基于TLR4_NF-κB炎性轴的白芥子经皮给药对类风湿性关节炎大鼠调控机制研究.pdf

药理研究基于 TLR4/NF-B 炎性轴的白芥子经皮给药对类风湿性关节炎大鼠调控机制研究高远1,2,李冀2,韩东卫2,陈芳1(1.贵州中医药大学药学院,贵州 贵阳 550025;2.黑龙江中医药大学基础医学院,黑龙江 哈尔滨 150040)摘要 目的:探讨白芥子经皮给药通过 Toll 样受体 4/核因子-B(TLR4/NF-B)炎性轴对类风湿性关节炎(RA)大鼠的治疗作用。方法:50 只大鼠随机分为对照组(空白对照组)、模型组、阳性药组、白芥子组及白芥子+TLR4 激活剂组,每组 10 只。除对照组外,其余组制备佐剂性 RA 模型。阳性药组右后足涂抹0.27 g/kg扶他林,白芥子组涂抹 4.50 g/kg 白芥子涂剂,白芥子+TLR4 激活剂组涂抹 4.50 g/kg白芥子涂剂同时踝关节注射 0.25 mg/kg TLR4 激活剂 LPS,对照组和模型组涂抹等量的面粉糊作对照,制备模型前 3 d 开始给药,连续 18 d。测量不同时间左右后足肿胀度,末次给药后检测热痛和机械痛阈值、血清白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-(TNF-),Western blot 法检测踝关节滑膜组织中 TLR4、NF-B 蛋白表达情况。结果:与模型组比较,阳性药组、白芥子组及白芥子+TLR4 激活剂组建模不同时间右后足肿胀度均降低,其中阳性药组和白芥子组均低于白芥子+TLR4 激活剂组,白芥子组建模 9 d 右后足肿胀度低于阳性药组(P 0.05)。与模型组比较,阳性药组、白芥子组及白芥子+TLR4 激活剂组右后足热痛及机械痛阈值均升高,其中阳性药组高于白芥子组,白芥子组高于白芥子+TLR4 激活剂组(P 0.05)。与模型组比较,阳性药组、白芥子组及白芥子+TLR4 激活剂组血清 IL-1、TNF-水平及踝关节滑膜组织中 TLR4、NF-B 蛋白相对表达量均降低,其中阳性药组和白芥子组低于白芥子+TLR4 激活剂组(P 0.05)。结论:白芥子经皮给药通过抑制 TLR4/NF-B 炎性轴发挥作用,可有效治疗 RA 模型大鼠。关键词 白芥子;经皮给药;类风湿性关节炎;Toll 样受体 4;核因子-B中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1002-2392(2023)08-0017-06DOI:10.19664/ki.1002-2392.230164收稿日期:2022-07-25 修回日期:2023-04-14基金项目:国家自然科学基金地区基金项目(82260885);中国博士后科学基金项目(2020M670942)作者简介:高远(1987-),男,博士,讲师,主要从事中药经皮制剂与新剂型的开发相关研究工作。通讯作者:陈芳(1970-),女,硕士,教授,主要从事中药或中药方剂药理学、药效学研究。类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜慢性炎症、多关节进行性破坏为主要特征的自身免疫性疾病,其进展过程中伴随关节结构变化,病情迁延难愈,对患者身心均造成严重危害1-2。目前,临床主要采用非甾体抗炎药、糖皮质激素等药物治疗,短期用药可有效缓解临床症状,但长期用药副作用较多,目前尚无理想治疗药物3-4。在中医理论中,RA 属“痹症”范畴,体虚感邪、风湿瘀痹是本病的病机,应以散寒祛湿、祛风通络为治疗原则5-6。白芥子为十字花科白芥(Sinapis alba L.)的成熟种子,产自山东、四川、安徽、河南等地,其性温味辛,善走窜,有祛风通络、消肿止痛的功效。本草经疏性称其:“味极辛,气温能搜剔内外,是外用祛除风寒湿邪之要药”。现代研究发现,白芥子外敷对虚寒之证均有显著效果,包括哮喘、慢性支气管炎、风寒痹症等7-8。为探索白芥子外用经皮给药的作用机制,本研究通过建立佐剂型 RA 大鼠模型,探究白芥子经皮给药对 RA 大鼠的治疗作用,并探讨其对经典炎性通路 Toll 样受体 4/核因子-核因子-B(Toll-like receptor 4/nuclear factor-B,TLR4/NF-B)的影响,以期阐明其治疗 RA 的机制,为白芥子治疗 RA 的经皮制剂开发提供参考依据。712023 年 8 月第 51 卷第 8 期Vol.51,No.8,Aug.2023 中 医 药 学 报Acta Chinese Medicine and Pharmacology1 材料与方法1.1 实验动物50 只 SPF 级雄性 SD 大鼠,6 周龄,体质量 180 220 g,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供,生产许可证号:SCX 黑2021010,中医药伦审2021 第10 号。饲养条件:温度 20 25、湿度(45 5)%、12 h 交替照明,饲养 1 周后进行造模,取材前禁食 24 h。1.2 试药与仪器白芥子(北京同仁堂股份有限公司);扶他林(北京诺华制药有限公司,国药准字 H19990291);牛 II 型胶原、弗氏完全佐剂(美国艾美捷科技有限公司);白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-(TNF-)酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(美国 Invitrogen 公司);BCA 蛋白定量分析试剂盒(美国 Thermo Fisher Scien-tific 公司);兔抗大鼠 TLR4、NF-B 多抗(一抗,美国Abcam 公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 单抗(二抗,北京中杉金桥生物技术有限公司);ElectricVon Frey 测痛仪(上海玉研科学仪器有限公司);BME-410A 热辐射疼痛刺激仪(中国医科院工程研究所);3550UV 型酶标仪、电泳仪(美国 Bio-rad 公司)。1.3 实验分组及模型制备取 50 只大鼠随机分为 5 组,对照组(空白对照组)、模型组、阳性药组、白芥子组及白芥子+TLR4 激活剂组,每组10 只。除对照组外,其余组采用牛型胶原联合弗氏完全佐剂注射右后足底皮下法制备佐剂性 RA 大鼠模型,具体制备方法:牛型胶原溶解于0.1 mol/L的乙酸中制备终浓度为 4 mg/mL 的胶原溶液,4 搅拌均匀过夜备用;将上述溶液按照 1 1 比例滴加至弗氏完全佐剂中,充分乳化。各组腹腔注射戊巴比妥那麻醉,于右后足底皮下注射上述乳化液0.1 mL/只,对照组注射等量生理盐水。观察注射后24 h 内足部、踝关节肿胀度提示建模成功。1.4 药物制备及干预方法称取大鼠体质量,后足剃毛备皮,计算给药剂量并配制外敷制剂,白芥子购自北京同仁堂药业,粉碎机粉碎至细粉,醋调匀成糊状(配制方法依据古籍方脉正宗),另用醋调配面粉糊状为对照,均现配现用。根据药理实验方法学计算大鼠白芥子临床等效剂量为 4.50 g/kg;扶他林临床等效剂量为 0.27 g/kg。各组大鼠在右后足踝关节上 0.5 cm 处划线,线下涂药,阳性药组涂抹 0.27 g/kg 扶他林;白芥子组涂抹4.50 g/kg白芥子涂剂;白芥子+TLR4 激活剂组涂抹4.50 g/kg 白芥子涂剂同时踝关节注射 0.25 mg/kgTLR4 通路激活剂 LPS;对照组和模型组涂抹等量的面粉糊作对照涂剂;制备模型前3 d 开始给药,每日1 次,每次 20 min,清水洗去,连续 18 d。1.5 后足肿胀度测定于建模前 24 h、建模后 24 h、第 4、9、15 天分别用游标卡尺测量右后足趾厚度,计算后足肿胀度=(给药期间足趾厚度-造模前足趾厚度)/造模前足趾厚度 100%。为减少大鼠足趾弹性造成误差,以游标卡尺接触足趾皮肤开始读数,并由同一人完成测量。1.6 热痛阈值和机械痛阈值检测末次给药后 1 h 检测各组大鼠热痛阈值和机械痛阈值,检测前大鼠放于安静环境适应15 min,用热辐射右后足底,记录开始辐射至快速抬足反射的时间,即为热辐射阈值;用 Von Frey 痛阈测量仪测定机械痛阈值,刺激针垂直刺激右后足底部,记录产生抬足反射的最小刺激强度,即机械痛阈值。1.7 血清炎性因子 IL-1、TNF-水平检测热痛阈和机械痛实验结束后处死各组大鼠,腹腔静脉采血 2 mL,2 800 r/min 离心15 min,取上层血清,按照 ELISA 试剂盒说明书步骤操作,于全自动酶标仪上测定 570 nm 波长处的吸光度值,根据建立的标准曲线计算待测血清样本浓度。1.8 踝关节滑膜组织中 TLR4、NF-B 蛋白表达检测处死各组大鼠,取右侧踝关节滑膜组织,立即置于液氮中研磨,加入细胞裂解液于冰上孵育 20 min,12 000 r/min离心 15 min 取上清液,采用 BCA 法进行蛋白定量,然后将待测蛋白置于沸水水浴 10 min 变性,再次离心后取上清,进行恒定电流的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,分离胶条带经电转仪转至硝酸纤维素膜上,封闭液室温封闭 2 h,加入稀释一抗(1 500),4 孵育过夜,TBST 洗涤 3 次,5 min 后,加入稀释二抗(1 2 000),室温孵育2 h,电化学发光法显影、定影,与凝胶成像系统上扫描条带,图像分析软件分析TLR4、NF-B 条带灰度值与内参 -actin 灰度值的比值,即为蛋白相对表达量。1.9 统计学方法采用 SPSS22.0 统计软件分析数据,符合正态分布的计量资料均以(x s)表示,多样本比较采用单因素方差分析,有统计学差异的再进行两两比较,并进行SNK-q 检验。P 0.05 为差异有统计学意义。2 结果2.1 白芥子经皮给药对 RA 大鼠右后足肿胀度的影响建模 24 h、4 d、9 d、15 d 右后足肿胀度与对照组比较,各组差异均有统计学意义(P 0.05);与模型组比较,阳性药组、白芥子组及白芥子+TLR4 激活剂组81中 医 药 学 报Acta Chinese Medicine and Pharmacology 2023 年 8 月第 51 卷第 8 期Vol.51,No.8,Aug.2023建模 24 h、4 d、9 d、15 d 右后足肿胀度均降低,其中阳性药组和白芥子组均低于白芥子+TLR4 激活剂组(P 0.05),白芥子组9 d、15 d 右后足肿胀度低于阳性药组(P 0.05),见表 1。表 1 白芥子经皮给药对 RA 大鼠右后足肿胀度的影响(x s,n=10,%)组别右后足 24 h右后足 4 d右后足 9 d右后足 15 d对照组32.55 4.1031.95 4.2232.58 4.5032.41 4.59模型组62.10 5.34a64.82 5.46a81.37 7.25a85.94 2.90a阳性药组31.56 4.21ab32.57 4.23ab58.60 6.09ab62.16 1.95ab白芥子组35.28 4.06ab37.95 3.98ab43.45 5.44abc55.77 1.32abc白芥子+TLR4 激活剂组53.64 4.22abcd58.01 4.07abcd72.41 6.32abcd79.10 2.59abcd 注:与对照组比较,aP 0.05;与模型组比较,bP 0.05;与阳性药组比较,cP 0.05;与白芥子组比较,dP 0.05。2.2 白芥子经皮给药对 RA 大鼠右后足热痛阈值的影响与对照组比较,模型组右后足热痛及机械痛阈值均降低(P 0.05);与模型组比较,阳性药组、白芥子组及白芥子+TLR4 激活剂组右后足热痛及机械痛阈值均升高,其中阳性药组高于白芥子组,白芥子组高于白芥子+TLR4 激活剂组,差异均有统计学意义(P 0.05),见表 2。表 2 白芥子经皮给药对 RA 大鼠右后足热痛阈值的影响(x s,n=10)组别热痛阈值(s)机械痛阈值(g)对照组20.40 2.1337.85 2.95模型组5.31 1.04a8.90 2.01a阳性药组14.26 1.22ab26.54 3.06a白芥子组11.67 1.15abc22.18 3.17abc白芥子+TLR4 激活剂组7.48 1.36abcd12.37 2.20abcd 注:与对照组比较,aP 0.05;与模型组比较,bP 0.05;与阳性药组比较,cP 0.05;与白芥子组比较,dP 0.05。2.3 白芥子经皮给药对 RA 大鼠血清 IL-1、TNF-水平的影响与对照组比较,模型组血清 IL-1、TNF-水平均升高(P 0.05);与模型组比较,阳性药组、白芥子组及白芥子+TLR4 激活剂组血清 IL-1、TNF-水平均降低,其中阳性药组和白芥子组低于白芥子+TLR4 激活剂组(P 0.05),见表 3。2.4白芥子经皮给药对 RA 大鼠踝关节滑膜组织TLR4、NF-B 蛋白表达的影响与对照组比较,模型组 TLR4、NF-B 蛋白相对表达量均升高(P 0.05);与模型组比较,阳性药组、白芥子组及白芥子+TLR4 激活剂组 TLR4、NF-B蛋白相对表达量均降低,其中阳性药组和白芥子组低于白芥子+TLR4 激活剂组(P 0.05)。见图 1。表 3 白芥子经皮给药对 RA 大鼠血清 IL-1、TNF-水平的影响(x s,n=10)组别IL-1(pg/mL)TNF-(pg/mL)对照组45.60 10.247.51 1.64模型组364.17 43.70a38.92 2.06a阳性药组187.52 16.87ab14.10 1.87ab白芥子组180.97 20.63ab13.82 1.60ab白芥子+TLR4 激活剂组315.47 22.48abcd32.74 1.94abcd 注:与对照组比较,aP 0.05;与模型组比较,bP 0.05;与阳性药组比较,cP 0.05;与白芥子组比较,dP 0.05。3 讨论目前,类风湿性关节炎(RA)发病原因及机制尚未完全阐明,长期服用免疫抑制剂或非甾体抗炎药对机体胃肠系统造成较大伤害,且可能损害机体免疫力,不利于康复9-11。因此,寻找能有效缓解症状且不良反应小的辅助治疗方法,对 RA 疾病控制有重要意义。经皮给药是将中药或中药复方制成透皮制剂,药物经皮肤局部直接作用于病灶或者进入体循环发挥药效,中药活性成分可在局部镇痛、消炎,也可在全身调节免疫的作用,协同发挥局部及全身治疗作用,不良反应少,方便患者长期用药,治疗 RA 具有独特的优势。白芥子是芥属植物白芥的种子,具有散结通络止痛、温肺豁痰利气之功效,中医自古以来便应用白芥子治疗风湿痹症,方脉正宗普济方本草备要均有记载使用白芥子外敷于关节处进行治疗,其中记载了白芥子的两大特性。第一,外敷引起皮肤表面引起红、肿、热,因此古籍将其归类为“引赤发泡”药;第二,白芥子强大的祛风湿作用能够与艾灸相媲美,古籍称其为“天灸”“药物灸”12-13。在本次实验中,白芥子贴敷后大鼠后足部位出现泛红充血的现象,且这种现912023 年 8 月第 51 卷第 8 期Vol.51,No.8,Aug.2023 中 医 药 学 报Acta Chinese Medicine and Pharmacology象随着时间的延长,更加明显。推测这种皮肤刺激性和白芥子成分的组成、“引赤发泡”的特性息息相关。现代研究发现白芥子主要成分包括白芥子甙、芥子碱,具有消炎镇痛、调节免疫的功能。其中更为独特的是,白芥子甙经芥子酶水解后生成白芥子油(异硫氰酸对羟基苄酯),能破坏皮肤角质层结构,促进药物渗透,促进外用制剂透皮吸收14-15。李全付等16用白芥子自拟白芥子膏外敷治疗痛痹,效果显著。邵培培等17采用关联规则和复杂系统熵聚类的算法统计中药治疗RA 的用药规律,发现白芥子的出现频次、支持度、关联性均位于前 5 位,处在用药核心区域。但是目前关于白芥子治疗 RA 多见临床报道及用药规律的统计,对于其治疗的机制研究报道并不多见。注:与对照组比较,aP 0.05;与模型组比较,bP 0.05;与阳性药组比较,cP 0.05;与白芥子组比较,dP 0.05。图 1 白芥子经皮给药对 RA 大鼠踝关节滑膜组织中 TLR4、NF-B 蛋白表达的影响 型跨膜蛋白 TLR4 可通过直接或间接识别病原体,TLR4 的激活可活化下游 NF-B 进入细胞核,调控炎性介质 TNF-、IL-6 的转录、翻译等过程,炎症因子大量分泌可再次激活 NF-B,引发炎症级联反应,使机体免疫反应失调18-19。研究表明,免疫反应失调引起的炎症反应是 RA 的重要发病机制之一,TLR4/NF-B 炎性轴与 RA 发生、发展关系密切20。QIANG 等21体外研究表明,抑制 TLR4/NF-B 信号通路转导可有效抑制 RA 成纤维细胞样滑膜细胞的侵袭表型及炎症反应。XU 等22研究显示,纳曲酮可通过调节 TLR4/NF-B 信号通路抑制胶原性关节炎大鼠的炎症反应。本研究发现,白芥子组血清 IL-1、TNF-水平及踝关节滑膜组织中 TLR4、NF-B 蛋白相对表达量均低于模型组,提示白芥子经皮给药可能通过抑制 TLR4/NF-B 炎性轴发挥作用,在白芥子经皮给药基础上踝关节注射 TLR4 激活剂 LPS,使TLR4/NF-B 炎性轴通路不会受到抑制,从正反两方面考察白芥子对 TLR4/NF-B 炎性轴的作用。结果显示白芥子+TLR4 激活剂组上述指标较白芥子组均升高,且左右后足肿胀度升高、热痛及机械痛阈值降低,进一步支持白芥子经皮给药的确是通过 TLR4/NF-B炎性轴发挥作用的结论。综上所述,白芥子经皮给药可有效治疗 RA 大鼠,其治疗机制可能是通过抑制 TLR4/NF-B 炎性轴,影响其蛋白相对表达,从而发挥作用。中医药应用白芥子治疗风湿痹症已有千年历史,古代医家将其归类为“引赤发泡”药,并称其外用治疗为“天灸”,可见其经皮渗透能力之强,作用之独特。目前虽然多见临床02中 医 药 学 报Acta Chinese Medicine and Pharmacology 2023 年 8 月第 51 卷第 8 期Vol.51,No.8,Aug.2023报道,但是关于其外用治疗机制的研究尚有不足,还需通过免疫组学、代谢组学等研究方法寻找白芥子产生调控作用的通路,并结合其强大的经皮促进渗透特性、皮肤角质层破坏性这两大特性进行研究,为阐述白芥子经皮给药的科学内涵提供更多理论支持。参考文献:1 SAVTEKIN G,SEHIRLI A O.Rheumatoid arthritis in temporo-man-dibular joint:a reviewJ.Niger J Clin Pract,2018,21(10):1243-1246.2 KLEIN A,POLLIACK A,GAFTER-GVILI A.Rheumatoid arthritisand lymphoma:incidence,pathogenesis,biology,and outcomeJ.He-matol Oncol,2018,36(5):733-739.3LITTLEJOHN E A,MONRAD S U.Early diagnosis and treatment ofrheumatoid 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divided into the control group,the model group,the positive drug group,the Semensinapis group and the Semen sinapis plus TLR4 activator group,with 10 rats in each group.Except for the control group,the remaining groups were prepared adjuvant RA models.In the positive drug group,voltarin(0.27 g/kg)was appliedto the right hind foot,the Semen sinapis group was applied with Semen sinapis lotion(4.50 g/kg),and the Semensinapis plus TLR4 activator group was treated with Semen sinapis lotion(4.50 g/kg)and LPS(0.25 mg/kg).Thecontrol group and the model group were smeared with the flour paste,and the administration was started 3 days beforethe preparation of the model for 18 consecutive days.The swelling of the left and right hind feet at different times was122023 年 8 月第 51 卷第 8 期Vol.51,No.8,Aug.2023 中 医 药 学 报Acta Chinese Medicine and Pharmacologymeasured.After the last administration,thermal pain and mechanical pain thresholds,serum interleukin-1(IL-1)and tumor necrosis factor-(TNF-)were detected.The protein expressions of TLR4 and NF-B in the anklejoint synovial tissues were detected by Western blot method.Results:Compared with that in the model group,theswelling of the left and right hind feet at different modeling time was reduced in the positive drug group,the Semensinapis group and the Semen sinapis plus TLR4 activator group;the swelling of the positive drug group and the Semensinapis group were lower than that of the Semen sinapis plus TLR4 activator group;the right hind foot swelling on the 9thday of modeling was lower in the Semen sinapis group than that in the positive drug group(P 0.05).Compared withthose in the model group,the thresholds of thermal pain and mechanical pain of the right hind foot were increased in thepositive drug group,the Semen sinapis group and the Semen sinapis plus TLR4 activator group;which were higher in thepositive drug group than those in the Semen sinapis group,and they were higher in the Semen sinapis group than those inthe Semen sinapis group plus TLR4 activator group(P 0.05).Compared with those in the model group,the serumlevels of IL-1 and TNF-,as well as the relative protein expressions of TLR4 and NF-B in the ankle jointsynovial tissues were decreased in the positive drug group,the Semen sinapis group and the Semen sinapis plus TLR4activator group;which were lower in the positive drug group and the Semen sinapis group than those in the Semen sinapisplus TLR4 activator group(P 0.05).Conclusion:The transdermal administration of Semen sinapis can effectively treat RArats,possibly by inhibiting the TLR4/NF-B inflammatory axis.Key words Semen sinapis;Transdermal administration;Rheumatoid arthritis;Toll-like receptor 4;Nuclear factor-B22中 医 药 学 报Acta Chinese Medicine and Pharmacology 2023 年 8 月第 51 卷第 8 期Vol.51,No.8,Aug.2023