环指蛋白44基因表达对胃癌细胞增殖和凋亡的调节作用及机制.pdf

22实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in Practice2023,27(19):22-31,39.环指蛋白44基因表达对胃癌细胞增殖和凋亡的调节作用及机制师文，高楠，孙焕焕，韩炜2（1.西安交通大学第一附属医院消化内科，陕西西安，7 10 0 6 1；2.陕西省人民医院肿瘤外科，陕西西安，7 10 0 6 8）摘要：目的探讨环指蛋白44(RNF44)基因表达对胃癌细胞增殖和调亡的调节作用及机制。方法检测胃癌细胞株及正常胃黏膜细胞RNF44的基因和蛋白表达；胃癌MKN45细胞株和AGS细胞株分别转染shRNF44病毒和oeRNF44病毒，测定RNF44的基因和蛋白的表达、细胞增殖和细胞凋亡情况、蛋白激酶B（A K T）和磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)的蛋白表达情况；测定AKT通路抑制剂LY294002对RNF44基因过表达AGS细胞株增殖、调亡和AKT信号蛋白的影响；采用MKN45细胞株构建裸鼠皮下瘤模型，观察肿瘤生长情况、肿瘤组织Ki-67表达情况以及AKT和p-AKT蛋白表达情况。结果正常胃黏膜GES-1细胞RNF44的基因和蛋白表达水平最低,胃癌MKN45细胞株 RNF44的基因和蛋白表达水平最高。MKN45细胞株经RNF44基因干扰慢病毒转染后，RNF44的基因和蛋白表达水平降低，细胞增殖能力降低,早期和晚期凋亡率均增加，RNF44和p-AKT蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义（P0.05）。A G S 细胞株经RNF44基因过表达慢病毒转染后，RNF44的基因和蛋白表达水平升高,细胞增殖能力增加,细胞早期和晚期凋亡率均降低，RNF44和p-AKT蛋白表达水平增加,差异均有统计学意义（P0.05）。A K T 抑制剂可使正常AGS细胞或RNF44基因过表达AGS细胞株增殖能力降低,细胞早期和晚期凋亡率升高，p-AKT蛋白表达水平降低。shRNF44 组裸鼠肿瘤组织大小和质量均较 shNC 组降低，Ki-67表达较 shNC 组降低,肿瘤组织RNF44和p-AKT蛋白表达较shNC 组降低,差异有统计学意义（P0.05）。结论RNF44基因表达水平对胃癌细胞增殖和调亡具有调节作用。RNF44过表达可显著抑制肿瘤细胞增殖并促进调亡，RNF44低表达可显著促进肿瘤细胞增殖并抑制调亡。RNF44可能通过调控p-AKT蛋白表达而发挥调节作用。关键词：环指蛋白44基因；胃癌；细胞增殖；细胞调亡；丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶中图分类号：R735.2；Q 344文献标志码：A文章编号：16 7 2-2 353(2 0 2 3)19-0 2 2-10 D0I：10.7 6 19/j c mp.2 0 2 32 339Moderating effect and mechanism of genetic expressionof ring finger protein 44 on proliferation and apoptosisof gastric cancer cellsSHI Wen,GAO Nan,SUN Huanhuan,HAN Wei?(1.Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University,Xian,Shaanxi,710061;2.Department of Oncologic Surgery,Shaanxi Provincial PeoplesHospital,Xian,Shaanxi,710068)Abstract:Objective To investigate the moderating effect and mechanism of gene expression ofring finger protein 44(RNF44)on proliferation and apoptosis of gastric cancer cells.Methods Thegene and protein expressions of RNF44 in gastric cancer cell lines and normal gastric mucosa cellswere detected;the gastric cancer MKN45 cell lines and AGS cell lines were transfected with shRNF44virus and oeRNF44 virus respectively,and the gene and protein expressions of RNF44,conditions ofcell proliferation and cell apoptosis,the protein expressions of protein kinase B(AKT)and phospho-rylated protein kinase B(p-AKT)were determined;the effect of AKT pathway inhibitor LYS294002on the proliferation,apoptosis and AKT signaling protein of RNF44 gene overexpression cells was de-termined;the tumor growth,Ki-67 expression,AKT and p-AKT protein expression were determined收稿日期：2 0 2 3-0 7-2 4修回日期：2 0 2 3-0 9-0 9基金项目：陕西省自然科学基础研究计划（2 0 2 3-JC-QN-0947）；陕西省自然科学基础研究计划（2 0 2 1JQ-917)；陕西省人民医院2 0 2 1年科技人才支持计划（2 0 2 1JY46）通信作者：韩炜，E-mail：w _h a n 9 13 16 3.c o m第19 期in nude mouse subcutaneous tumor model constructed by MKN45 cell line.Results The gene andprotein expression levels of RNF44 were the lowest in normal gastric mucosal GES-1 cells and thehighest in gastric cancer MKN45 cell line.After transfected with lentivirus of RNF44 gene interfer-ence,the gene and protein expressions of RNF44 in MKN45 cell line decreased significantly,thecell proliferation ability decreased significantly,the apoptotic rate at early and late stages increasedsignificantly,and the protein expressions of RNF44 and p-AKT decreased significantly(P 0.05).After transfected with lentivirus of RNF44 gene overexpression,the gene and protein expression lev-els of RNF44 increased significantly in AGS cell line,the cell proliferation ability increased signifi-cantly,the apoptotic rate at early and late stages decreased significantly,and the protein expressionlevels of RNF44 and p-AKT increased significantly(P 0.05).AKT inhibitors were able to reducethe proliferation ability of normal AGS cells or AGS cell lines with overexpression of the RNF44gene,increase the apoptotic rate at early and late stages,and reduce the protein expression level ofp-AKT.In the shRNF44 group,the size and mass of tumor tissues of nude mice were significantlylower than those in the shNC group,the expression of Ki-67 was significantly lower than that in theshNC group,and the protein expressions of RNF44 and p-AKT in tumor tissues were significantlylower than those in the shNC group(P0.05).Conclusion The expression level of RNF44 genehas a moderating effect on the proliferation and apoptosis of gastric cancer cells.Overexpression ofRNF44 can significantly inhibit tumor cell proliferation and promote apoptosis,while low expressionof RNF44 can significantly promote tumor cell proliferation and inhibit apoptosis.RNF44 may play amoderating role by regulating the expression of p-AKT protein.Key words:ring finger protein 44 gene;gastric cancer;cell proliferation;apoptosis;serine/threonine protein kinase胃癌是世界上最常见的消化系统恶性肿瘤之一，2 0 2 0 年全球新增确诊病例超过10 万例，发病率位于恶性肿瘤第5位。胃癌早期缺乏特异性症状,诊断存在困难,多数患者确诊后易错过最佳治疗时机,治疗后5年生存率也不足2 0%2 ，病死率在所有恶性肿瘤中位居第4位3-4。近年来胃癌的发病率和病死率逐年下降，2 0 2 2 年新增胃癌病例51万,死亡病例40 万5。胃癌发病机制涉及多种因素、发育过程中的多个步骤以及多重基因突变和异常6-7 。E3 泛素连接酶家族在各种恶性肿瘤的发生、发展以及耐药中发挥重要作用。环指蛋白44(RNF44)是一种新发现的E3泛素连接酶,参与黑色素瘤、口腔鳞状细胞癌和胶质瘤等发生和发展8-10 。目前，RNF44基因作用的分子机制及其与胃癌进展的关系仍有待进一步探索。本研究采用细胞生物学和动物实验等方法探讨RNF44基因对胃癌发生、发展的影响和机制，现将结果报告如下。1材料与方法1.1实验材料1.1.1细胞株来源：细胞株AGS、M G C-8 0 3、实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in PracticeMKN28、M K N45及正常胃黏膜GES-1细胞源自ATCC 细胞库。1.1.2实验动物：无特定病原体（SPF)级雄性裸鼠12 只，体质量18 2 0 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物合格证编号为20170005034573，适应性饲养1周后开始造模。1.1.3主要试剂：胎牛血清（美国Gibco公司），RPMI-1640培养液（美国Hyclone公司），青链霉素混合液、0.2 5%胰蛋白酶消化液（北京索莱宝科技有限公司），CCK-8试剂（美国Signalwayan-tibody公司），Trizol试剂、LipofectamineTM2000试剂盒（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒（加拿大Fermentas 公司），SYBR Green PCR试剂盒（美国Thermo公司），RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、Tris-HCl电泳缓冲液、蛋白上样缓冲液（北京索莱宝科技有限公司），RNF44一抗（美国NO-VUS公司），Ki-67、A K T、P-A K T（美国Abcam公司），GAPDH一抗（美国Proteintech公司），An-nexin V-FITC 细胞调亡检测试剂盒、HRP 标记二抗、AlexaFluor488标记山羊抗兔IgG（H+L）、4，6-二基-2-苯基吲哚(DAPI)和防淬灭封片剂（上海碧云天公司）。shRNF44病毒及对应空载2324病毒shNC、o e RNF44病毒及对应空载病毒Vector（本实验构建）。RNF44和GAPDH引物序列和产物长度见表1。表1引物序列和产物长度引物序列(5-3)RNF44上游：5-GCTTCCTGCCCTACTTCCTC-3下游：5-CGTCTGCTCCGACTGATGG-3GAPDH上游：5-AATCCCATCACCATCTTC-3下游：5-AGGCTGTTGTCATACTTC-31.1.4主要仪器：Forma3111型CO，恒温培养箱（美国Thermo公司），DHG-9023A型恒温烘箱（上海恒一科学仪器有限公司），TDZ4-WS型离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司），TG-16M型低温冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司），K30型旋涡振荡器（上海青浦泸西仪器厂），PR0200型电动匀浆机（上海弗鲁克科技发展有限公司），CytoFLEX型流式细胞仪（美国BeckmanCoulter公司），ABI-7300型Real-time检测仪（美国ABI公司），DNM-9602型酶标仪（北京普朗新技术有限公司），XDS-500C型显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司），ECLIPSENi型荧光显微镜（日本NIKON公司），SQ2125型石蜡切片机和PPTHK-21B型摊片机（湖北徕克医疗仪器有限公司）。1.2实验方法1.2.1细胞培养和传代：胃癌细胞株AGS、MGC-803、M K N2 8、M K N45及正常胃黏膜GES-1细胞复苏后,采用含10%胎牛血清、1%双抗(青链霉素混合液）的RPMI-1640培养液于37、5%CO2恒温培养箱中进行培养，2 4h更换1次培养液，待细胞生长至8 0%9 0%时进行传代。加人0.2 5%胰蛋白酶液消化细胞1 2 min，显微镜下观察细胞变圆即可加入新鲜培养液终止消化，10 0 0 转/min室温离心5min，加人适量新鲜培养液反复轻轻吹打，使细胞分散成单细胞悬液，另取培养瓶，将单细胞悬液加入培养瓶中继续培养进行后续实验。采用定量聚合酶链反应（Q-PCR）和Westernblot检测各细胞中RNF44的基因和蛋白表达。1.2.2RNF44基因干扰慢病毒转染MKN45细胞株的构建：收集处于对数生长期的MKN45细胞，按照每孔510 的密度铺入6 孔培养板中，分为Control组、shNC组和 shRNF44组。每孔中加入2 mL完全培养基，放人37、5%COz培养实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in Practice箱内培养，细胞生长至7 0%左右进行慢病毒转染。Control组每孔加人2 mL完全培养基,其余各组每孔分别加siNC和shRNF44各5L以及1L聚凝胺（5g/L），于37、5%CO,恒温培养箱中培养2 4h，然后更换为完全培养基继续产物长度培养7 2 h，采用Q-PCR和Western blot检测227 bpRNF44 的基因和蛋白表达效率,确认RNF44 基因218 bp干扰慢病毒转染MKN45细胞株是否构建成功。1.2.3RNF44基因干扰慢病毒转染MKN45细胞株增殖、调亡和AKT信号蛋白的测定：按1.2.2 方法构建RNF44基因干扰慢病毒转染MKN45细胞株，各组细胞转染2 4h，更换为完全培养基，继续进行培养,采用 CCK-8测定细胞增殖情况,采用流式细胞术检测细胞调亡情况，采用Western blot检测RNF44、A K T 和p-AKT蛋白的表达。1.2.4RNF44基因过表达慢病毒转染AGS细胞株的构建：收集处于对数生长期的ACS细胞,按照510 5个/孔的密度铺入6 孔培养板中，分为Control组、Vector组和oeRNF44组，每孔中加人2mL培养基，放入37、5%CO,培养箱内培养，细胞生长至7 0%左右进行慢病毒转染。Control组每孔加入2 mL完全培养基,其余各组每孔分别加人Vector和oeRNF44各5L以及1L聚凝胺（5g/L），于37、5%CO2恒温培养箱中培养2 4h，然后更换为完全培养基继续培养7 2 h。采用Q-PCR和Westernblot检测RNF44的基因和蛋白表达效率,确认RNF44基因过表达慢病毒转染AGS细胞株是否构建成功。1.2.5RNF44基因过表达慢病毒转染AGS 细胞株增殖、凋亡和AKT信号蛋白的测定：按1.2.2方法构建RNF44基因过表达慢病毒转染AGS细胞株，各组细胞转染后2 4h，更换为完全培养基，继续进行培养，采用CCK-8测定细胞增殖情况，采用流式细胞术检测细胞调亡情况,采用Westernblot检测RNF44、A K T 和p-AKT蛋白的表达。1.2.6AKT通路抑制剂LY294002对RNF44基因过表达AGS细胞株增殖、凋亡和 AKT信号蛋白影响的测定：按1.2.2 方法构建RNF44基因过表达慢病毒转染AGS细胞株，各组细胞转染后24h，更换为分别含AKT通路抑制剂LY294002（2 0 mol/L)或溶媒（Vehicle）完全培养基，继续进行培养,采用CCK-8测定细胞增殖情况,采用Q-PCR和Westernblot检测相关蛋白表达效率。1.2.7MKN45细胞株构建的裸鼠皮下瘤模型实第2 7 卷第19 期验：12 只裸鼠随机分为 shNC 组（n=6）和shRNF44组（n=6）。各组裸鼠酒精棉球消毒，shNC组裸鼠于腋下皮下接种MKN45细胞100 L(210个），shRNF44 组裸鼠于腋下皮下接种RNF44干扰后的MKN45细胞10 0 L（2 10 个）。接种后将不同组别的裸鼠分笼饲养,定期喂水和饲料,定期更换垫料。待注射细胞1周后，每3d游标卡尺测量肿瘤大小。接种33d时处死,取出肿瘤组织称重并拍照,将肿瘤组织分为2 个部分，分别进行免疫荧光染色实验和West-ernblot实验。免疫荧光染色实验：将肿瘤组织置于10%福尔马林中固定48 h，流动冲洗后，采用梯度浓度乙醇（50%7 0%8 5%9 5%100%）进行退水，脱水后经二甲苯透明（2 h2次）、浸蜡、包埋、常规切片、烤片，二甲苯脱蜡,采用梯度浓度乙醇（10 0%9 5%8 5%7 5%）进行水化,经柠檬酸钠缓冲溶液高压修复,滴加一抗于4孵育过夜,滴加二抗,室温孵育1h，加人经DAPI稀释后的防淬灭封片剂封片,荧光显微镜下观察拍片（放大倍数40 0 倍）。另一部分于-20冻存,后续采用Westernblot检测肿瘤组织 RNF44、A K T、p-A K T 蛋白的表达。1.2.8CCK-8检测细胞增殖实验：各组细胞慢病毒转染后更换为完全培养基，调整细胞悬液浓度110 4个/mL），于37、5%CO，恒温培养箱中进行培养,分别在0、12、2 4、48、7 2 h后,加人CCK-8试剂继续培养1h，用酶标仪测定450 nm波长吸光度,计算各组细胞的增殖率。1.2.9流式检测细胞调亡实验：各组细胞慢病毒转染后更换为完全培养基，调整细胞悬液浓度（110 4个/mL），于37、5%CO2恒温培养箱中培养7 2 h，以预冷后的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3遍,离心（10 0 0 g5min）、弃上清,收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取510 4 个重悬细胞,离心（10 0 0 g5min），弃上清,加人19 5 L结合缓冲液重悬细胞,分别加人AnnexinV-FITC10L和碘化丙啶（PI）5L进行染色，避光室温孵育15min，置于冰浴,用流式细胞仪检测调亡情况。1.2.10Q-PCR实验：各组细胞慢病毒转染后更换为完全培养基,调整细胞悬液浓度(110 4个/mL)，于37、5%CO2恒温培养箱中培养7 2 h，用PBS清洗细胞后采用TRIzol试剂提取RNA。采用酶标仪检测2 6 0 nm和2 8 0 nm处的吸光度值(OD260mm/OD280mm：1.8 2.0)。参照逆转录试剂实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in Practice盒说明书,将RNA逆转录为cDNA。逆转录条件为：37,15min;85,5s；410 m in。取cDNA2L、上游及下游引物各1 L、T B G r e e nPremix Ex TaqTMI 12.5L和灭菌水8.5L组成的反应体系,按照SYBR GreenqPCR试剂盒说明书进行qRT-PCR。PCR条件：9 5变性15s，60退火6 0 s，7 2 6 0 s，共40 个循环，7 2 延展5min。以 GAPDH作为内参，采用2-Ct法计算RNF44mRNA的相对表达量。1.2.11Westernblot实验：各组细胞慢病毒转染后更换为完全培养基,调整细胞悬液浓度（110 4个/mL），于37、5%CO恒温培养箱中培养72h，加人RIPA裂解液冰上裂解，离心，收集上清液。BCA法进行蛋白定量，于-2 0 保存。将蛋白样品于恒温水浴锅中煮沸5min变性。取蛋白上清液50 g于SDS-PACE凝胶恒压（12 0 V)电泳2 h，转移至PVDF膜(0.3A2h），于3%脱脂奶粉中室温封闭2 h，T BST 溶液洗膜（10 m i n/次3次），分别滴加一抗溶液p-Cdc2、Cdc2、P-A K T、A K T、p-PI3K、PI3K、p-M T O R、M T O R及 GAPDH孵育，于4 过夜，TBST溶液洗膜（10 m in/次3次）,再与相应二抗室温孵育1h。TBST溶液洗膜（10 min/次3次）,用ECL plus试剂发色液显色，化学发光信号采用ChemiDocMP凝胶成像系统检测。1.3统计学分析采用SPSS22.0软件进行统计分析。各组数据以均值标准差表示，数据采用单因素方差分析。P0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1不同胃癌细胞株RNF44 的基因和蛋白的表达水平不同胃癌细胞株RNF44 的基因和蛋白的表达水平不同，RNF44的基因和蛋白的表达水平呈正相关（r=0.994，P 0.0 5），其中 GES-1细胞株RNF44的基因和蛋白表达水平最低，MKN45细胞株RNF44的基因和蛋白表达水平最高,见图1、图2。2.2RNF44基因干扰慢病毒转染MKN45细胞株的构建MKN45细胞株经RNF44基因干扰慢病毒转染后，RNF44 的基因和蛋白表达水平降低,差异有统计学意义（P0.05），说明RNF44基因干扰慢病毒转染MKN45细胞株的构建成功，见图3、图4。4320图1不同胃癌细胞株RNF44基因表达水平（n=6)RNF44GAPDH意义（P0.05），见图7；培养7 2 h时,细胞早期和晚期凋亡率均增加,差异有统计学意义（P0.05），见图8；RNF44基因干扰慢病毒转染MKN45细胞株RNF44和p-AKT蛋白表达水平降低,差异有统计学意义（P0.05），见图9。1.2卜0.90.60.30图3RNF44基因慢病毒转染MKN45细胞株后RNF44基因的表达(n=6)实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in Practice2.3RNF44基因过表达慢病毒转染AGS细胞株的构建AGS细胞株经RNF44基因过表达慢病毒转染后（oeRNF44 组），RNF44的基因和蛋白表达水平升高,差异有统计学意义（P0.05），表明RNF44基因过表达慢病毒转染AGS细胞株的构建成功,见图5、图6。2.4RNF44基因干扰慢病毒转染MKN45细胞株增殖、细胞凋亡和AKT信号通路蛋白的表达RNF44基因干扰慢病毒转染MKN45细胞株AGSMGC-803MKN28MKN45AGSMGC-803MKN28 MKN45GES-1图2 不同胃癌细胞株RNF44蛋白表达水平(n=6)*Control组shNC组与 shNC组比较，*P0.05。第2 7 卷GES-1增殖培养48、7 2 h增殖能力降低，差异有统计学1.251.00HdV/华日45 kDa0.7537 kDa0.500.2502.5RNF44基因过表达慢病毒转染AGS 细胞株增殖、细胞凋亡和AKT信号通路蛋白的表达RNF44基因过表达慢病毒转染AGS细胞株增殖培养48、7 2 h增殖能力增加,差异有统计学意义（P0.05）,见图10；培养7 2 h时,细胞早期和晚期凋亡率均降低，差异有统计学意义（P0.05），见图11；培养7 2 h时,RNF44基因干扰慢病毒转染MKN45细胞株RNF44和p-AKT蛋白表达水平增加,差异有统计学意义（P0.05），见图12。2.6AKT通路抑制剂对RNF44基因过表达AGS细胞株增殖、凋亡和相关信号通路的影响AKT抑制剂(LY294002)可使正常AGS细胞或RNF44基因过表达AGS 细胞株增殖能力降低,细胞ShRNF44组早期和晚期凋亡率均升高，P-AKT蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义（P0.05），见图13、图14、图15。AGSMGC-803MKN28MKN45GES-1第19期实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in Practice 27:1.20.60.9RNF4445kDaGAPDH37 kDaControl组shNC组ShRNF44组与shNC组比较，*P0.05。图 4RNF44基因慢病毒转染 MKN45 细胞株后 RNF44蛋白的表达(n=6)840图5RNF44基因过表达慢病毒转染MKN45细胞株后RNF44基因的表达(n=6)2.7MKN45细胞株构建的裸鼠皮下瘤模型实验实验结束时，shRNF44组裸鼠肿瘤组织大小0.3*和质量均较shNC组降低，差异有统计学意义（P 0.0 5），见图16；免疫荧光染色结果显示，shRNF44组裸鼠肿瘤组织 Ki-67表达较 shNC 组降低,差异有统计学意义（P0.05），见图17；Westernblot检测结果显示，shRNF44组裸鼠肿瘤组织RNF44和p-AKT蛋白表达较shNC组降低，差异有统计学意义（P0.05），2 组裸鼠肿瘤组织AKT蛋白表达基本一致,见图18。Control组Vector组与Vector组比较，*P0.05。Control组OeRNF44组3 讨 论针对胃癌的治疗手段包括手术切除、化疗以及放疗等。目前,手术被认为是唯一的根治性治疗方法。尽管胃癌的治疗已取得较好的进展，但因其存在确诊晚、复发、化疗副作用和耐药等问1.2FshNC组ShRNF44组*0.90.6RNF44GAPDH题,导致整体治疗效果不理想12 。研究开发预防胃癌复发和转移的治疗手段也成为了推动癌症治疗的重大挑战13。因此,深入分析胃癌发生、发展的分子机制，寻找新的治疗靶点,不断开发新的治疗方案,对提高胃癌患者的生存率极为重要14-5泛素作为一种在真核生物中普遍存在的小分子调节蛋白,可在翻译后水平修饰底物蛋白,参与45 kDa37 kDaControl组Vector组oeRNF44组与Vector组比较，*P0.05。图 6 RNF44基因过表达慢病毒转染 MKN45细胞株后 RNF44蛋白的表达(n=6)0.30细胞的增殖、分化、调亡及DNA修复等生理活动的调控16 ，其介导的底物传递过程需要泛素激活酶E1、泛素结合酶E2及泛素连接酶E3的共同参与17 。泛素连接酶E3可被分为RING家族、HECT家族及RBR家族，其中RING家族成员众多,是最大的泛素连接酶家族，RING家族中RNF2、RNF6、RNF43、RNF12 8、RNF18 0 与胃癌的Control组Vector组OeRNF44组282.01.51.00.50与shNC组(空载组)比较，*P0.05。图7RNF44基因干扰慢病毒转染MIKN45细胞株增殖情况(n=6)107JQ10.207%106105104103102Q410194.4%TT102103104105106 107Comp-FL1-A:FITC-AshNC组RNF44GAPDHAKTP-AKTGAPDH患者,并且细胞实验证明RNF128通过泛素化稳定Axinl蛋白抑制胃癌的发生发展。另外，RNF180可抑制胃癌细胞的生长、增殖能力，促进胃癌细胞凋亡2 。RNF44是由LIYY等8 于2 0 17 年发现的一种新的 E3泛素连接酶,该蛋白负责 BRAF 抑制剂耐药黑色素瘤细胞中,AMPK-1 的降解,并且ERK/AKT过度激活诱导转录因子CREB而导致RNF44表达上调。LUOFF等9 研究发现,口腔鳞状细胞癌组织和SCC-9细胞中RNF44 的表达上调，实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in PracticeshNC组发生、发展或临床预后相关。ZHANGJF 等18 研+ShRNF44组究显示，胃癌细胞中RNF2 mRNA和其蛋白水平*明显增加,敲除RNF2可抑制胃癌细胞的活力并诱导G,期细胞周期停滞,并上调细胞周期相关基因p21和p27的mRNA及其蛋白水平。RNF6在胃癌组织中表达水平均有增高,还可促进胃癌细胞的增殖19。RNF43在胃癌组织高表达，并且RNF43高表达与患者发生远处转移、淋巴结转移人11224时间/h0.672%Q2Q34.72%图8RNF44基因干扰慢病毒转染MKN45细胞凋亡情况(n=6)45 kDa37 kDa56kDa56kDa37 kDashNC组ShRNF44组图9RNF44基因干扰慢病毒转染MKN45细胞RNF44、A K T 和p-AKT蛋白情况(n=6)第2 7 卷3648107Q10.447%106102Q410171.1%102103104105106107Comp-FL1-A:FITC-AshRNF44组与 shNC 组(空载组)比较，*P0.05。1.61.20.80.40与shNC组比较,*P0.05。特别在SCC-9耐药细胞中表达更高，降低RNF44表达可通过下调miR-125a-5p而逆转SCC-9耐药细胞对顺铂耐药性和细胞糖酵解作用。本研究结果显示，胃癌AGS、M G C-8 0 3、MKN28、M K N45细胞株以及正常胃黏膜CES-1细胞中RNF44的基因和蛋白表达水平不同,其中GES-1细胞株RNF44 的基因和蛋白表达水平最低，MKN45细胞株RNF44的基因和蛋白表达水平最高，说明RNF44可能参与胃癌细胞的发生和6072和总生存期显著缩短相关，因此成为胃癌侵袭、转移和不良预后的原因之_2 0 。路德荣等2 1 研究发现，RNF128低表达的胃癌患者总生存期、首次进展生存期、无进展生存期低于RNF128高表达1.65%Q2Q326.8%RNF4430%/率之明20100*早期shNC组shRNF44组AKT.shNC组shRNF44组*晚期*P-AKT第19期3210与Vector组(空载组)比较，*P0.05。图10 RNF44基因过表达慢病毒转染AGS细胞株增殖情况(n=6)107Q10.010%106101010310210410198.0%102103104 105106 107Comp-FL1-A:FITC-AVector组RNF44GAPDHAKTP-AKTGAPDH实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in Practice发展。细胞的异常增殖是恶性肿瘤最重要的特征Vector组OeRNF44组112图12 RNF44基因过表达慢病毒转染AGS细胞RNF44、A K T 和p-AKT蛋白情况（n=6)29之一，细胞实验结果显示，MKN45细胞株经*RNF44基因干扰慢病毒转染后，RNF44 的基因和蛋白表达水平显著降低,同时培养48、7 2 h时细胞增殖能力显著降低（P0.05），A G S细胞株经RNF44 基因过表达慢病毒转染后，RNF44 的基因和蛋白表达水平显著升高，同时培养48、7 2 h时细胞增殖能力显著增加,并且加入AKT抑制剂可抑2436时间/hQ20.042%Q31.93%TTT图11RNF44基因过表达慢病毒转染AGS 细胞凋亡情况(n=6)Vector组OeRNF44组与空载组（Vector组）比较，*P0.05。48107Q10.010%10610104103102Q410198.0%102103104105106107Comp-FL1-A:FITC-AOeRNF44组与Vector组（空载组）比较，*P0.05。45kDa37 kDa56kDa56kDa37 kDa6072制细胞增殖能力,说明RNF44可显著调节胃癌细胞的增殖作用。在裸鼠实验中,shRNF44 组裸鼠肿瘤组织大小和质量均较shNC组显著降低，Ki-67表达较shNC组显著降低，进一步证实RNF44可Q20.042%/率工5.0Q32.51.93%01.61.20.80.40RNF447.5*Vector组OeRNF44组早期晚期Vector组OeRNF44组AKT*P-AKT321.Vehicle组LY294002组A:Vector*工321Vehicle组LY294002组B:oeRNF4*?0图13AKT通路抑制剂对正常AGS细胞株（A：V e c t o r）和RNF44基因过表达慢病毒转染AGS细胞株241203648时间/h与Vehicle组（溶媒组)比较，*P0.05。(B：0 e RNF44)增殖影响的测定结果(n=6)6072122436时间/h4860723010710010103102Q494.8%101102103104105106107Comp-FL1-A:FITC-AVector+Vehicle107Q10.041%10610102Q471.7%101102103104105106107Comp-FL1-A:FITC-AVector+LY294002图14AKT通路抑制剂对正常AGS细胞株（A：Ve c t o r）和RNF44基因过表达慢病毒转染AGS细胞株(B：o e RNF44）VectorVehicle组LY294002组Vehicle组LY294002组AKTP-AKTGAPDH图15AKT通路抑制剂对正常AGS细胞株(Vector)和RNF44基因过表达慢病毒转染AGS 细胞株ShNC组ShRNF44组456739101实用临床医药杂志Journal of Clinical Medicine in PracticeQ2107Q10.589%0.010%1061010109元Q3102Q44.56%97.8%10110210310