所得到的结果较为清晰易辩，对于放射自显影所得到的结果较为清晰易辩，对于许多模板来说，使用含有许多模板来说，使用含有dGTP的混合物即可的混合物即可得到理想的测序结果。然而，如果出现了带压得到理想的测序结果。然而，如果出现了带压缩的问题，则用含缩的问题，则用含 dITP的混合物来取代常规的混合物来取代常规的的dGTP。dITP的掺入，使在富含的掺入，使在富含GC的模板中的模板中也能有效地消除带压缩现象。也能有效地消除带压缩现象。T7测序酶具有很高的聚合速度，并有高测序酶具有很高的聚合速度，并有高度的延续性，正因如此，该酶在使用中不同于度的延续性，正因如此，该酶在使用中不同于Klenow片段和反转录酶。它几乎没有错误性片段和反转录酶。它几乎没有错误性的终止，整个反应在很短的时间内完成，并且的终止，整个反应在很短的时间内完成，并且不需要进行追加反应（不需要进行追加反应（Chase step）。然而对）。然而对于有紧密二级结构的区域，错误的终止反应会于有紧密二级结构的区域，错误的终止反应会给阅读序列带来困难。如果碰到这些情况给阅读序列带来困难。如果碰到这些情况,应使应使用一些高温用一些高温DNA聚合酶，如聚合酶，如Promega公司的公司的测序级测序级Taq DNA 酶。利用高温酶。利用高温DNA聚合酶独聚合酶独有的耐热特性，测序反应可在不利于形成二级有的耐热特性，测序反应可在不利于形成二级结构的高温条件下进行。结构的高温条件下进行。T7 DNA聚合酶测序的快速而简便的方法聚合酶测序的快速而简便的方法是从是从Klenow酶和酶和AMV反转录酶测序的操作步反转录酶测序的操作步骤修改而来的，它的最大优点是具有很高的骤修改而来的，它的最大优点是具有很高的5-3的的DNA合成活性和极低的合成活性和极低的3-5端外切酶的活端外切酶的活性。在测序过程中，若以同位素标记则相对于性。在测序过程中，若以同位素标记则相对于大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶的大片段的大片段Klenow或反或反转录酶转录酶AMV而言，则可使条带非常的均一，并而言，则可使条带非常的均一，并且它的放射性背景极低。且它的放射性背景极低。T7 DNA聚合酶测序时聚合酶测序时DNA的合成的过程的合成的过程是分二步完成的。第一步为标记反应阶段，第是分二步完成的。第一步为标记反应阶段，第二步方为双脱氧链末端终止的二步方为双脱氧链末端终止的DNA合成过程。合成过程。在第一步过程中，引物的延伸是在较低浓度的在第一步过程中，引物的延伸是在较低浓度的脱氧三磷酸核苷酸的存在下完成的，在此反应脱氧三磷酸核苷酸的存在下完成的，在此反应过程中，已含有经放射性标记的过程中，已含有经放射性标记的dATP。第二。第二步过程中，脱氧三磷酸核苷酸浓度提高，并且步过程中，脱氧三磷酸核苷酸浓度提高，并且加入双脱氧的三磷酸核苷酸，加入双脱氧的三磷酸核苷酸，DNA 在合成过在合成过程中，因加入的双脱氧三磷酸核苷酸而随机终程中，因加入的双脱氧三磷酸核苷酸而随机终止，形成长短不一的止，形成长短不一的DNA片段。片段。荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）FISH是确保显微切割成功并检验探针是确保显微切割成功并检验探针质量的一种简便快速的方法。被切割质量的一种简便快速的方法。被切割DNA经经PCR扩增后，用第二轮扩增后，用第二轮PCR反应进行荧光标反应进行荧光标记。标记后的探针经纯化后与正常中期染色记。标记后的探针经纯化后与正常中期染色体进行杂交。体进行杂交。