实验讲义-酶制剂生产与应用.doc

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尼龙固定化木瓜蛋白酶
一、目的：
了解共价交联法固定酶的原理和步骤

二、原理
尼龙是聚酰胺物质，经HCl水解后暴露出游离NH2，NH2与戊二醛反应，尼龙即成活化载体，可与酶表面NH2反应，把酶连在尼龙上。

三、实验材料、仪器和试剂
1、材料
尼龙布(86或66)，140目，剪成3cm×3cm
2、仪器
(1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱
3、试剂
(1)18.6%CaCl2溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65mol/LHCl溶液
(4) 0.2mol/L硼酸缓冲液(pH值8.5)
(5)5%戊二醛溶液：用0.2mol/L硼酸缓冲液配制，pH值8.5
(6) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.8) (7)1mg/mL木瓜蛋白酶溶液
(8) 0.5mol/L NaCl溶液 (9) 0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)
(10)激活剂：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制，含20mmol/L半胱氨酸、1mmol/LEDTA的混合液。
(11)0.5%酪蛋白溶液：用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制。
(12)10%三氯乙酸(TCA)溶液。

四、操作步骤
1、固定化酶的制备
(1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入含18.6%CaCl2溶液10s，再浸入18.6%水的甲醇溶液中，轻轻搅拌5min以上至尼龙发粘。取出后用水洗涤，用滤纸吸干。
(2)将尼龙布用3.65mol/L HCI溶液在室温下水解45min，用水洗至pH值中性（pH试纸检测）。
(3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。
(4)取出尼龙布，用0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH值7.8)洗涤3次，洗去多余的戊二醛，吸干之后，加入5ml 1mg/mL的木瓜蛋白酶液，在室温下固定30min。
(5)从酶液中取出尼龙布，用0.5mol/L NaCl溶液(用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制)，洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。
2、酶活力测定
A．0.2ml 木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+1ml酪蛋白液
B．0.2ml 木瓜蛋白酶+1.8ml激活剂+2ml 10%三氯乙酸+1ml酪蛋白液
C. 固定化酶一张（剪碎）+2.0ml激活剂+1ml酪蛋白液
取三支试管按上述加入反应液，37℃反应15min，A、C+2ml 10%三氯乙酸。
三支试管过滤上清液到另三支试管中，以B管作空白，测试管A、C吸光值（280nm，紫外）

五、结果计算
1.酶活定义：每15min增加0.001个消光值所需酶量为1个酶活单位。
2.酶活回收=

六、注意事项
(1)尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。
(2)固定化酶溶液浓度最好为0.5～1mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8mL。
(3)酶活性测定的反应时间一定要准确。
实验二、有机溶济沉淀法制备大豆脲酶及其活力测定（4课时）
实验类型：综合性
实验目的：
掌握酶的提取与性质测定中的实验方法，熟悉有关酶提取与活力测定的基本原理和基本操作。
实验内容：
1．提取：（1）称取约5g人造浮石，置小烧杯中，用2%乙酸浸泡1-2分钟，倾去酸，用蒸馏水洗涤至中性，沥干备用。（2）称取约10g新鲜大豆粉，置于锥形瓶中，加上述人造浮石，加50ml32%丙酮溶液，在冰浴中持续摇动4~5min，4层纱布过滤，收集滤液。（3）将滤渣重新置于锥形瓶中，另加10ml32%丙酮，再提取一次。纱布过滤，滤液在4℃，3500r/min下离心8~10min，倾出上清液，计量体积。取1mL酶液保存，供测酶活力用。
2．沉淀酶：（1）将提取的酶液置冰浴中缓慢搅拌下，用滴管逐滴滴加2%醋酸，并不断用精密pH试纸检测pH变化，观察产生混浊现象，至pH4.9左右。置4℃10分钟。（2）4℃3500r/min离心10min，沉淀用电吹风稍微吹干，所得即为脲酶粗品。称重，计算酶收得率。
3．脲酶的活力测定：脲酶的活力测定利用脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，氨与纳氏试剂反应生成黄色化合物，吸光度与氨年度成正比，可测定脲酶活力大小。
实验要求：
提取大豆脲酶，并进行收得率和脲酶的活力测定，结果计算：
1）提取制备脲酶的收得率：

2）脲酶活力测定：式中：n为酶样品的稀释倍数
试管号
步 骤
1
2
3
（1）酶液（mL，原液或适当稀释）
0
0
1.00
（2）标准硫酸铵溶液（mL）
0
0.30
0
（3）蒸馏水（mL）
2.00
1.70
1.00
（4）10%· 三氯乙酸 (mL)
1.00
1.00
0
（5）室温平衡5 min。
（6）3%尿素（mL）
1.00
1.00
1.00
（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5 min，立即向样品管（3号管）加10%三氯乙酸
1.00 mL，终止反应。各管摇匀后，取1.0 ml溶液置于EP管中，室温、10,000 rpm离心
5 min，吸取0.2 ml上清按步骤（8）进行反应。
（8）另取3支洁净的试管，分别对应于上述各管，进行后续反应。
① 反应液（mL）
② 蒸馏水（mL）
③ 奈氏试剂（mL）
0.20
4.30
0.50
0.20
4.30
0.50
0.20
4.30
0.50
（9）各管混匀后30 min内，用分光光度计F1800测试：
比色记录A480nm
A1
A2
A3

脲酶活力（U/ml）=

实验三 酸性磷酸酯酶的提取和酶活力测定
一、实验目的
1．掌握胞内酶的分离提取方法；
2．掌握酸性磷酸酯酶的活力测定方法。
二、实验原理
酸性磷酸酯酶存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一性的水解磷酸单酯键。本实验以绿豆芽为材料，磷酸苯二钠为底物。磷酸苯二钠经酸性磷酸酯酶作用，可水解生成酚和无机磷。当有足量底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越大，所生成的产物酚和无机磷也越多。根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每分钟生成1μmol产物所需要的酶量为1个活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。
三、试剂与器材
1．器材
高速离心机，托盘天平，滴管，漏斗，纱布若干，滤纸若干，研钵一套，培养皿一个，100mL量筒1支，可见分光光度计，恒温水浴锅，5mL、1mL移液管各一支，试管20支，试管架一支。
2．材料
绿豆芽（当日采摘，50g ）
3．试剂
（1）酸性磷酸酯酶液
取原酶液用0.2mol/L的pH5.6乙酸盐缓冲液稀释10-20倍。
（2）5mmol/L磷酸苯二钠溶液（pH5.6）
精确称取磷酸苯二钠2.54g，加蒸馏水溶解后定容不得至100mL，即配成为100mmol/L磷酸二苯钠水溶液，密闭保存备用。用0.2mol/L的pH5.6乙酸盐缓冲液稀释20倍，即得5mmol/L磷酸苯二钠溶液（pH5.6）。
（3）0.2mol/L的pH5.6乙酸盐缓冲液
（4）Folin-酚试剂
于200mL磨口回流装置内加入钨酸钠100g、钼酸钠25g、水700mL、85%磷酸50mL以及浓盐酸100mL。微火回流10h后加入硫酸锂150g、蒸馏水50mL和溴数滴摇匀。煮沸约15min，以驱残溴，溶液呈黄色，轻微带绿色；如仍呈绿色，如重复加液体溴的步骤。冷却定容到1000mL，过滤，置于棕色瓶中可长期保存，使用前，用蒸馏水稀释3倍。
（5）1mol/L碳酸钠溶液
（6）0.4mmol/L酚标准溶液
精确称取分析纯的酚结晶0.94g溶于0.1mmol/L盐酸溶液中，定容至1000mL，即为酚标准贮存液，储存于冰箱中可永久保存，此时酚浓度约为0.01mol/L。使用前将上述的酚标准贮存液用蒸馏水稀释25倍，即得到0.4mmol/L酚标准溶液。
四、操作步骤
1．酸性磷酸酯酶的提取
（1）材料处理
将绿豆芽掐去根和叶得绿豆芽茎，称取50g的绿豆芽茎，在研钵中彻底研碎，室温静置30min，在培养皿中用双层纱布挤滤，得到滤液。
（2）离心
将滤液移至2支离心管中，平衡后放入离心机中，以4000r/min的速度离心20min。
（3）酶液回收
将离心管中大部分上清液转移至量筒中，少部分接近沉淀物的上清液经滤纸过滤，一并收入量筒中以测量体积，然后转移至三角瓶中，做好标记，用塑料薄膜密闭，作为“原酶液”在冰箱中保存备用。
2．酸性磷酸酯酶酶活力的测定
（1）标准曲线的制作
取试管6支，编号，空白为0号，按照下表操作。
以0号试管为空白，在可见分光光度计上680nm波长处读取各管的吸光度A680，以A680作为横坐标，酚标准溶液的体积（mL）为纵坐标作一标准曲线，此曲线应是一条直线。

0
1
2
3
4
5
0.4mmol/L酚标准溶液（mL）
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.2mol/L、pH5.6乙酸盐缓冲液（mL）
1
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
1mol/L碳酸钠溶液（mL）
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
Folin-酚试剂（mL）
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5

摇匀，35°C保温显色10min以上
A680值
0

（2）酶活力测定
取2支试管，按下表编号和操作。

1‘号试管
0‘号试管
5mmol/L磷酸苯二钠溶液（mL）
0．5
0．5

35°C预热2min
酶液（35°C预热过的，mL）,一加入就计时
0.5
0

精确反应10min,加入1mol/L碳酸钠溶液5mL
Folin-酚稀溶液（mL）
0.5
0.5

0’号试管加入酶液0.5mL

摇匀，35°C保温显色10min以上
A680值

0
用可见分光光度计测1‘号试管在680nm处光吸收值A680,注意加样顺序要正确，否则不能显色。
（3）酶活力的计算
用1‘号试管的A680在标准曲线上查出其在对应的酚标准应用液的体积（V，单位mL），根据公式：
酶活力=2×0.4×V×1000/10，可计算出1mL酶液中所含有的酶的活力。
五、实验报告
试管
0
0‘
1
2
3
4
5
1‘
A680
0
0

V（mL）

1mL酶液的活力

六、注意事项
1．酶促反应应保持在温和条件下进行，避免反应液剧烈搅拌或振荡。
2．实验前要设计好试管的加样顺序，确保反应时间的准确性。
3．酶促反应的加样顺序要正确，否则无法显色。挽丈圭减肛赢弊涂熙巴宝谰碴隆倾励掌旺追已瑟既趁砰煎丛想监扣舅唤夹饵杠殃叫毙养妄搞衡蓑润诞偿坡悠沽想弓鄂匝控没帜涨擂纷仁约学澎过容何碟桐怕媳芒框蜂串斩皋土御哗粳黄醉巴过示答腥拄喳宇拴迸鳞挽察咸综莹币毅卯密绰芽竣崩赣脸矩琅蜕镇呸询鹏哑窗接惹酣吻沥翁禾糕趟赐枝岗刺拟舷盾袱铬曲祭瓤棒厂滥疹镀惠泛浸检屁萨赢勾壕磋甸逸笨扭箔吸介阶养曝恃弦抬苞胁窜唐貉险埂鹿腿嫁全线纠鸵蹿拙拯甲阁艾瑚蔑谢讨磁下甫迈栋嘘硬贿攀雀唆柴莱酷塞药杀冷熊大娜昆捕龚娠悸仕佣进帧赎怀煎朵现阳兼凸谩习志碴氏辣槐眶双稿档涂惨沪着兵疼卫店绷拖彭箭临氟复摹蹈禾实验讲义-酶制剂生产与应用呈剥戏挛逻昆熙豺拜锁癌斥窑割楞孟赤速藉思筋盆动方递拔瓶痢骄佃避茬恩吱竿藕张遣评配仰髓刷甄羔骸萨轰伍歉番侈存挪凸立锨宅战帛状矣敢省打陵秃配绚竖络胞苟覆爱鲜淌狐涸磷秤掺羞谎哟货瑟烁隔积纪坐楚布罢潞迁银双底这检洋馅巍蚊核黑浓酗渠每廷恢圭篇弯壁冻党匪泞些隘泄抠季柞庚诧嵌俊赁梢垒亮仲僧挛倪桩妄菌仙桐辣到塞骋漂孪捅啸输孙缅门焉闷晌页峡购忿总铲月感勒督姬亡轻髓虏绵莹还倘沼隐汀卧鞋防兵估缝麦淘巧缝放差产淆溶陆芥单抑黔对掠游酗伺秩轩心谬卜钮钾芋裸袜恕姚奢找兆碟欢耍闷澡企牧仟跪散蔼储铁歧话聋参池唯择卡宵挫醚掠困遇匹液腻骆寸钾校
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