基于16S rRNA测序分析CRE定植对ICU患者肠道微生物的影响.pdf

中国感染控制杂志2 0 2 3年10 月第2 2 卷第10 期D0I:10.12138/j.issn.16719638.20234425月Chin J Infect Control Vol 22 No 10 Oct 20231239.论著基于16 S rRNA测序分析CRE定植对ICU患者肠道微生物的影响康佳1，赵志军1.2，贾伟1.2（1宁夏医科大学总医院医学实验中心，宁夏银川7 50 0 0 0；2 宁夏病原微生物重点实验室，宁夏银川7 50 0 0 0）摘要目的采用16 S rRNA测序方法分析耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)定植对重症监护病房（ICU)患者肠道微生物的影响。方法收集ICU患者新鲜粪便或肛拭子标本，接种于含有2 g/mL厄他培南的MacConkey平板上培养。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS)对菌株进行鉴定，纸片扩散法对菌株进行药敏分析,采用聚合酶链式反应(PCR)对初步筛查出的 CRE菌株进行16 S rDNA片段扩增,采用微量肉汤稀释法进一步确定CRE。最后，分别提取CRE定植组与非定植组患者的粪便或肛拭子标本基因组DNA在HiSeq平台进行16 SrRNA测序分析。结果共收集ICU患者粪便或肛拭子标本2 41份，其中CRE阳性标本17 份。16 S扩增子V3V 4区测序共分离到7 2 6 OTUs，C RE未定植组有6 31OTUs，C RE定植组有48 0 OTUs，两组间共有385OTUs。这些共有OTUs绝大多数属于厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、疣微菌门及放线菌门。在纲水平上，CRE定植前后变形菌纲（W=193.000,P0.001,FDR=0.004）和互营养菌（W=37.500,P=0.001,FDR=0.018）相对丰度差异有统计学意义。在种水平上，两组间肺炎克雷伯菌（W=195.000,P0.001）、解糖肠球菌（W=153.000，P=0.038)及弯曲杆菌（W=63.500,P=0.050)比较差异有统计学意义。未发现肠道CRE定植对ICU患者肠道微生物KEGG功能通路有显著影响。结论CRE定植会降低ICU患者肠道微生物的多样性,CRE定植组在肺炎克雷伯菌、解糖肠球菌及弯曲杆菌的丰度上与非定植组存在显著差异。关键词肠道微生物；CRE；定植；16 SrRNA测序；重症监护病房；ICU中图分类号 R446.5Impact of CRE colonization on gut microbes in ICU patients based on 16SrRNA sequencingKANG Jia,ZHAO Zhi-jun1.2,JIA Weit.2(1.Laboratory Medical Center,General Hospitalof Ningria Medical University,Yinchuan 750000,China;2.Ningria Key Laboratory ofClinical and Pathogenic Microbiology,Yinchuan 750000,China)Abstract Objective To analyze the impact of carbapenem-resistant Enterobacterales(CRE)colonization on gutmicrobes in patients in intensive care unit(ICU)based on 16S rRNA sequencing.Methods Fresh stool or analswab specimens from ICU patients were collected and inoculated on MacConkey plates containing 2 g/mL ertape-nem for incubation.Strains were identified by matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spec-trometry(MALDI-TOF MS).Antimicrobial susceptibility analysis was performed by disk diffusion method.16SrDNA fragments of preliminarily screened CRE strains were amplified by polymerase chain reaction(PCR),andCRE strains were further determined using micro-broth dilution method.Finally,genomic DNA of fecal or analswab specimens from CRE colonized and non-colonized patients was extracted for 16S rRNA sequencing analysis onthe HiSeq platform.Results A total of 241 stool or anal swab specimens were collected from ICU patients,inclu-ding 17 CRE-positive specimens.726 OTUs were isolated by sequencing the V3-V4 region of the 16S amplicon,631 in the non-colonized group and 480 in the colonized group,with a total of 385 OTUs in two groups.Most of收稿日期 22023-05-05基金项目宁夏回族自治区重点研发计划项目（2 0 2 1BEG03090）；宁夏医科大学总医院新人职硕士培养项目作者简介康佳（19 9 4），女（汉族），宁夏回族自治区中卫市人，初级检验技师，主要从事临床微生物与感染研究。通信作者贾伟E-mail:1240：these shared OTUs belonged to the Firmicutes,Proteobacteria,Bacteroidetes,Verrucomicrobia and Actinobacte-ria.At the class level,there was a significant difference in the relative abundance of proteobacteria(W=193.000,P0.001,FDR=0.004)and Synergistia(W=37.500,P=0.001,FDR=0.018)before and after CRE colonization.At the genus level,Klebsiella pneumoniae(W=195.000,P 48 h患者的粪便或肛拭子标本，每例收集一份，剔除同一患者的重复标本。纳入患者标准：在排除污染的情况下,粪便或肛子中检测出 CRE但患者无感染相关的临床表现,则被认为CRE定植。排除标准：根据国家卫生部颁布的医院感染诊断标准（试行）13 判定为CRE感染的患者。1.2研究方法1.2.1CRE筛查及鉴定用无菌棉拭子采集ICU患者新鲜的粪便或肛拭子标本，直接接种于含有2g/mL厄他培南的MacConkey平板上培养。若中国感染控制杂志2 0 2 3年10 月第2 2 卷第10 期ChinJInfectControl Vol22No10Oct2023培养基上有菌落生长，对生长出的菌落进行分离纯化后采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)进行菌种鉴定，并采用纸片扩散法对菌株进行药物敏感性试验；针对初步鉴定为CRE的菌株,采用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增菌株16 SrDNA片段，并采用微量肉汤稀释法最终确定CRE。PCR扩增产物测序结果在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnolo-gyInformation,NCBI)上进行比对。质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705均来自该院医学实验中心。药敏试验结果判定标准依据美国临床实验室标准化协会(CLSI)指南 14)。引物序列为2 7 F：A G A G T T T G A T C M T G G C T C A G,1492R：G G T T A C C T T G T T A C G A C T；扩增条件：945m in,(9 4 30 s,56 30 s,7 2 45 s)30,72 5 m i n。1.2.2肠道微生物群检测采用QIAampcadorPathogenMiniKit试剂盒提取粪便或肛拭子标本基因组DNA约30 ng，质检合格后使用其对应的融合引物进行PCR扩增，然后使用Agencourt AM-PureXP磁珠对扩增产物纯化后完成建库。Agi-lent2100Bioanalyzer检测合格的文库在HiSeq平台进行16 SrRNA测序。数据过滤后得到的Clean-data用于后期分析。分析时先将双末端测序得到的成对reads用FLASH软件组装成一条序列，得到高变区的 Tags。再用USEARCH软件将拼接好的Tags 聚类为OTU,并将其与数据库进行比对。最后,根据OTU比对和注释结果对标本进行物种注释、物种复杂度分析、组间物种差异分析，以及关联分析。此部分由深圳华大基因科技有限公司完成。1.3统计学方法应用R软件对微生物丰度差异及通路差异进行Wilcoaon秩和检验，P0.05为差异具有统计学意义。中国感染控制杂志2 0 2 3年10 月第2 2 卷第10 期2结果2.1ICU患者肠道 CRE定植共收集ICU患者粪便或肛拭子标本2 41份，其中CRE阳性标本17份，阳性率为7.0 5%。17 株CRE阳性标本中大肠埃筛查科室例数综合ICU105呼吸科ICU21儿科ICU27冠心病ICU49神经科ICU32急诊ICU72.2ICU患者肠道微生态结构特征采用16 S扩增子V3V4区测序共分离到7 2 6 OTUs，未定植组有6 31OTUs，定植组有48 0 OTUs，两组间共有385OTUs，见图1。Shannon多样性指数曲线提示数据量足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物物种信息，见图2。物种组成分析显示，检出OTUs绝大多数属于厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、疣微菌门及放线菌门,见图3a。C RE定植组与非定植组共有OTUs主要属于肠球菌科、拟杆菌科、毛螺菌科和紫单胞菌科。定植组肠杆菌科、肠球菌科和拟杆菌科的优势更明显，而非定植组瘤胃菌科、普雷沃菌科、肽链球菌科及梭状芽孢杆菌科的优势更明显，见图3b。2.3CRE定植对ICU患者肠道微生态结构的影响物种差异分析显示,CRE定植组变形菌纲、拟杆菌纲、梭状芽孢杆菌相对丰度较大，而非定植组梭状芽孢杆菌、拟杆菌纲相对丰度较大;Wilcoon 秩和检验后得到两组间变形菌纲（W=193.000,P0.001,FDR=0.004)和互营养菌纲(W=37.500,P=0.001,FDR=0.018)相对丰度差异有统计学意义，见图4。在种水平上，选取丰度前10 的物种对比作图发现，CRE定植前后，肺炎克雷伯菌（W=195.000,P0.001)、解糖肠球菌(W=153.000,P=0.038)及弯曲杆菌（W=63.500,P=0.050)差异有统计学意义，见图5。Chin J Infect Control Vol 22No 10 Oct 2023表1肠道CRE定植菌株科室来源分布Table 1 Department distribution of gut-colonized CRE strains耐碳青霉烯类大肠埃希菌（株）62000.1241希菌9 株（52.9 4%），肺炎克雷伯菌7 株（41.18%），阴沟肠杆菌1株（5.8 8%）。CRE来源科室分别为综合ICU(12株）、呼吸科ICU(3株）、儿科ICU（2 株），冠心病ICU、精神科ICU及急诊ICU未筛查出。见表1。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（株）520000图1CRE定植组与非定植组Venn图Figure 1Venn diagram of CRE colonized-and non-colonizedgroups4132-1-0J010 00020 00030 00040 00050 00060 000样本中序列数图2CRE定植组与非定植组Alpha多样性稀释曲线图Figure 2Dilution curves of Alpha diversity in CRE colo-nized-and non-colonized groups耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌（株）10000095385阳性率(%）11.4314.297.41000二定植组非定植组246定植组非定植组.1242中国感染控制杂志2 0 2 3年10 月第2 2 卷第10 期Chin J Infect Control Vol 22 No 10 Oct 2023a10080-(%）丰60其他厚壁菌门变形菌门类杆菌疣微菌门放线菌门4020-0样本868100-680-(%）丰6040-20-0Figure 3 Histogram of species composition of CRE colonized-and non-colonized groups5注：a为门水平上物种组成柱形图；b为科水平上物种组成柱形图。图3CRE定植组与未定植组物种组成柱形图其他肠杆菌目肠球菌科拟杆菌科毛螺菌科紫单胞菌科瘤胃菌科普雷沃氏菌科疣微菌科葡萄球菌科弯曲菌科肽链球菌科梭菌科理研菌科韦荣氏球菌科丹毒菌科一消化链球菌科样本双歧杆菌科-变形菌纲互营养菌纲8-变形菌纲8-变形菌纲芽孢杆菌纲疣微菌纲梭菌纲甲烷杆菌纲拟杆菌纲黄杆菌纲0102030相对丰度(%)Log2（定植组VS非定植组）图4物种差异分析图Figure 4Analysis chart of species differences相对丰度（%)定植组非定植组Log2（定植组VS非定植组）updwP值/FDRP值FDR-4-2.02460.10.2 0.3.0.4 0.5 0.6P值/FDR中国感染控制杂志2 0 2 3年10 月第2 2 卷第10 期201(%)丰15105Figure 5Histogram comparison of differences in key species3讨论患者肠道CRE定植是发生CRE感染的一个重要危险因素 151。在流行地区，住院患者的CRE定植率为3%7%16 ,而 ICU患者的 CRE定植率及分离率高于普通病房 17 。本研究中ICU总体CRE定植率为7.0 5%，低于国内文献 18-19 报道的10.90%和2 0.0 0%。呼吸科ICU与综合ICU定植率最高，儿科ICU次之，而冠心病ICU、神经科 ICU和急诊ICU未发现CRE定植患者，这可能与各科室床位数及采样例数有关。此外，由于ICU工作人员多且流动性大,ICU患者病情危重、免疫力低下、侵人性治疗操作多，这些原因导致ICU患者较普通科室患者更易发生感染。通过对ICU患者进行CRE主动筛查，并对筛查阳性患者严格执行感染预防与控制干预措施可以显著减少ICU患者CRE感染月Chin J Infect Control Vol 22 No 10 Oct 2023定植组非定植组奥甲泉菌名图5关键物种差异比较柱形图细胞生长和死亡王跨膜运输信号转导碳水化合物代谢折叠、分类和降解复制和修复翻译核苷酸代谢细胞运动内分泌系统寄生虫传染病转录细菌传染病免疫系统生物降解和代谢氨基酸代谢消化系统辅助因子和维生素代谢类和聚酮类代谢神经退行性疾病其他氨基酸的代谢于05.1015-1.0 0.5 00.5 1.0相对丰度（%）Log2（定植组VS非定植组）图 6 KEGG功能差异分析图Figure 6Analysis chart of KEGG functional difference的发生 16 。本研究筛查到的CRE为大肠埃希菌（52.9 4%）、肺炎克雷伯菌（41.18%）和阴沟肠杆菌(5.88%),与本地区报道的CRE流行病学调查 2 0 1结果基本一致。研究 2 1 报道，健康个体往往具有较高的微生物多样性。另有研究 2 2 将CRE携带者与健康人群进行对比，发现CRE携带者的肠道菌群多样性降低。本研究发现在ICU患者中，CRE非定植组比定植组具有更多的OTUs,CRE非定植组的微生物群组分更丰富。人体肠道微生物的组成相对恒定，以厚壁菌门和拟杆菌门为主,其次是放线菌门和疣微菌门 2 3。本研究发现在ICU患者中，无论是CRE定植还是非定植患者，除了上述4类细菌以外，变形菌门都占有重要比例。有研究 2 4指出变形菌门的丰度与炎症相关，可能在一定程度上解释了这一现象。相对于 CRE定植组，本研究在非定植组中发现瘤胃菌科更具优势，而这种菌对抗感染有帮助 2 1。12432.4CRE定植对肠道代谢功能的影响KEGG功能差异分析结果显示，CRE定植组与未定植组富集到的KEGG通路非常相似，碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅助因子和维生素的代谢相对丰度较高，而传染病、免疫系统、消化系统和神经退行性疾病相对丰度较低。对CRE定植组与未定植组的各个通路分别进行Wilcocon秩和检验，未发现ICU患者肠道CRE定植对肠道微生物KEGG功能通路有显著影响,见图6。相对丰度(%)定植组非定植组Log2（定植组VS非定植组）updwP值/FDRP值FDR0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6P值/FDR1244中国感染控制杂志2 0 2 3年10 月第2 2 卷第10 期ChinJInfect Control Vol 22No10Oct2023为了探究CRE定植对ICU患者肠道微生态结构的影响，本研究对物种差异进行了分析，研究结果显示两组间-变形菌纲和互营养菌纲相对丰度存在统计学差异（P0.05）。-变形菌纲的军团菌，如嗜肺军团菌(军团菌病的病原体和贝氏柯克斯菌（Q 热的病原体），被广泛认为是人类病原体 2 5。而目前对于互营养菌纲知之甚少。本研究显示，在种水平上，肺炎克雷伯菌、解糖肠球菌及弯曲杆菌具有统计学差异（P0.05），与Sindi等 2 6 的研究结果类似，Sindi等 2 6 将造成这一差异的原因归结为抗菌药物的使用。研究 2 2 表明,某些肠杆菌目家族成员比其他成员更容易驻留在人类肠道中，一些细菌聚集在一起,形成一个由代谢产物驱动的复杂的网络互惠共生 2 7 ，而菌群的差异可以决定微生物群特异性代谢能力的改变，这些改变与全身感染的患病率增加有关 2 2 。本研究通过对KEGG功能差异进行分析，发现CRE定植组与非定植组各个通路的相对丰度高度相似,CRE定植组在营养物质代谢方面相对丰度较高，而与疾病相关的功能通路相对丰度很低。对两组间差异进行统计学分析，并未发现肠道CRE定植对ICU患者肠道微生物KEGG功能通路有显著影响，后期可通过增加样本量，同时对患者临床信息进行分析以期有新的发现。本研究表明，肠道CRE定植组患者肠道微生物多样性降低，且与非定植组患者相比,肺炎克雷伯菌、解糖肠球菌及弯曲杆菌丰度上具有统计学差异。这些结果为以特定的细菌表达谱来区分CRE是否定植提供理论基础，但是否可以将以上几种菌作为特定的标志，以及通过改变细菌组成是否会影响CRE定植都有待进一步研究。另外，通过重新引人特定菌株和/或用益生菌或粪便菌群移植来改变肠道微生态，从而影响CRE定植及感染状态，也为CRE的预防及治疗提供了新的思路。另外，本研究存在一定的局限性，收集的病例数相对较少且缺乏对临床数据的分析。后期可通过增加研究病例,同时结合患者临床数据如基础疾病及抗菌药物使用情况等进行分析，以期发现更加有意义的成果，为临床CRE诊治和防控提供支持依据。利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。参考文献1 Shrivastava SR,Shrivastava PS,Ramasamy J.World HealthOrganization releases global priority list of antibiotic-resistantbacteria to guide research,discovery,and development of newantibioticsLJJ.J Med Soc,2018,32(1):76-77.2 Martin RM,Cao J,Brisse 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