基于HPLC指纹图谱、多指标定量检测及化学计量学的痢泻灵片质量评价.pdf

86江西中医药大学学报 2023 年 10 月第 35 卷第 5 期JOURNAL OF JIANGXI UNIVERSITY OF CM 2023 Vol.35 No.5中药研究基于 HPLC 指纹图谱、多指标定量检测及化学计量学的痢泻灵片质量评价 苏星1 陈剑平1 胡娇娇2 黄静萍1 黄恩堂1（1.鹰潭市综合检验检测中心 江西 鹰潭 335000；2.江西省药品检查员中心 南昌 330029）摘要目的：建立指纹图谱、多指标含量测定与化学计量相结合的痢泻灵片质量评价方法。方法：采用 Eclipse plus C18色谱柱（4.6 mm150 mm，5 m）；流动相为乙腈-0.01 mol/L 乙酸铵溶液（浓氨试液调 pH 8.1）和 0.01 mol/L 醋酸铵溶液（浓氨试液调 pH 8.1），梯度洗脱。以此条件建立 10 批痢泻灵片的指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行相似度评价，并通过 SPSS 25.0 软件对其进行聚类分析和主成分分析。同时，以此为基础，对痢泻灵片中苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯含量进行测定。结果：建立了痢泻灵片的 HPLC 指纹图谱，共标定出 13 个共有峰，10 批痢泻灵片的相似度为 0.9210.997，苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量分别为 77.5302.8 g/g、4.0171.7 g/g、86.0160.7 g/g、2.940.3 g/g。结论：所建立的痢泻灵片的 HPLC 指纹图谱和定量分析方法结果准确可靠，可为痢泻灵片质量评价和监管提供依据。关键词痢泻灵片；指纹图谱；相似性评价中图分类号：R284 文献标志码：AQuality Evaluation of Lixieling Tablets Based on Combinative Methods of HPLC Fingerprint,Quantitative Analysis of Multi-components and Chemometrics AnalysisSU Xing1,CHEN Jian-ping1,HU Jiao-jiao2,HUANG Jing-ping1,HUANG En-tang11.Yingtan Comprehensive Testing Center,Yingtan 335000,China;2.Jiangxi Provincial Drug Inspector Center,Nanchang 330029,China.Abstract Objective:To establish a quality evaluation method of Lixieling Tablet based on HPLC fingerprints,quantitative analysis of multi-components and chemometrics analysis.Methods:The HPLC fingerprints of Lixieling tablets was performed on Eclipse plus C18 column(4.6 mm150 mm,5 m),with acetonitrile-0.01 mol/L ammonium acetate solution(using strong ammonia solution to regulate pH in 8.1)and 0.01 mol/L ammonium acetate solution(using strong ammonia solution to regulate pH in 8.1)used as mobile phase A and B for gradient elution,respectively.Similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM was used to evaluate the fingerprints and SPSS 25.0 software was used for statistic analysis.With these basises,the contents of matrine,oxymatrine,andrographolide and dehydroandrographolide were determined.Results:The HPLC fingerprints of 10 batches of LiXieLing tablets purchased from the market was established.The similarity was between 0.921-0.997,and 13 common peaks were marked.The content of matrine,oxymatrine,andrographolide and dehydroandrographolide were in the range of 77.5-302.8 g/g,4.0-171.7 g/g,86.0-160.7 g/g and 2.9-40.3 g/g,respectively.Conclusions:The combination methods of HPLC fingerprint and simultaneous determinations of multiple components are accurate,stable and reproducible,which can provide reference for the quality evaluation and administrative supervision of Lixieling tablets.Key words Lixieling Tablets;Fingerprint;Similarity Evaluation基金项目：鹰潭市科技局科技计划项目（Ykz2018004）。痢泻灵片是由拳参、穿心莲、苦参 3 味中药组成的中成药，具有清热解毒、止痢、止泻的功效，用于热泻、湿热痢疾等症1。痢泻灵片现收载于国家卫生部药品标准中药成方制剂（第二册），仅有检查项目，无专属鉴别检查和含量测定方法。近些年对痢泻灵片的检验方法研究较少，文献也并不多见。现行的痢泻灵片文献报道多针对其中的12 种成分进行含量测定研究2-5，而中成药复方制剂具有多成分、多靶点，成分间相互协调、相互制约，整体作用等特点，现有的单成分质量控制方法难以全面反映其整体质量。中药指纹图谱是目前综合评价中药及其制剂87贺爱平等：麻黄连翘赤小豆汤治疗皮肤病临床运用举隅中药研究的常用方法，具有整体性好、信息量大、特征性强等特点6，结合聚类分析、主成分分析等化学计量学分析方法可为中药、特别是中成药复方制剂的质量评价提供更多的、更多维的信息。本研究首次将中药指纹图谱技术与 HPLC 法定量测定及化学计量学分析法相结合，用于痢泻灵片的质量控制，通过中药指纹图谱相似度评价软件对不同厂家不同批次的痢泻灵片指纹图谱相似度进行评价，同时采用聚类分析和主成分分析法对10 批痢泻灵片的质量进行分析。在此基础上建立了一个同时测定痢泻灵片中苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量测定方法，为更好地对痢泻灵片质量进行监管和控制提供依据。1 仪器与试药1.1 仪器Agilent1260 型高效液相色谱仪（四元泵，UV检测器，美国 Agilent 公司）；MSE125P-1CE-DU型电子天平（精度 0.01mg，赛多利斯科学仪器北京 有限公司）；MSE224S-1CE-DU 型电子天平（精度 0.1mg，赛多利斯科学仪器北京有限公司）；KQ-500DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。1.2 试剂与试药甲醇、乙腈均为色谱纯；其他试剂均为分析纯，水为超纯水。对照品：苦参碱（批号：110805-201709，质量分数为 98.7%）、氧化苦参碱（批号：110780-201508，质量分数为 92.5%）、穿心莲内酯（批号：110797-201609，质量分数为 99.7%）、脱水穿心莲内酯（批号：110854-201710，质量分数为 99.4%）。对照药材：苦参（批号：121019-201708）、穿心莲（批号：121082-201706）、拳参（批号：121569-201602）。对照品及对照药材均购自中国食品药品检定研究院，10 批痢泻灵片均购自市场。见表 1。表1 10批痢泻灵片的具体信息编号生产厂家批号规格包装规格S1吉林省正和药业集团股份有限公司191001每片重 0.4g12 片 3 板/盒S2吉林省正和药业集团股份有限公司200103每片重 0.4g12 片 3 板/盒S3吉林玉仁制药股份有限公司190601每片重 0.4g12 片 4 板/盒S4吉林省康福药业有限公司20190101每片重 0.4g24 片 1 板/盒S5吉林省康福药业有限公司20180904每片重 0.4g15 片 2 板/盒S6吉林省康福药业有限公司20200203每片重 0.4g15 片 2 板/盒S7吉林省康福药业有限公司20200501每片重 0.4g15 片 2 板/盒S8吉林玉仁制药股份有限公司200502每片重 0.4g12 片 4 板/盒S9吉林玉仁制药股份有限公司190401每片重 0.4g12 片 3 板/盒S10吉林玉仁制药股份有限公司200205每片重 0.4g12 片 4 板/盒2 方法与结果2.1 色谱条件色谱柱：AgilentEclipseplusC18色谱柱（5m，4.6mm150mm）；以乙腈-0.01mol/L 乙酸铵溶液（浓氨试液调 pH8.1）（32）为流动相 A，0.01mol/L醋酸铵溶液（用氨试液调 pH8.1）为流动相 B，梯度洗脱（010min，5%10%A；1030min，10%25%A；3045min，25%40%A；4570min，40%50%A；7080min，50%55%A；8090min，55%60%A；9095min，60%5%A）；流速为 1.0mL/min；检测波长为 225nm；柱温为 25；进样量为 10L。在该条件下，混合对照品溶液及痢泻灵片样品溶液的 HPLC 色谱图见图 1。2.2 混合对照品溶液的制备取苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品适量，加甲醇溶解并稀释成浓度分别为 0.0985、0.0767、0.0184、0.0202mg/mL 的对照品混合溶液。2.3 供试品溶液的制备取本品 20 片，除去包衣，研成细粉，精密称取2.400g，置具塞锥形瓶中，精密加入三氯甲烷 50mL及氨水 1mL，密塞，称定重量，超声处理 30min，放冷，再称定重量，用三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液 10mL，加在中性氧化铝柱（200300 目，8g，内径 15mm）上，用15mL 三氯甲烷洗脱后，继续用三氯甲烷-甲醇（37）15mL 洗脱，合并洗脱液，挥去溶剂，残渣用甲醇溶解并定容至 10mL，摇匀，用 0.45m 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。2.4 苦参和穿心莲阴性样品的制备按处方比例分别配制苦参和穿心莲阴性样品，照“2.3”项下的供试品制备方法进行处理，即得苦参和穿心莲阴性样品。苏星等：基于 HPLC 指纹图谱、多指标定量检测及化学计量学的痢泻灵片质量评价88江西中医药大学学报 2023 年 10 月第 35 卷第 5 期中药研究注：A.样品；B.混合对照品；C.苦参阴性样品；D.穿心莲阴性样品。图1 典型液相色谱图2.5 单味药材供试品溶液的制备取苦参、穿心莲、拳参粉末各 2.4g，按照“2.3”项下的供试品制备方法进行处理，即得各单味药材供试品溶液。2.6 指纹图谱研究2.6.1精密度试验取同一痢泻灵片供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件连续进样测定6 次，记录色谱图，以 9 号穿心莲内酯色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间 RSD值在 0.11%4.76%之间，相对峰面积 RSD 值在1.30%3.06%之间，均 5%，表明仪器精密度良好。2.6.2重复性试验取痢泻灵片适量，按“2.3”项下方法平行制备 6 份供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，记录色谱图，以 9 号穿心莲内酯色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间 RSD 值在 0.18%4.58%之间，相对峰面积 RSD 值在 0.44%1.05%之间，表明该方法的重复性良好。2.6.3 稳定性试验 取同一痢泻灵片供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，分别于 0、2、4、6、8、10、12、24h 进样，记录色谱图，以 9 号穿心莲内酯色谱峰为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间 RSD 值在 0.40%4.68%之间，相对峰面积RSD 值在 1.13%3.67%之间，表明供试品溶液在24h 内稳定性良好。2.6.4指纹图谱的建立取 10 批痢泻灵片样品溶液，进样测定，将数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，以 1 号样品色谱图为参照图谱，采用平均数法，经全谱峰匹配，生成对照图谱（R），10 批痢泻灵片指纹图谱与对照图谱的相似度分别为 0.996、0.996、0.963、0.921、0.996、0.996、0.997、0.997、0.997、0.997，符合指纹图谱研究要求。见图 2。图2 10批痢泻灵片HPLC指纹图谱（S1S10）和对照指纹图谱（R）89贺爱平等：麻黄连翘赤小豆汤治疗皮肤病临床运用举隅中药研究取单味药材溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图，见图 3。结合前述苦参与穿心莲阴性样品的色谱图，对痢泻灵片样品溶液色谱图中的峰进行归属，共确定了 13 个共有峰，其中18 来自苦参，912 来自穿心莲，13 号峰未进行归属。注：A.苦参；B.穿心莲；C.拳参。图3 单味药材溶液的HPLC色谱图2.6.5 聚类分析 将 10 批痢泻灵片的共有峰峰面积导入 SPSS25.0 软件进行聚类分析6-7，采用系统聚类法，10 批痢泻灵片可以分为 3 类，S4、S5、S6、S7为第 1 类，S3、S8、S9、S10为第 2 类，S1和S2为第 3 类，这与表 1 中 10 批样品的生产厂家来源相符，说明相同厂家生产的痢泻灵片的质量稳定，而不同生产厂家不同批次痢泻灵片的质量存在差异，这可能与厂家所用中药材的产地、采收时间、加工、运输、存储有关。见图 4。图4 10批痢泻灵片的聚类分析图2.6.6 主成分分析 采用SPSS25.0 统计分析软件将 10 批痢泻灵片 13 个共有峰的峰面积做标准化处理后，以主成分的特征值和贡献率为依据，对其进行主成分分析7。为使分析结果更加直观，主成分分析选取3个主成分，特征值分别为7.141、4.465、1.159，累积方差贡献率分别是 54.929%、89.272%、98.184%。见表 2。表2 特征值和方差贡献率主成分因子特征值方差贡献率/%累计方差贡献率/%17.14154.92954.92924.46534.34389.27231.1598.91298.184痢泻灵片特征图谱主成分分析得到因子矩阵 A，根据计算公式 Ui=Ai/i得到主成分载荷矩阵 U，将 10 批痢泻灵片 HPLC 指纹图谱 13 个共有峰的峰面积标准化处理后得到原始变量的标准 分X1X13，根 据 U1、U2、U3和 X1X13计 算 主成分 Z1、Z2、Z3得分，计算公式为 Z1=U1(1)X1+U1(2)X2+U1(13)X13；Z2=U2(1)X1+U2(2)X2+U2(13)X13；Z3=U3(1)X1+U3(2)X2+U3(13)X137。10 批痢泻灵片根据主成分得分 Z1、Z2、Z3作散点图分析其聚类结果。主成分分析聚类结果见图 5，在主成分空间中距离较近的为同类样本，距离较远的为不同类样本。结果表明 10 批痢泻灵片中，S4S7聚在一起为一类，S8、S9、和 S10距离极近，归为一类，S3距离 S8S10更近，S1和 S2距离其他样本均较远，此结果与聚类分析结果较一致。苏星等：基于 HPLC 指纹图谱、多指标定量检测及化学计量学的痢泻灵片质量评价90江西中医药大学学报 2023 年 10 月第 35 卷第 5 期中药研究图5 10批痢泻灵片主成分分析散点图2.7 4 种组分的含量测定2.7.1线性关系考察精密吸取混合对照品溶液适量，按“2.1”项下的色谱条件依次进样 2、5、10、15、20、25L，记录色谱峰面积，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。所测的4 种成分在各自的进样量范围内与峰面积的线性关系良好。见表 3。表3 痢泻灵片中4种成分的线性关系成分回归方程r线性范围/g苦参碱Y=327.32X+0.13180.99990.1972.463氧化苦参碱Y=466.10X+0.06540.99990.1531.917穿心莲内酯Y=2145.00X+31.59801.00000.1632.034脱水穿心莲内酯Y=5520.10X+15.61301.00000.0400.5052.7.2 精密度试验 取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定 6 次，记录色谱图，计算得到苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯峰面积的 RSD 值分别为 0.53%、0.92%、0.36%、0.53%，表明仪器的精密度良好。2.7.3重复性试验取痢泻灵片适量，按“2.3”项下方法平行制备 6 份供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，计算得到上述 4 种成分含量，RSD 值分别为 2.65%、2.14%、2.32%和 2.33%，表明该方法重复性良好。2.7.4稳定性试验取痢泻灵片供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件分别于 0、2、4、6、8、10、12、24h 进样测定，记录色谱图，计算得到上述4种成分峰面积RSD分别为0.99%、1.71%、0.64%、0.68%，表明供试品溶液在 24h 内稳定性良好。2.7.5 加标回收率试验 称取已知含量的样品 6 份（1 号样品，含量为含苦参碱 0.287mg/g，含氧化苦参碱 0.129mg/g，穿心莲内酯 0.125mg/g，脱水穿心莲内酯 0.012mg/g），每份 1.200g（供试品称样量的1/2），分别精密加入适量浓度的混合对照品溶液（含0.3877mg/mL 苦参碱，0.1787mg/mL 氧化苦参碱，0.1834mg/mL穿心莲内酯和 0.0131mg/mL脱水穿心莲内酯）1mL，按供试品溶液的制备方法操作，并按“2.1”项下的色谱条件进样，记录色谱图，计算回收率，苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的平均回收率分别为 104.7%、96.1%、108.2%、92.2%，RSD 分别为 2.76%、2.27%、3.25%和 1.97%，符合中国药典 要求，表明该方法准确性良好。见表 4。表4 4种成分加标回收率试验结果序号峰面积样品重量/g 样品中含量/g 加入量/g 测得量/g 回收率/%回收率均值/%RSD/%平均回收率/%苦参碱1251.6591.2030364.32387.70768.44104.24104.242.76104.72258.2731.2098366.38387.70788.65108.92108.923249.4681.2058365.16387.70761.75102.29102.294255.9381.2027364.22387.70781.52107.63107.635250.6841.2061365.25387.70765.47103.23103.236249.2331.2071365.56387.70761.03102.01102.01氧化苦参碱1157.8171.2030163.02178.70338.4598.1798.172.2796.12158.6471.2098163.94178.70340.2398.6598.653158.9361.2058163.39178.70340.8599.3099.304155.2961.2017162.84178.70333.0495.2495.245154.2081.2061163.44178.70330.7193.6093.606156.4021.2011162.76178.70335.4196.6296.62穿心莲内酯1793.4961.2030149.74183.45355.20112.00112.003.25108.22792.1551.2098150.59183.45354.57111.19111.193774.3501.2058150.09183.45346.27106.94106.944755.6701.2027149.71183.45337.56102.40102.405775.2451.2061150.13183.45346.69107.15107.156785.5981.2071150.25183.45351.52109.71109.71脱水穿心莲内酯1159.7901.203013.8813.1226.1293.3093.301.9792.02159.3631.209813.9513.1226.0492.1292.123159.5211.205813.9113.1226.0792.6992.694156.1911.202713.8713.1225.4788.3688.365159.4241.206113.9113.1226.0592.5392.536159.7001.207113.9213.1226.1092.8292.8291贺爱平等：麻黄连翘赤小豆汤治疗皮肤病临床运用举隅中药研究2.7.6 样品测定 精密称取痢泻灵片粉末，按“2.3”项下方法制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算样品中苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量。见表 5。表5 痢泻灵片中4种成分的含量测定结果 g/g样品编号苦参碱氧化苦参碱 穿心莲内酯脱水穿心莲内酯S1302.8135.5124.511.5S2285.2171.7160.718.1S3115.54.0112.513.4S477.547.6133.736.6S584.459.7154.140.3S683.758.7153.340.0S782.654.4151.639.4S8212.845.486.02.9S9217.946.587.43.1S10214.445.186.13.23 讨论3.1 检测波长的选择查阅文献2-4，并进行预实验显示，痢泻灵片中苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的最大吸收波长在 219、339、224、249、214nm，通过比较各波长下的色谱图发现，检测波长为 225nm 时，痢泻灵片色谱图中色谱峰最多，分离度也适合，并且各特征峰的峰型较好，故而在进行指纹图谱研究时选择 225nm 为检测波长。3.2 色谱条件的选择前期查阅文献，2015 年版中国药典一部中苦参的含量测定采用的是氨基柱，而 2020 年版中国药典一部采用的是 C18柱梯度洗脱，尝试药典的两种方法以及一些文献方法2-5，结果发现采用氨基柱的方法重现性差，而 C18柱梯度洗脱法的结果重现性较好，结果较为稳定，根据峰分离情况，选择 C18柱及梯度洗脱的方法。3.3 供试品制备方法的选择分别对提取溶剂（甲醇、乙醇或三氯甲烷）、提取方法（加热回流或超声）和最后中性氧化铝柱的洗脱溶剂（不同比例甲醇和三氯甲烷混合溶液）进行考察，比较 4 个待测组分的峰面积，最终选定“2.3”项下的样品制备方法。3.4 指纹图谱及含量测定本研究建立了痢泻灵片的 HPLC 指纹图谱，共发现 13 个共有峰，与对照品进行比对，指认出其中的 4 个，10 批痢泻灵片与对照图谱之间的相似度均高于 0.9，所建立的指纹图谱方法稳定可靠。10 批痢泻灵片的含量测定结果存在较大的差异，苦参碱、氧化苦参碱、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的含量分别是 77.5302.8g/g、4.0171.7g/g、86.0160.7g/g、2.940.3g/g。从结果来看，不同样品间 4 种成分的含量差别较大，其中样品 3 的氧化苦参碱含量极低，样品 810 的脱水穿心莲内酯含量也极低，提示不同厂家生产中投料的药材质量参差不齐，该品种的质量需要得到更为严格的控制。综上，本研究所建立的用于控制痢泻灵片质量的 HPLC 指纹图谱和含量测定方法稳定可靠，可为其质量控制提供科学依据。参考文献1中华人民共和国药典委员会.中药成方制剂(第二册)S.北京:中华人民共和国卫生部,1990:269.2高敦宇,吴柳春,李可林,等.痢泻灵片质量标准研究 J.中成药,2007,29(3):379-383.3丁茹.双波长 HPLC 法测定痢泻灵片中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的含量 J.海峡药学,2018,30(7):77-79.4丁茹.HPLC 法测定痢泻灵片中苦参碱和氧化苦参碱的含量 J.海峡药学,2017,29(11):69-71.5杨建国,吴韶铭.HPLC 法测定痢泻灵片中穿心莲内酯的含量 J.中成药,1996,18(6):11-12.6高森,王苹,唐铖,等.基于 HPLC 指纹图谱、多指标成分含量测定及化学计量学的湿热痹片质量评价 J.中草药,2020,51(20):5454-5461.7熊贤招,彭红,黄品哲.胃脘舒颗粒 HPLC 指纹图谱研究及 6 种成分含量测定 J.中药材,2020,43(11):2740-2744.8康念欣,袁炎炎,张潇等.酒黄连 HPLC 特征图谱的建立及聚类分析和主成分分析 J.世界科学技术-中医药现代化,2020,22(8):2790-2798.（收稿日期：2021-09-12）编辑：翟兴英苏星等：基于 HPLC 指纹图谱、多指标定量检测及化学计量学的痢泻灵片质量评价