基于dsDNA-CuNCs的荧光ELISA检测牛奶中的E.coli O157：H7.pdf

基金项目：国家自然科学基金地区项目（编号：）；江西省高层次高技能领军人才培养工程项目（年度）作者简介：曹文凯，男，南昌大学在读硕士研究生。通信作者：赖卫华（），男，南昌大学教授，博士。：收稿日期：改回日期：犇 犗 犐：犼 狊 狆 犼 狓 文章编号 （）基于 的荧光 检测牛奶中的犈犮 狅 犾 犻 ：犈犮 狅 犾 犻 ：曹文凯犆 犃 犗 犠 犲 狀 犽 犪 犻山珊犛犎犃犖犛 犺 犪 狀刘道峰，犔 犐 犝犇 犪 狅 犳 犲 狀 犵，彭娟犘 犈犖犌犑 狌 犪 狀邢克宇犡 犐 犖犌犓 犲 狔 狌赖卫华犔 犃 犐犠 犲 犻 犺 狌 犪（南昌大学食品学院，江西 南昌 ；江西师范大学生命科学学院，江西 南昌 ；江西省疾病预防控制中心，江西 南昌 ；江西省食源性疾病诊断溯源重点实验室，江西 南昌 ；长沙理工大学食品科学与生物工程学院，湖南 长沙 ）（犆 狅 犾 犾 犲 犵 犲狅 犳犉 狅 狅 犱犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲，犖 犪 狀 犮 犺 犪 狀 犵犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔，犖 犪 狀 犮 犺 犪 狀 犵，犑 犻 犪 狀 犵 狓 犻 ，犆 犺 犻 狀 犪；犆 狅 犾 犾 犲 犵 犲狅 犳犔 犻 犳 犲犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲，犑 犻 犪 狀 犵 狓 犻犖 狅 狉 犿 犪 犾犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔，犖 犪 狀 犮 犺 犪 狀 犵，犑 犻 犪 狀 犵 狓 犻 ，犆 犺 犻 狀 犪；犑 犻 犪 狀 犵 狓 犻犘 狉 狅 狏 犻 狀 犮 犻 犪 犾犆 犲 狀 狋 犲 狉 犳 狅 狉犇 犻 狊 犲 犪 狊 犲犆 狅 狀 狋 狉 狅 犾犪 狀 犱犘 狉 犲 狏 犲 狀 狋 犻 狅 狀，犖 犪 狀 犮 犺 犪 狀 犵，犑 犻 犪 狀 犵 狓 犻 ，犆 犺 犻 狀 犪；犑 犻 犪 狀 犵 狓 犻犘 狉 狅 狏 犻 狀 犮 犻 犪 犾犓 犲 狔犔 犪 犫 狅 狉 犪 狋 狅 狉 狔狅 犳犇 犻 犪 犵 狀 狅 狊 犻 狀 犵犪 狀 犱犜 狉 犪 犮 犻 狀 犵狅 犳犉 狅 狅 犱 犫 狅 狉 狀 犲犇 犻 狊 犲 犪 狊 犲，犖 犪 狀 犮 犺 犪 狀 犵，犑 犻 犪 狀 犵 狓 犻 ，犆 犺 犻 狀 犪；犛 犮 犺 狅 狅 犾 狅 犳犉 狅 狅 犱犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲犪 狀 犱犅 犻 狅 犲 狀 犵 犻 狀 犲 犲 狉 犻 狀 犵，犆 犺 犪 狀 犵 狊 犺 犪犝 狀 犻 狏 犲 狉 狊 犻 狋 狔狅 犳犛 犮 犻 犲 狀 犮 犲牔 犜 犲 犮 犺 狀 狅 犾 狅 犵 狔，犆 犺 犪 狀 犵 狊 犺 犪，犎 狌 狀 犪 狀 ，犆 犺 犻 狀 犪）摘要：目的：建立了一种灵敏检测牛奶中大肠杆菌 ：的新型荧光酶联免疫吸附方法。方法：以碱性磷酸酶水解焦磷酸盐 配位复合物，释放出 形成铜纳米簇作为信号报告探针，通过对关键因素 浓度、焦磷酸盐浓度、模板的浓度和长度进行优化。结果：在最优条件下，大肠杆菌 ：的菌数 为 时，与荧光信号值有较好的线性关系（犚 ），最低检出限为 。结论：该方法成功地应用于低脂牛奶和脱脂牛奶样本中大肠杆菌 ：的测定，平均回收率为 ，相对标准偏差为。关键词：酶联免疫吸附；铜纳米簇；大肠杆菌 ：；检测犃 犫 狊 狋 狉 犪 犮 狋：犗 犫 犼 犲 犮 狋 犻 狏 犲：犈犮 狅 犾 犻 ：犕 犲 狋 犺 狅 犱 狊：，犚 犲 狊 狌 犾 狋 狊：，（犚 ）犈犮 狅 犾 犻 ：犆 狅 狀 犮 犾 狌 狊 犻 狅 狀：犈犮 狅 犾 犻 ：犓 犲 狔 狑 狅 狉 犱 狊：；犈犮 狅 犾 犻 ：；犈犮 狅 犾 犻 ：是一种常见食源性致病菌，它可以通过被污染的食物来传染人类，如未煮熟的肉制品、生牛奶等。感染犈犮 狅 犾 犻 ：后可能会出现腹痛和腹泻等症状，严重时会导致肾衰竭甚至死亡。目前，用于检测食源性致病菌的方法（例如，平板培养、菌落计数法、和 等），存在既费力又费时的问题。近年来，研究者已经开发了多种快速、灵敏和可靠的方法来检测犈犮 狅 犾 犻 ：。免疫分析技术如酶联免疫吸附、化学发光免疫分析 和免疫层析等具有快速、灵敏度高和特异强等优势，在食源性致病菌检测中发挥着重要作用。其中酶联免疫吸附技术（，）是一种基于抗原和抗体特 第 卷第期 总第 期 年月异性反 应 的 分 析 技 术，现 已 被 广 泛 地 应 用 于犈犮 狅 犾 犻 ：的快速检测。在传统的 中，通常采用辣根过氧化物酶催化显 色 底 物，四 甲 基 联 苯 胺（）作为信号输出，存在灵敏度相对较低的问题，严重妨碍了 在实际检测中的应用。高信号的荧光与 结合起来，可以解决 灵敏度较低的问题。铜纳米团簇（，）因其独特的超小尺寸和较宽的斯托克斯位移，与传统荧光探针相比，具有更优越的荧光特性，在生物传感和生物示踪等领域具有广阔的应用前景。其中以腺嘌呤胸腺嘧啶双链（，）为模板合成的 ，具有合成简单、荧光强度高和尺寸可调等优势。在抗坏血酸的作用下 会在 模板上被还原成 形成 ，在特定的激发波长下，能够产生稳定的荧光信号。而焦磷酸盐（，）对 的强配位作用将抑制 的还原，从而抑制荧光信号的产生。是公认的碱性磷酸酶的 天 然 底 物，当 其 被 碱 性 磷 酸 酶 水 解 成 磷 酸 盐（，）后，会从 配位复合物中释放出来，被抗坏血酸在模板 上还原成 ，形成 。研究拟通过碱性磷酸酶水解 释放，在抗坏血酸 的 作 用 下 在 模 板 上 被 还 原 成，形成 。以具有较强荧光信号的 作为荧光信号探针，建立一种新型的荧光 ，用于检测低脂牛奶和脱脂牛奶样本中的犈犮 狅 犾 犻 ：。材料与方法试剂与仪器低脂牛奶、脱脂牛奶：市售；含，个碱基的 （、和 ）：生工生物工程股份有限公司；焦磷酸盐（，）、和抗坏血酸（）：分析纯，阿拉丁生物试剂股份有限公司；牛血 清 白 蛋 白（）：纯 度，美 国 公司；吗啉丙磺酸（）、（，四甲基联苯胺）显色液和碱性磷酸酶：阿拉丁生物试剂股份有限公司；其他试剂：分析纯，市售；犈犮 狅 犾 犻 ：鼠源 单 抗（，）、犈犮 狅 犾 犻 ：兔源多抗（，）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠 抗体（）和 碱 性 磷 酸 酶 标 记 的 山 羊 抗 鼠 抗 体（）：迈迪胺生物科技有限公司；黑色 孔酶标板：康宁有限公司；菌种：大肠杆菌 ：（）、鼠伤寒沙门氏菌（）、猪霍乱沙门氏菌（）、鸭 沙 门 氏 菌（）、肠 炎 沙 门 氏 菌（）、单核增生李斯特菌（）、蜡样芽孢杆菌（）、福氏志贺氏菌（）、大肠杆菌 ：（）、大肠杆菌（）：江西省疾病预防控制中心。主要仪器酶标仪：型，美谷分子仪器（上海）有限公司；透射电镜：型，捷欧路（北京）科贸有限公司；恒温培养箱：型，上海福玛实验设备有限公司；分析天平：型，梅特勒托利多科技（中国）有限公司。方法 复合物制备将 的 和 的 加入到 含有 的 的 缓冲溶液（，）中混合均匀，室温下避光孵育 ，得到 复合物。荧 光 的 操 作 步 骤用 碳 酸 盐 缓 冲 液（，）稀释的 （，）作为捕获抗 体 包 被 酶 标 板，在 条 件 下 过 夜 包 被，用 （按 将吐温 加入到 的 中）洗板次后拍干，然后加入 的封闭剂（），在恒温培养箱中 条件下封闭，用 洗板后备用。检测时将 的犈犮 狅 犾 犻 ：菌液加入酶标板，并设置阴性对照（，），在 条件下孵育后用 洗板；然后将（，）作为检测抗体加入酶标板，在 条件下孵育 后用 洗 板；将 酶 标 二 抗 （万 倍 稀 释，）加入酶标板，在 条件下孵育 后用 洗 板；再 加 入 的 复 合 物，条件下孵育 ，最后加入，的抗坏血酸用酶标仪读取在 激发下 处的荧光值。关键参数优化试验参数：浓度、浓度、模板浓度、模板长度和抗坏血酸浓度，采用单一变量的原则，对各个参数进行优化。除（）外均在 的犈犮 狅 犾 犻 ：、的、的 和万稀释的 情况下进行。（）浓度优化：由于 是影响 复合物以及产生 的关键因素，因此在缓冲溶液（，）中对其浓度进行优化。在 的 ，曹文凯等：基于 的荧光 检测牛奶中的犈犮 狅 犾 犻 ：（）、不同浓度的（，）、的 （）和 的抗坏血酸（）以及 的 体系下，反 应 ，考 察 不 同 浓 度 所 形 成 的 复合物对荧光强度的影响。（）浓度的优化：在 的 （），的（）、不同浓度的 （，）和 的 抗 坏 血 酸（）以及 的 体系下，反应 ，通过信噪比犉犉（犉：阳性荧光信号值，犉：阴性荧光信号值）来考察不同浓度 所形成的 复合物对荧光强度的影响。（）模板长度的优化：在 不同长度 的 模 板（、）、的（）、的 （）和 的抗坏血酸（）以及 的 体系下，反应 ，通过信噪比犉犉考察 模板长度对荧光强度的影响。（）模 板 浓 度 的 优化：在 不 同 浓 度 的 （，）、的（）、的 （）和 的抗坏血酸（）以及 的 体系下，反应 ，通过信噪比犉犉考察 模板浓度对荧光强度的影响。（）抗 坏 血 酸 浓 度 的 优 化：在 的 （）、的（）、的 （）和 不同浓度的抗坏血酸（，）以及 的 体系下，反应 ，通过信噪比犉犉考察抗坏血酸浓度对荧光强度的影响。荧光 检测犈犮 狅 犾 犻 ：在的最优条件下，将 不同稀释倍数下的犈犮 狅 犾 犻 ：（菌数为，），使用酶标仪测量荧光，激发波长 ，发射波长 。传统显色 检测犈犮 狅 犾 犻 ：步骤同。加入 孵育并洗板后，将 倍稀释的 ，加 入 酶 标 孔 孵 育 并 洗 板 后，加 入 的显色液，反应 后加入 的 终止液，用酶标仪读取 处的 值。荧光 的特性鉴定（）灵敏度：以最低检测限（，）作为评 价 方 法 灵 敏 度 的 标 准。用 超 纯 水 稀 释犈犮 狅 犾 犻 ：，利用 ，通过 复合物水解恢复 荧光作为信号输出方式。以犈犮 狅 犾 犻 ：菌数的对数值为横坐标，以荧光信号值为纵坐标，绘制荧光 的标准曲线。然后将空白样品进行 次重复测定，根据标准曲线回归方程得到对应菌数，计算重复测定结果的平均值（珚）和标准差（），以珚 作为检测限。（）特异性：通过交叉反应试验鉴定检测方法的特异性。利用荧光 法分别检测犈犮 狅 犾 犻 ：与相同浓度的其他菌种：大肠杆菌 ：（）、大肠杆菌（）、鼠伤寒沙门氏菌（）、猪霍 乱 沙 门 氏 菌（）、鸭 沙 门 氏 菌（）、肠炎沙门氏菌（）、单核增生李斯特菌（）、蜡样芽孢杆菌（）和福氏志贺氏菌（）的 荧 光 值 对 比 来 评 估 检 测犈犮 狅 犾 犻 ：的特异性。精密度和准确度在两种不同的牛奶样本中添加，低中高种倍数稀释的犈犮 狅 犾 犻 ：，每个水平的添加样品利用荧光 法重复检测次，通过计算添加犈犮 狅 犾 犻 ：的平均回收率和变异系数（）来鉴定方法的精密度和准确度。结果与分析荧光 检测犈犮 狅 犾 犻 ：的原理试验方法的检测原理如图所示。当不存在目标菌犈犮 狅 犾 犻 ：时，在 孔 中 不会 形 成 双 抗 夹 心图基于 的荧光 检测犈犮 狅 犾 犻 ：原理 犈犮 狅 犾 犻 ：安全与检测 总第 期 年月结构，不会结合在 孔中，因此 复 合 物 不 会 被 水 解，并 阻 止 抗 坏 血 酸 将 在 链上还原成 形成 。当存在目标菌犈犮 狅 犾 犻 ：时，会通过双抗夹心结构结合到 孔中来水解 复合物，释放出的 会被抗坏血酸在 上还原成 形成 ，产生荧光信号。试验通过测定荧光强度的变化来判断 是否会水解并产生荧光信号，设计了一种荧光 来检测犈犮 狅 犾 犻 ：。用 水解 恢复 用于检测的可行性分析为了检验该 用于检测犈犮 狅 犾 犻 ：的可行性，即 能否催化水解 并恢复 荧光，测定了 存在与不存在时的荧光值。如图（）所示，当在 复合体系中存在 （，）时，会产生较强的荧光信号，如图（）所示，形成的 的粒径为。当不存在 时，几乎没有荧光信号，以上结果表明，的存在会阻碍 荧光的形成，并且通过 来水解 恢复 荧光用于检测犈犮 狅 犾 犻 ：是可行的。试验条件优化 浓 度 优 化根 据 检 测 原 理，是 桥 接 以及 荧光信号形成的关键因素。因此，在缓冲溶液中，考察了 对 荧光信号的影响。如图所示，不存在 时，荧光信号会随着 浓度的增图存在 和不存在 时的荧光强度和投射电镜图 图 浓度的优化 加而升高，当 浓度达到 时，荧光信号达到最高，当 浓度达到 时，荧光强度降低，可能是由于高浓度的 在抗坏血酸的作用下，会生成氧自由基来降解 模板，导致荧光强度降低。存在 时，随着 浓度的增加，荧光信号随之升高的原因是尽管一部分的 会与 配位形成 复合物，但 是 过 剩 的 仍 会 被 抗 坏 血 酸 还 原，形 成 。结果表明，的最佳浓度为 。浓度的优化如图所示，随着 浓度的增加，犉犉逐 渐 增 加，当 浓 度 达 到 时，犉犉达到最大值，当 浓度 时，犉犉开始降低，可能是由于高浓度的 不能完全被 所水解，过剩的 通过强配位作用结合，抑制 荧光的产生。因此，的最佳浓度为 。模 板 长 度 优 化如 图（）所 示，随 着 长度的增加，犉犉逐渐增加，当 长度达到 时，犉犉达到最大值，之后犉犉不再发生明显变化。因此，的最佳长度为 。模板浓度优化如图（）所示，随着 浓度 的 增 加，犉犉逐 渐 增 加，当 浓 度 达 到 时，犉犉达到最大值，之后犉犉不再发生明显变化。因此，的最佳浓度为 。抗坏血酸浓度优化如图所示，随着抗坏血酸 浓度的增加，犉犉逐渐增加，当抗坏血酸浓度达到图 浓度优化 ，曹文凯等：基于 的荧光 检测牛奶中的犈犮 狅 犾 犻 ：图 长度和浓度的优化 图抗坏血酸浓度优化 时，犉犉达到最大值，之后犉犉开始降低，可能是高浓度的还原剂会抑制 荧光。因此，抗坏血酸的最佳浓度为 。检测方法的性能灵敏度鉴定稀释菌数为，的犈犮 狅 犾 犻 ：，经荧光 检测后，以犈犮 狅 犾 犻 ：菌数为横坐标，检测所得的荧光强度值为纵坐标，绘制的标准校准曲线如图所示，曲线的线性范围为 ，线性回归方程为狔 （狓），犚 ，最低检出限为 。如图所示，普通的 催化显色 的线性范围为 ，线 性回 归 方 程为狔 （狓），犚 ，为 。相比而言，研究开发的荧光 比传统 灵敏 倍，且检测线性范围更宽。特异性鉴定利用荧光 法检测菌数为 的犈犮 狅 犾 犻 ：和其他菌株。以所测定的荧光值作为评判该方法特异性的标准。如图所示，只有犈犮 狅 犾 犻 ：存在时，才会恢复 荧光，产生较高的荧光信号值。由于方法建立所使用的捕图犈犮 狅 犾 犻 ：定量分析荧光 标准校准曲线 犈犮 狅 犾 犻 ：图基于 的传统犈犮 狅 犾 犻 ：定量分析 标准曲线 犈犮 狅 犾 犻获抗体的特异性较好，因此能够对单一菌株识别捕获，使检测方法显示出良好的特异性。实际样本分析为探讨该方法检测食品中犈犮 狅 犾 犻安全与检测 总第 期 年月图荧光 的特异性 ：的 可 行 性，在 两 种 牛 奶 样 品 中 加 入犈犮 狅 犾 犻 ：进行分析，采用外标法评价了该方法的可行性。结果见表。牛奶样品中，个加标水平的平均回收率在 ，相对标准偏差，表明该检测方法准确性较好，可用于实际样品检测。表实际样本中犈犮 狅 犾 犻 ：的加标回收率 犈犮 狅 犾 犻 ：样本加标浓度（）测定平均值（）回收率变异系数低脂牛奶 脱脂牛奶 结论试验利用 与焦磷酸盐的强配位原理，设计了一种基于碱性磷酸酶水解焦磷酸盐释放 形成铜纳米团簇的荧光酶联免疫吸附技术，用于低脂和脱脂牛奶样本中犈犮 狅 犾 犻 ：的检测。在最佳条件下，犈犮 狅 犾 犻 ：的菌数与荧光信号值在 范围内呈良好的线性关系，最低检测限为 比传统显色酶联免疫吸附技术灵敏 倍，且检测线性范围更宽。该方法特异性好、灵敏度高，在低脂和脱脂牛奶样本中回收率理想（），适用于犈犮 狅 犾 犻 ：或其他病原微生物的灵敏检测。参考文献?杨同香?常小静?吴孔阳?等?乳品真菌污染及快速检测技术研究进展?食品与机械?（?）?（?）?姜侃?张慧?汪新?等?多重?熔解曲线法检测食品中两种食源性致病菌?食品与机械?（?）?（?）?宋涛平?邱华丽?王淑娟?等?金黄色葡萄球菌?可视化快速检测方法的建立?食品与机械?，?（?）?（?）?王芳妹?钟文涛?王淑好?等?种致泻大肠埃希氏菌实时荧光定量?快速检测技术?食品与机械?（?）?（?）?赵一鸣?石磊?孟赫诚?等?食源性单增李斯特菌的?和?分型研究?食品与机械?（?）?（?）?白亚龙?索玉娟?周昌艳?食源性致病菌?检测前处理方法研究进展?食品与机械?（?）?（?）?谢同彬?梅林?基于纳米金复合探针的沙门氏菌快速定量检测?食品与机械?（?）?（?）?（?）?（?）?袁列江?李萌立?王书源?等?大肠杆菌?量子点免疫层析试纸条的研制?食品与机械?（?）?（?）?（下转第 页），曹文凯等：基于 的荧光 检测牛奶中的犈犮 狅 犾 犻 ：别?食品与机械?（?）?（?）?刘云?杨建滨?王传旭?基于卷积神经网络的苹果缺陷检测算法?电子测量技术?（?）?（?）?周雨帆?李胜旺?杨奎河?等?基于轻量级卷积神经网络的苹果表面缺陷检测方法?河北工业科技?（?）?（?）?梅金波?李涛?秦寅初?苹果采摘机器人监测系统和表面缺陷检测方法研究?计算机测量与控制?（?）?（?）?杨双艳?杨紫刚?张四伟?等?基于近红外光谱和?算法的烟叶 自 动 分 级 方 法?贵 州 农 业 科 学?（?）?（?）?王阳阳?黄勋?陈浩?等?基于同态滤波和改进?的苹果分级算法研究?食品与机械?（?）?（?）?王立扬?张瑜?沈群?等?基于改进型?的苹果自动分级方法?中国农机化学报?（?）?（?）?于蒙?李雄?杨海潮?等?基于图像识别的苹果的等级分级研究?自动化与仪表?（?）?（?）?樊泽泽?柳倩?柴洁玮?等?基于颜色与果径特征的苹果树果实检测与分级?计算机工程与科学?（?）?（?）?王冉冉?刘鑫?尹孟?等?面向苹果硬度检测仪的声振信号激励与采集系统设计?浙江大学学报（农业与生命科学版）?（?）?（?）?（?）?王泽霞?陈革?陈振中?基于改进卷积神经网络的化纤丝饼表面缺陷识别?纺织学报?（?）?（?）?王博?刘俊康?陆逢贵?等?基于卷积神经网络的食品图像识别?食品安全质量检测学报?（?）?（?）?（上接第 页）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?（?）?食品装备与智能制造 总第 期 年月