DB32∕T 3762.11-2020 新型冠状病毒检测技术规范 第11部分：全基因组测序.doc

ICS11.020C 62DB32江苏省地方标准DB 32/T 3762.112020新型冠状病毒检测技术规范第11部分：全基因组高通量测序Technical specifications for SARS-CoV-2 detectionPart 11: Whole genome high-throughput sequencing2020 - 07 - 29发布2020 - 07 - 30实施江苏省市场监督管理局发布前言DB32/T 3762新型冠状病毒检测技术规范目前分为以下部分：第1部分：生物样本采集、运输和保存；第2部分：病毒分离与鉴定； 第3部分：核酸荧光PCR检测程序；第4部分：重组酶介导等温扩增程序；第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序；第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序；第7部分：空气样本检测与评估；第8部分：物体表面检测与评估；第9部分：医务人员职业暴露检测与评估；第10部分：微量血清中和试验；第11部分：全基因组高通量测序。本部分为DB32/T 3762 的第11部分。本部分按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本部分由江苏省卫生健康委员会提出。本部分由江苏省卫生标准化技术委员会归口。本部分起草单位：江苏省疾病预防控制中心、南京医科大学、苏州第五人民医院、苏州大学附二院、昆山市疾病预防控制中心。本部分主要起草人：崔仑标、葛以跃、赵康辰、朱小娟、朱宝立、程军平、钱志远、罗晓明、沈欢喜。新型冠状病毒检测技术规范 第11部分：全基因组高通量测序1 范围本部分规定了新型冠状病毒全基因组高通量测序的环境与设施、设备与耗材、试剂、样本前处理与核酸提取、全基因组测序、结果分析。本部分适用于新型冠状病毒全基因组高通量测序。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室生物安全通用要求新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会医疗机构临床基因扩增管理办法 原卫生部办公厅医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则 原卫生部检验中心国家卫生计生委对高通量测序试点实验室的要求 原国家卫生计生委3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3.1全基因组测序 whole genome sequencing对生物体整个基因组序列进行测定，以获得完整的基因组信息。3.2高通量测序 high-throughput sequencing能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的技术，又称“下一代”测序（next-generation sequencing）或深度测序（deep sequencing）技术。3.3Reads高通量测序平台产生的序列称为reads，即测序读到的碱基序列片段，是测序的最小单位。3.4测序深度 sequencing depth测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。3.5测序覆盖度 sequencing coverage测序得到的序列占整个基因组的比例。4 环境与设施4.1 实验室资质及级别要求应符合新型冠状病毒实验室生物安全指南的要求，未经培养的感染性材料的操作在采用可靠的方法灭活前进行核酸提取及临床样本的灭活等操作，应在生物安全二级实验室（BSL-2）进行，同时采用生物安全三级实验室（BSL-3）的个人防护；感染性材料或活病毒在采用可靠方法灭活后进行的核酸检测操作应在BSL-2进行。cDNA制备后的相关操作可在生物安全一级实验室（BSL-1）进行。全基因组测序实验室应符合GB 19489、国家卫生计生委对高通量测序试点实验室的要求、医疗机构临床基因扩增管理办法、医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则相关要求。4.2 操作人员资质及防护要求实验操作人员应经过生物安全培训并取得实验活动上岗证，在身体健康状态良好的情况下准入。样本制备及核酸提取防护参照DB32/T 3762.3的第4章进行，测序相关操作采用BSL-1的个人防护。5 设备与耗材5.1 设备PCR扩增仪、核酸提取仪、核酸定量仪、高通量测序仪。5.2 耗材微量移液器及各种配套带滤芯Tip头、96孔板磁力架、1.5 mL EP管、0.2 mL 8联排管、96孔PCR板。6 试剂核酸提取试剂盒、核酸定量试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒、随机六聚体引物、经验证可靠的适合多重反应的PCR扩增试剂盒、DNA纯化磁珠、文库制备试剂盒、高通量测序试剂盒。7 样本前处理与核酸提取参照DB32/T 3762.3的第7章进行。8 模板制备8.1 cDNA制备以提取的核酸为模板，采用第一链cDNA合成试剂盒和随机六聚体引物，根据试剂盒说明书在PCR扩增仪上制备第一链cDNA。8.2 混合引物8.2.1 将所有扩增引物（附录A）配置为100M储存浓度，将49对Pool 1的引物各取5L混匀，得490L Pool 1引物池（引物总浓度为100M），同样将49对Pool 2的引物各取5L混匀，得490L Pool 2引物池（引物总浓度为100M）。8.2.2 以去离子水分别将Pool 1和Pool 2引物池作10倍稀释，使其引物总浓度均为10M，分装后储存以防止污染和降解。8.3 多重PCR扩增8.3.1 采用PCR扩增试剂盒，根据试剂盒说明书配置多重PCR扩增体系，反应体系中每一条引物的终浓度为0.015M，Pool 1和Pool 2各配置一套扩增体系，每25L反应体系中加入2L cDNA模板。8.3.2 按以下参数进行PCR扩增：98 30s；98 15s，65 5min，扩增30循环；4 hold。8.4 PCR产物的纯化8.4.1 将每一份样本的Pool 1扩增产物和Pool 2扩增产物混合于新的8联排PCR管或96孔PCR板中。8.4.2 采用DNA纯化磁珠法对混合后的扩增产物进行纯化，以30L TE buffer (10 mM tris-HCl pH8.0, 0.1 mM EDTA)洗脱纯化后的产物。9 DNA文库构建9.1 纯化产物的定量与标化使用核酸定量试剂盒对纯化产物进行双链DNA定量，根据所使用建库试剂盒说明对其进行标化。9.2 DNA文库制备与混合根据所使用的建库试剂盒说明书进行文库制备、定量和文库混合。10 上机测序根据高通量测序试剂盒和高通量测序仪操作说明完成试剂装载，设置测序参数进行测序。11 结果分析可采用不同的生物信息学软件进行测序结果的分析：首先去除测序数据中的PCR引物序列（按照最大引物长度30bp进行Trim）和低质量的Reads，然后以SARS-CoV-2 参考基因组（GeneBank号：MN908947.3）为模板进行序列mapping，mapping之后对测序覆盖度和测序深度进行分析，最终生成一致性（consensus）序列，即为待测样本的全基因组序列。 AA附录A （规范性附录）多重PCR扩增引物序列序号引物名称所属引物池引物序列（5-3）长度1nCoV-2019_1_LEFTPool 1ACCAACCAACTTTCGATCTCTTGT242nCoV-2019_1_RIGHTPool 1AAGTGCCATCTTTAAGATGTTGACG253nCoV-2019_2_LEFTPool 2CTGTTTTACAGGTTCGCGACGT224nCoV-2019_2_RIGHTPool 2TAAGGATCAGTGCCAAGCTCGT225nCoV-2019_3_LEFTPool 1CGGTAATAAAGGAGCTGGTGGC226nCoV-2019_3_RIGHTPool 1AAGGTGTCTGCAATTCATAGCTCT247nCoV-2019_4_LEFTPool 2GGTGTATACTGCTGCCGTGAAC228nCoV-2019_4_RIGHTPool 2CACAAGTAGTGGCACCTTCTTTAGT259nCoV-2019_5_LEFTPool 1TGGTGAAACTTCATGGCAGACG2210nCoV-2019_5_RIGHTPool 1ATTGATGTTGACTTTCTCTTTTTGGAGT2811nCoV-2019_6_LEFTPool 2GGTGTTGTTGGAGAAGGTTCCG2212nCoV-2019_6_RIGHTPool 2TAGCGGCCTTCTGTAAAACACG2213nCoV-2019_7_LEFTPool 1ATCAGAGGCTGCTCGTGTTGTA2214nCoV-2019_7_RIGHTPool 1TGCACAGGTGACAATTTGTCCA2215nCoV-2019_8_LEFTPool 2AGAGTTTCTTAGAGACGGTTGGGA2416nCoV-2019_8_RIGHTPool 2GCTTCAACAGCTTCACTAGTAGGT2417nCoV-2019_9_LEFTPool 1TCCCACAGAAGTGTTAACAGAGGA2418nCoV-2019_9_RIGHTPool 1TTTATGACAGCATCTGCCACAA2219nCoV-2019_10_LEFTPool 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