1、基金项目:国家自然科学基金地区项目(编号:);江西省高层次高技能领军人才培养工程项目(年度)作者简介:曹文凯,男,南昌大学在读硕士研究生。通信作者:赖卫华(),男,南昌大学教授,博士。:收稿日期:改回日期:犇 犗 犐:犼 狊 狆 犼 狓 文章编号 ()基于 的荧光 检测牛奶中的犈犮 狅 犾 犻 :犈犮 狅 犾 犻 :曹文凯犆 犃 犗 犠 犲 狀 犽 犪 犻山珊犛犎犃犖犛 犺 犪 狀刘道峰,犔 犐 犝犇 犪 狅 犳 犲 狀 犵,彭娟犘 犈犖犌犑 狌 犪 狀邢克宇犡 犐 犖犌犓 犲 狔 狌赖卫华犔 犃 犐犠 犲 犻 犺 狌 犪(南昌大学食品学院,江西 南昌 ;江西师范大学生命科学学院,江西 南昌
2、;江西省疾病预防控制中心,江西 南昌 ;江西省食源性疾病诊断溯源重点实验室,江西 南昌 ;长沙理工大学食品科学与生物工程学院,湖南 长沙 )(犆 狅 犾 犾 犲 犵 犲狅 犳犉 狅 狅 犱犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲,犖 犪 狀 犮 犺 犪 狀 犵犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔,犖 犪 狀 犮 犺 犪 狀 犵,犑 犻 犪 狀 犵 狓 犻 ,犆 犺 犻 狀 犪;犆 狅 犾 犾 犲 犵 犲狅 犳犔 犻 犳 犲犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲,犑 犻 犪 狀 犵 狓 犻犖 狅 狉 犿 犪 犾犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔,犖 犪 狀 犮 犺 犪 狀 犵,犑 犻 犪 狀 犵 狓 犻 ,犆 犺
3、犻 狀 犪;犑 犻 犪 狀 犵 狓 犻犘 狉 狅 狏 犻 狀 犮 犻 犪 犾犆 犲 狀 狋 犲 狉 犳 狅 狉犇 犻 狊 犲 犪 狊 犲犆 狅 狀 狋 狉 狅 犾犪 狀 犱犘 狉 犲 狏 犲 狀 狋 犻 狅 狀,犖 犪 狀 犮 犺 犪 狀 犵,犑 犻 犪 狀 犵 狓 犻 ,犆 犺 犻 狀 犪;犑 犻 犪 狀 犵 狓 犻犘 狉 狅 狏 犻 狀 犮 犻 犪 犾犓 犲 狔犔 犪 犫 狅 狉 犪 狋 狅 狉 狔狅 犳犇 犻 犪 犵 狀 狅 狊 犻 狀 犵犪 狀 犱犜 狉 犪 犮 犻 狀 犵狅 犳犉 狅 狅 犱 犫 狅 狉 狀 犲犇 犻 狊 犲 犪 狊 犲,犖 犪 狀 犮 犺 犪 狀 犵,犑 犻 犪 狀
4、 犵 狓 犻 ,犆 犺 犻 狀 犪;犛 犮 犺 狅 狅 犾 狅 犳犉 狅 狅 犱犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲犪 狀 犱犅 犻 狅 犲 狀 犵 犻 狀 犲 犲 狉 犻 狀 犵,犆 犺 犪 狀 犵 狊 犺 犪犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔狅 犳犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲牔 犜 犲 犮 犺 狀 狅 犾 狅 犵 狔,犆 犺 犪 狀 犵 狊 犺 犪,犎 狌 狀 犪 狀 ,犆 犺 犻 狀 犪)摘要:目的:建立了一种灵敏检测牛奶中大肠杆菌 :的新型荧光酶联免疫吸附方法。方法:以碱性磷酸酶水解焦磷酸盐 配位复合物,释放出 形成铜纳米簇作为信号报告探针,通过对关键因素 浓度、焦磷酸盐浓度、模板的浓度和长度
5、进行优化。结果:在最优条件下,大肠杆菌 :的菌数 为 时,与荧光信号值有较好的线性关系(犚 ),最低检出限为 。结论:该方法成功地应用于低脂牛奶和脱脂牛奶样本中大肠杆菌 :的测定,平均回收率为 ,相对标准偏差为。关键词:酶联免疫吸附;铜纳米簇;大肠杆菌 :;检测犃 犫 狊 狋 狉 犪 犮 狋:犗 犫 犼 犲 犮 狋 犻 狏 犲:犈犮 狅 犾 犻 :犕 犲 狋 犺 狅 犱 狊:,犚 犲 狊 狌 犾 狋 狊:,(犚 )犈犮 狅 犾 犻 :犆 狅 狀 犮 犾 狌 狊 犻 狅 狀:犈犮 狅 犾 犻 :犓 犲 狔 狑 狅 狉 犱 狊:;犈犮 狅 犾 犻 :;犈犮 狅 犾 犻 :是一种常见食源性致病菌,它
6、可以通过被污染的食物来传染人类,如未煮熟的肉制品、生牛奶等。感染犈犮 狅 犾 犻 :后可能会出现腹痛和腹泻等症状,严重时会导致肾衰竭甚至死亡。目前,用于检测食源性致病菌的方法(例如,平板培养、菌落计数法、和 等),存在既费力又费时的问题。近年来,研究者已经开发了多种快速、灵敏和可靠的方法来检测犈犮 狅 犾 犻 :。免疫分析技术如酶联免疫吸附、化学发光免疫分析 和免疫层析等具有快速、灵敏度高和特异强等优势,在食源性致病菌检测中发挥着重要作用。其中酶联免疫吸附技术(,)是一种基于抗原和抗体特 第 卷第期 总第 期 年月异性反 应 的 分 析 技 术,现 已 被 广 泛 地 应 用 于犈犮 狅 犾
7、犻 :的快速检测。在传统的 中,通常采用辣根过氧化物酶催化显 色 底 物,四 甲 基 联 苯 胺()作为信号输出,存在灵敏度相对较低的问题,严重妨碍了 在实际检测中的应用。高信号的荧光与 结合起来,可以解决 灵敏度较低的问题。铜纳米团簇(,)因其独特的超小尺寸和较宽的斯托克斯位移,与传统荧光探针相比,具有更优越的荧光特性,在生物传感和生物示踪等领域具有广阔的应用前景。其中以腺嘌呤胸腺嘧啶双链(,)为模板合成的 ,具有合成简单、荧光强度高和尺寸可调等优势。在抗坏血酸的作用下 会在 模板上被还原成 形成 ,在特定的激发波长下,能够产生稳定的荧光信号。而焦磷酸盐(,)对 的强配位作用将抑制 的还原,
8、从而抑制荧光信号的产生。是公认的碱性磷酸酶的 天 然 底 物,当 其 被 碱 性 磷 酸 酶 水 解 成 磷 酸 盐(,)后,会从 配位复合物中释放出来,被抗坏血酸在模板 上还原成 ,形成 。研究拟通过碱性磷酸酶水解 释放,在抗坏血酸 的 作 用 下 在 模 板 上 被 还 原 成,形成 。以具有较强荧光信号的 作为荧光信号探针,建立一种新型的荧光 ,用于检测低脂牛奶和脱脂牛奶样本中的犈犮 狅 犾 犻 :。材料与方法试剂与仪器低脂牛奶、脱脂牛奶:市售;含,个碱基的 (、和 ):生工生物工程股份有限公司;焦磷酸盐(,)、和抗坏血酸():分析纯,阿拉丁生物试剂股份有限公司;牛血 清 白 蛋 白()
9、:纯 度,美 国 公司;吗啉丙磺酸()、(,四甲基联苯胺)显色液和碱性磷酸酶:阿拉丁生物试剂股份有限公司;其他试剂:分析纯,市售;犈犮 狅 犾 犻 :鼠源 单 抗(,)、犈犮 狅 犾 犻 :兔源多抗(,)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠 抗体()和 碱 性 磷 酸 酶 标 记 的 山 羊 抗 鼠 抗 体():迈迪胺生物科技有限公司;黑色 孔酶标板:康宁有限公司;菌种:大肠杆菌 :()、鼠伤寒沙门氏菌()、猪霍乱沙门氏菌()、鸭 沙 门 氏 菌()、肠 炎 沙 门 氏 菌()、单核增生李斯特菌()、蜡样芽孢杆菌()、福氏志贺氏菌()、大肠杆菌 :()、大肠杆菌():江西省疾病预防控制中心。主要仪器
10、酶标仪:型,美谷分子仪器(上海)有限公司;透射电镜:型,捷欧路(北京)科贸有限公司;恒温培养箱:型,上海福玛实验设备有限公司;分析天平:型,梅特勒托利多科技(中国)有限公司。方法 复合物制备将 的 和 的 加入到 含有 的 的 缓冲溶液(,)中混合均匀,室温下避光孵育 ,得到 复合物。荧 光 的 操 作 步 骤用 碳 酸 盐 缓 冲 液(,)稀释的 (,)作为捕获抗 体 包 被 酶 标 板,在 条 件 下 过 夜 包 被,用 (按 将吐温 加入到 的 中)洗板次后拍干,然后加入 的封闭剂(),在恒温培养箱中 条件下封闭,用 洗板后备用。检测时将 的犈犮 狅 犾 犻 :菌液加入酶标板,并设置阴性
11、对照(,),在 条件下孵育后用 洗板;然后将(,)作为检测抗体加入酶标板,在 条件下孵育 后用 洗 板;将 酶 标 二 抗 (万 倍 稀 释,)加入酶标板,在 条件下孵育 后用 洗 板;再 加 入 的 复 合 物,条件下孵育 ,最后加入,的抗坏血酸用酶标仪读取在 激发下 处的荧光值。关键参数优化试验参数:浓度、浓度、模板浓度、模板长度和抗坏血酸浓度,采用单一变量的原则,对各个参数进行优化。除()外均在 的犈犮 狅 犾 犻 :、的、的 和万稀释的 情况下进行。()浓度优化:由于 是影响 复合物以及产生 的关键因素,因此在缓冲溶液(,)中对其浓度进行优化。在 的 ,曹文凯等:基于 的荧光 检测牛奶
12、中的犈犮 狅 犾 犻 :()、不同浓度的(,)、的 ()和 的抗坏血酸()以及 的 体系下,反 应 ,考 察 不 同 浓 度 所 形 成 的 复合物对荧光强度的影响。()浓度的优化:在 的 (),的()、不同浓度的 (,)和 的 抗 坏 血 酸()以及 的 体系下,反应 ,通过信噪比犉犉(犉:阳性荧光信号值,犉:阴性荧光信号值)来考察不同浓度 所形成的 复合物对荧光强度的影响。()模板长度的优化:在 不同长度 的 模 板(、)、的()、的 ()和 的抗坏血酸()以及 的 体系下,反应 ,通过信噪比犉犉考察 模板长度对荧光强度的影响。()模 板 浓 度 的 优化:在 不 同 浓 度 的 (,)、
13、的()、的 ()和 的抗坏血酸()以及 的 体系下,反应 ,通过信噪比犉犉考察 模板浓度对荧光强度的影响。()抗 坏 血 酸 浓 度 的 优 化:在 的 ()、的()、的 ()和 不同浓度的抗坏血酸(,)以及 的 体系下,反应 ,通过信噪比犉犉考察抗坏血酸浓度对荧光强度的影响。荧光 检测犈犮 狅 犾 犻 :在的最优条件下,将 不同稀释倍数下的犈犮 狅 犾 犻 :(菌数为,),使用酶标仪测量荧光,激发波长 ,发射波长 。传统显色 检测犈犮 狅 犾 犻 :步骤同。加入 孵育并洗板后,将 倍稀释的 ,加 入 酶 标 孔 孵 育 并 洗 板 后,加 入 的显色液,反应 后加入 的 终止液,用酶标仪读取
14、 处的 值。荧光 的特性鉴定()灵敏度:以最低检测限(,)作为评 价 方 法 灵 敏 度 的 标 准。用 超 纯 水 稀 释犈犮 狅 犾 犻 :,利用 ,通过 复合物水解恢复 荧光作为信号输出方式。以犈犮 狅 犾 犻 :菌数的对数值为横坐标,以荧光信号值为纵坐标,绘制荧光 的标准曲线。然后将空白样品进行 次重复测定,根据标准曲线回归方程得到对应菌数,计算重复测定结果的平均值(珚)和标准差(),以珚 作为检测限。()特异性:通过交叉反应试验鉴定检测方法的特异性。利用荧光 法分别检测犈犮 狅 犾 犻 :与相同浓度的其他菌种:大肠杆菌 :()、大肠杆菌()、鼠伤寒沙门氏菌()、猪霍 乱 沙 门 氏
15、菌()、鸭 沙 门 氏 菌()、肠炎沙门氏菌()、单核增生李斯特菌()、蜡样芽孢杆菌()和福氏志贺氏菌()的 荧 光 值 对 比 来 评 估 检 测犈犮 狅 犾 犻 :的特异性。精密度和准确度在两种不同的牛奶样本中添加,低中高种倍数稀释的犈犮 狅 犾 犻 :,每个水平的添加样品利用荧光 法重复检测次,通过计算添加犈犮 狅 犾 犻 :的平均回收率和变异系数()来鉴定方法的精密度和准确度。结果与分析荧光 检测犈犮 狅 犾 犻 :的原理试验方法的检测原理如图所示。当不存在目标菌犈犮 狅 犾 犻 :时,在 孔 中 不会 形 成 双 抗 夹 心图基于 的荧光 检测犈犮 狅 犾 犻 :原理 犈犮 狅 犾
16、犻 :安全与检测 总第 期 年月结构,不会结合在 孔中,因此 复 合 物 不 会 被 水 解,并 阻 止 抗 坏 血 酸 将 在 链上还原成 形成 。当存在目标菌犈犮 狅 犾 犻 :时,会通过双抗夹心结构结合到 孔中来水解 复合物,释放出的 会被抗坏血酸在 上还原成 形成 ,产生荧光信号。试验通过测定荧光强度的变化来判断 是否会水解并产生荧光信号,设计了一种荧光 来检测犈犮 狅 犾 犻 :。用 水解 恢复 用于检测的可行性分析为了检验该 用于检测犈犮 狅 犾 犻 :的可行性,即 能否催化水解 并恢复 荧光,测定了 存在与不存在时的荧光值。如图()所示,当在 复合体系中存在 (,)时,会产生较强
17、的荧光信号,如图()所示,形成的 的粒径为。当不存在 时,几乎没有荧光信号,以上结果表明,的存在会阻碍 荧光的形成,并且通过 来水解 恢复 荧光用于检测犈犮 狅 犾 犻 :是可行的。试验条件优化 浓 度 优 化根 据 检 测 原 理,是 桥 接 以及 荧光信号形成的关键因素。因此,在缓冲溶液中,考察了 对 荧光信号的影响。如图所示,不存在 时,荧光信号会随着 浓度的增图存在 和不存在 时的荧光强度和投射电镜图 图 浓度的优化 加而升高,当 浓度达到 时,荧光信号达到最高,当 浓度达到 时,荧光强度降低,可能是由于高浓度的 在抗坏血酸的作用下,会生成氧自由基来降解 模板,导致荧光强度降低。存在
18、时,随着 浓度的增加,荧光信号随之升高的原因是尽管一部分的 会与 配位形成 复合物,但 是 过 剩 的 仍 会 被 抗 坏 血 酸 还 原,形 成 。结果表明,的最佳浓度为 。浓度的优化如图所示,随着 浓度的增加,犉犉逐 渐 增 加,当 浓 度 达 到 时,犉犉达到最大值,当 浓度 时,犉犉开始降低,可能是由于高浓度的 不能完全被 所水解,过剩的 通过强配位作用结合,抑制 荧光的产生。因此,的最佳浓度为 。模 板 长 度 优 化如 图()所 示,随 着 长度的增加,犉犉逐渐增加,当 长度达到 时,犉犉达到最大值,之后犉犉不再发生明显变化。因此,的最佳长度为 。模板浓度优化如图()所示,随着 浓
19、度 的 增 加,犉犉逐 渐 增 加,当 浓 度 达 到 时,犉犉达到最大值,之后犉犉不再发生明显变化。因此,的最佳浓度为 。抗坏血酸浓度优化如图所示,随着抗坏血酸 浓度的增加,犉犉逐渐增加,当抗坏血酸浓度达到图 浓度优化 ,曹文凯等:基于 的荧光 检测牛奶中的犈犮 狅 犾 犻 :图 长度和浓度的优化 图抗坏血酸浓度优化 时,犉犉达到最大值,之后犉犉开始降低,可能是高浓度的还原剂会抑制 荧光。因此,抗坏血酸的最佳浓度为 。检测方法的性能灵敏度鉴定稀释菌数为,的犈犮 狅 犾 犻 :,经荧光 检测后,以犈犮 狅 犾 犻 :菌数为横坐标,检测所得的荧光强度值为纵坐标,绘制的标准校准曲线如图所示,曲线的
20、线性范围为 ,线性回归方程为狔 (狓),犚 ,最低检出限为 。如图所示,普通的 催化显色 的线性范围为 ,线 性回 归 方 程为狔 (狓),犚 ,为 。相比而言,研究开发的荧光 比传统 灵敏 倍,且检测线性范围更宽。特异性鉴定利用荧光 法检测菌数为 的犈犮 狅 犾 犻 :和其他菌株。以所测定的荧光值作为评判该方法特异性的标准。如图所示,只有犈犮 狅 犾 犻 :存在时,才会恢复 荧光,产生较高的荧光信号值。由于方法建立所使用的捕图犈犮 狅 犾 犻 :定量分析荧光 标准校准曲线 犈犮 狅 犾 犻 :图基于 的传统犈犮 狅 犾 犻 :定量分析 标准曲线 犈犮 狅 犾 犻获抗体的特异性较好,因此能够对
21、单一菌株识别捕获,使检测方法显示出良好的特异性。实际样本分析为探讨该方法检测食品中犈犮 狅 犾 犻安全与检测 总第 期 年月图荧光 的特异性 :的 可 行 性,在 两 种 牛 奶 样 品 中 加 入犈犮 狅 犾 犻 :进行分析,采用外标法评价了该方法的可行性。结果见表。牛奶样品中,个加标水平的平均回收率在 ,相对标准偏差,表明该检测方法准确性较好,可用于实际样品检测。表实际样本中犈犮 狅 犾 犻 :的加标回收率 犈犮 狅 犾 犻 :样本加标浓度()测定平均值()回收率变异系数低脂牛奶 脱脂牛奶 结论试验利用 与焦磷酸盐的强配位原理,设计了一种基于碱性磷酸酶水解焦磷酸盐释放 形成铜纳米团簇的荧光
22、酶联免疫吸附技术,用于低脂和脱脂牛奶样本中犈犮 狅 犾 犻 :的检测。在最佳条件下,犈犮 狅 犾 犻 :的菌数与荧光信号值在 范围内呈良好的线性关系,最低检测限为 比传统显色酶联免疫吸附技术灵敏 倍,且检测线性范围更宽。该方法特异性好、灵敏度高,在低脂和脱脂牛奶样本中回收率理想(),适用于犈犮 狅 犾 犻 :或其他病原微生物的灵敏检测。参考文献?杨同香?常小静?吴孔阳?等?乳品真菌污染及快速检测技术研究进展?食品与机械?(?)?(?)?姜侃?张慧?汪新?等?多重?熔解曲线法检测食品中两种食源性致病菌?食品与机械?(?)?(?)?宋涛平?邱华丽?王淑娟?等?金黄色葡萄球菌?可视化快速检测方法的建
23、立?食品与机械?,?(?)?(?)?王芳妹?钟文涛?王淑好?等?种致泻大肠埃希氏菌实时荧光定量?快速检测技术?食品与机械?(?)?(?)?赵一鸣?石磊?孟赫诚?等?食源性单增李斯特菌的?和?分型研究?食品与机械?(?)?(?)?白亚龙?索玉娟?周昌艳?食源性致病菌?检测前处理方法研究进展?食品与机械?(?)?(?)?谢同彬?梅林?基于纳米金复合探针的沙门氏菌快速定量检测?食品与机械?(?)?(?)?(?)?(?)?袁列江?李萌立?王书源?等?大肠杆菌?量子点免疫层析试纸条的研制?食品与机械?(?)?(?)?(下转第 页),曹文凯等:基于 的荧光 检测牛奶中的犈犮 狅 犾 犻 :别?食品与机械?
24、(?)?(?)?刘云?杨建滨?王传旭?基于卷积神经网络的苹果缺陷检测算法?电子测量技术?(?)?(?)?周雨帆?李胜旺?杨奎河?等?基于轻量级卷积神经网络的苹果表面缺陷检测方法?河北工业科技?(?)?(?)?梅金波?李涛?秦寅初?苹果采摘机器人监测系统和表面缺陷检测方法研究?计算机测量与控制?(?)?(?)?杨双艳?杨紫刚?张四伟?等?基于近红外光谱和?算法的烟叶 自 动 分 级 方 法?贵 州 农 业 科 学?(?)?(?)?王阳阳?黄勋?陈浩?等?基于同态滤波和改进?的苹果分级算法研究?食品与机械?(?)?(?)?王立扬?张瑜?沈群?等?基于改进型?的苹果自动分级方法?中国农机化学报?(?
25、)?(?)?于蒙?李雄?杨海潮?等?基于图像识别的苹果的等级分级研究?自动化与仪表?(?)?(?)?樊泽泽?柳倩?柴洁玮?等?基于颜色与果径特征的苹果树果实检测与分级?计算机工程与科学?(?)?(?)?王冉冉?刘鑫?尹孟?等?面向苹果硬度检测仪的声振信号激励与采集系统设计?浙江大学学报(农业与生命科学版)?(?)?(?)?(?)?王泽霞?陈革?陈振中?基于改进卷积神经网络的化纤丝饼表面缺陷识别?纺织学报?(?)?(?)?王博?刘俊康?陆逢贵?等?基于卷积神经网络的食品图像识别?食品安全质量检测学报?(?)?(?)?(上接第 页)?(?)?(?)?(?)?(?)?(?)?(?)?(?)?(?)?(?)?食品装备与智能制造 总第 期 年月