华南虎染色体带型分析.pdf

2023 年 8 月第 39 卷第 4 期27华南虎染色体带型分析*任小冬1龚志海1饶伟强2雷胜桥1刘力军1李秋明1（1.广东粤北华南虎省级自然保护区管理处，广东 韶关 512023；2.杭州艾迪康医学检验中心有限公司，浙江 杭州 310030）摘要 为保护华南虎 Panthera tigris amoyensis 物种，以静脉血淋巴细胞 G 显带和 R 显带染色技术研究和分析华南虎染色体带型。结果显示，华南虎每条染色体具有独特的带型特征，常染色体中带数最多的为 24 条带，带数最少的为 6 条带；性染色体中 X 染色体为 12 条带，Y 染色体是相对长度最短也是带数最少的染色体，仅 3 条带。实验成功制备华南虎染色体 G 带和 R 带标本，得到 248 条带的华南虎染色体分带模式，经初步对比发现华南虎染色体 G 带模式虽与家猫染色体分带高度近似，但也存在少部分明显区别，研究华南虎染色体带型有利于虎及其它猫科动物的遗传学和基因多样性方面研究。关键词 华南虎；染色体；G 带；R 带；带型中图分类号：Q953，S718.6文献标志码：A 文章编号：2096-2053（2023）04-0027-07Superficial Analysis on Chromosome Banding of South China TigerSuperficial Analysis on Chromosome Banding of South China TigerREN Xiaodong1GONG Zhihai1RAO Weiqiang2LEI Shengqiao1LIU Lijun1LI Qiuming1（1.Procincial Nature Management Service of South China Tigers in Northern Guangdong,Shaoguan，Guangdong 512023，China；2.Hangzhou Aidikang Medical Laboratory Center Co.,Ltd.Hangzhou,Zhejiang310030,China)Abstract In order to protect South China tiger species,the chromosome banding patterns of the South China tiger were studied by G banding and R banding of lymphocytes from venous blood.The results showed that each chromosome of the South China tiger had unique banding characteristics,with 24 bands having the highest number of bands in the autosomes and 6 bands having the lowest number of bands;Among the sex chromosome,the X chromosome has 12 bands,and the Y chromosome has the shortest relative length and the smallest number of bands,with only 3 bands.The experiment successfully prepared G-band and R-band specimens of South China tiger chromosomes and obtained 248 bands of South China tiger chromosome banding patterns.After preliminary comparison,it was found that although the G-band patterns of South China tiger chromosomes were highly similar to those of domestic cats,there were also a few obvious differences.The study of South China tiger chromosome banding patterns is beneficial to the genetic and genetic diversity research of tigers and other feline animals.Keywords South China tiger；chromosome；G-band；R-band；banding pattern*基金项目：韶关市科技计划项目（200811214533884）。第一作者/通信作者：任小冬（1985），男，工程师，主要从事华南虎等濒危野生动物繁育研究，E-mail：。华南虎 Panthera tigris amoyensis 是中国特有的虎亚种，曾在中国中南部大部分地区都有分布，野外已近三十年未有其确切的踪迹报道。全国现存圈养种群均为 20 世纪五六十年代捕获的 6 头（2 雄 4 雌）华南虎的后代。虎的起源主流观点认为是 200 万年前起源于中国中南部，发现于中国河南渑池的古中华虎 Panthera tigris palaeosinensis化石，最接近这一原始虎的亚种是华南虎，因为林 业 与 环 境 科 学2023 年8 月第 39 卷第 4 期28其前倾的眼窝及细小的头颅等头骨结构与古中华虎极其相似1。因此，华南虎被多数学者认为是所有虎亚种祖先的直系后代，在虎的亚种分化和遗传机制方面具有较高的学术价值。由于现存圈养华南虎种群是一个高度近亲的种群，造成遗传疾病多发，其种群生育率和幼崽成活率均较低，近期就有一例华南虎染色体变异的 G 带核型报道2。华南虎的染色体早在 1991 年就有研究3，G 带核型 1993 年也曾有报道4，并对华南虎和东北虎 Panthera tigris altaica 的染色体核型进行了对比分析，认为两个虎亚种 G 带带型没有差异。已有的研究表明猫科动物的核型大多数为 2n=38，认为猫科动物 G 带带型与家猫的完全一致或高度相似5-6，核型非常保守。多位国外学者先后绘制了家猫不同分辨率的 G 带模式图及其染色体分带 命名7，虽然华南虎染色体 G 显带也有研究和 报道2-4，但华南虎 G 带模式图未有人进行详细 研究。染色体是生物细胞中的一个重要组成部分，它是遗传信息（基因）的主要载体8。所谓显带染色体是指染色体标本经过一定程序处理，并运用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现出明暗或深浅相间的横行带纹，称之为染色体带，这种染色体带显现的技术，称为显带技术9。染色体显带反映了调节 DNA 复制、修复、转录和遗传重组的基因组功能结构。基因检测结果显示华南虎和东北虎具有显著的遗传差异，也确定了与繁殖、疾病、捕食和代谢相关的功能基因和调节途径，并表征了与野外生存相关的功能性基因10。华南虎的核型分带研究对于构建华南虎的高密度遗传连锁图谱和 QTL 图谱具有重要作用。本研究组近期报道了华南虎 G 显带模式11，现结合 R 显带技术对华南虎染色体进行详细带型对照，对比华南虎染色体显带模式与家猫的异同，能为华南虎的细胞遗传学研究提供更为详实的基础资料，鉴于细胞遗传学在医学上以及在保护濒危物种方面的重要性，能为未来的华南虎繁育研究和物种保护提供参考。1材料与方法1.1材料1.1.1血液 华南虎血液（采集自后肢或尾部静脉）采自广东某华南虎繁育研究基地。血样采集使用肝素钠抗凝真空采血管，采血后应轻轻颠倒混匀数次，使抗凝剂与血液充分接触、溶解，防止凝固。血样采集后在 48 h 内进行接种，静脉血样本在运输过程中避免剧烈晃动，冷藏（28）或常温（1825）运输均可，实验室收到标本当日无法及时接种以及接种后不能马上培养的标本需冷藏（28）保存。累计采集到 8 头华南虎的血样，其中雄性 6 头，雌性 2 头。1.1.2主要仪器和试剂 OLYMPUS CX41 显微镜、以色列 ASI 染色体核型分析系统、美国热电 HEPA CLASS 100 二氧化碳培养箱、广州白云山拜迪生物医药淋巴细胞培养液、舒泰、多咪静、咹啶醒、肝素钠抗凝真空采血管等。1.2培养方法分别取 0.4 mL 肝素钠抗凝静脉血接种于 2 瓶淋巴细胞培养液中，混匀后置于 37 二氧化碳培养箱培养 72 h。培养完成后加入 40 ug/mL 的秋水仙素 20 uL，作用 80 min 后收获淋巴细胞，收获步骤为：培养细胞转移至 15 mL 离心管，离心去上清，加入 0.075 mol/L KCL 低渗，37 水浴，离心去上清，细胞预固定，细胞固定，再次细胞固定。吸取固定好的细胞悬液 56 滴均匀滴于冰玻片上，过火，80烤片 1 h（R 显带时不用烤片），分别进行胰酶 G 显带和 R 显带处理，Giemsa 染色。在低倍镜下寻找良好染色体分裂相，用高倍油镜观察选取染色体形态清晰、分散良好、背景干净的中期分裂相，并进行显微摄影。1.3带型分析方法G 显带和 R 显带样本各选取 10 个分散良好、染色深浅适宜、显带清晰的中期分裂相进行计数和测量，分别计算相对长度、臂比值和着丝粒指数的均值及标准差。并用染色体核型分析系统进行拍片、存档。根据以着丝粒位置进行分类的方法12确定染色体形态。主要根据相对长度、臂比值及着丝粒指数等进行染色体形态划分，本文采用臂比值均值作为确定形态依据，臂比值大于1 而小于 1.67 的为中部着丝粒染色体（m）、臂比值大于 1.67 而小于 3.0 的为亚中部着丝粒染色体（sm）、臂比值大于 3.0 而小于 7.0 的为亚端着丝粒染色体（st）、臂比值大于 7.0 的为端着丝粒染色体（t），性染色体 X 是中着丝粒染色体（m），性染色体 Y 是亚中着丝粒染色体（sm）。依据ISCN201313（人类细胞遗传学国际命名体制）29任小冬等：华南虎染色体带型分析对华南虎的染色体带型进行分组分类和分析对比，并按照分析结果绘出华南虎各条染色体带型模 式图。2结果与分析2.1华南虎染色体形态特征及带数依照染色体相对长度大小递减排列，常染色体依次为 118，性染色体分别为 X 和 Y（表 1）。其中，常染色体中带数最多的为 24 条带，带数最少的为 6 条带；性染色体中 X 染色体为 12 条带，Y染色体是相对长度最短也是带数最少的染色体，仅 3 条带。所有染色体中 7 号和 8 号的长度和形态都极为近似，区别仅为 7 号染色体比 8 号染色体短臂靠近着丝粒位置多一条浅染带。从 G 带结果来看，华南虎各条染色体均具有独特的带型特征，华南虎雌性和雄型的常染色体带型没有区别，性染色体能明显区分华南虎的性别（图 23）。2.2华南虎 G 带模式、G 带和 R 带比较经对华南虎的 G 带11和 R 带进行带型研究初步形成了华南虎的 G 带核型，19 对染色体都能显示出较为细致的带纹。从带型上来看，同源染色体带纹基本一致，带纹在每一对染色体上的数目和分布具有明显的特征。不同长度的染色体具有不同的带纹，一般染色体长度越长带纹越多。各条染色体分带模式根据 G 带带纹分布制作而成，R带作为辅助手段校正着丝粒和带纹的分布，将华南虎染色体 G 带模式、G 带和 R 带分别进行对照（图 3）。表 1华南虎染色体核型形态特征及带数Table1KaryotypemorphologicalcharacteristicsandbandingnumberofSouthChinatiger序号NO.相对长度/%Relative length臂比值Arm ratio着丝粒指数Centromere index染色体形态Chromosome morphology带数Number of stripes长臂带数Number of long arm strips短臂带数Number of short arm strips110.0311.0371.8320.19034.43.6sm2415928.4760.8841.0030.10548.25.0m22111137.9450.8263.8040.39820.32.1st1813546.7400.6962.5210.26227.12.8sm1611556.6660.6951.5660.16437.13.9m169766.0030.6233.4960.36521.52.2st119275.8860.6092.5250.26327.42.9sm1611585.8030.6022.2480.23529.73.1sm1511495.0630.5261.8060.18934.23.6sm1495104.7390.4922.4900.26027.42.9sm1073114.1640.4292.3570.24528.32.9sm1385123.8690.3991.8170.18933.63.5sm1073133.7870.3941.0060.10548.45.1m954143.7780.3912.7480.28625.92.7sm1073153.6390.375t990163.4510.357t770172.6800.2781.8720.19632.13.3sm743182.3490.2431.3730.14336.63.8m633X4.9320.5131.2000.12543.54.5m1275Y1.9160.2062.9820.3080.2250.024sm321林 业 与 环 境 科 学2023 年8 月第 39 卷第 4 期30图 1雄性华南虎染色体 G 显带Fig.1ChromosomeGbandingofmaleSouthChinatiger图 2雌性华南虎染色体 G 显带Fig.2ChromosomeGbandingoffemaleSouthChinatiger2.3华南虎 G 带命名方法与华南虎相近的猫科动物中已有人对家猫的染色体带型进行了命名14，其命名规则参考了人类细胞遗传学国际命名体制中的染色体分带的区、带命名方法，将该方法应用于华南虎染色体带型研究，方便进行染色体各条带的定位和比较。人31任小冬等：华南虎染色体带型分析注：A1（左-G 带模式，中-G 带，右-R 带），A2（左-G 带模式，中-G 带，右-R 带）.以此类推。Note:A1(left-G banding karyotype pattern,middle-G banding,right-R banding),A2(left-G banding karyotype pattern,middle-G banding,right-R banding).and so on.图 3华南虎 G 带模式、G 带和 R 带对照Fig.3SouthChinatigerGbandingkaryotypepattern、GbandingandRbandingcontrast类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）汇聚了染色体专家的智慧，其中的惯例和方法值得借鉴和应用。华南虎 1 号染色体带型命名（图 4）按照ISCN 方法沿染色体的臂从着丝粒开始向远端连续标记区和带。p 和 q 分别用于表示染色体的短臂和长臂，着丝粒区定义为 10，向着短臂部分称为p10，面向长臂的部分称为 q10。每条臂上与着丝粒相连的部分定义为 1，稍远的区定义为 2，依次类推13。作为界标的带一般认为属于该界标远端的区，并且该带常被标定位该区的 1 号带。在定义一个特定的带时，需要下列 4 个条件：（1）染色体号，（2）臂的符号，（3）区号，（4）该带在所属区的带号。这些条件需要连续列出，中间不要有空格和间断。例如 1p12 表示 1 号染色体短臂 1 区 2 带（图 4）。使用以上方法可以清晰地分辨染色体的每条带纹的编号，如 1q32 表示 1 号染色体长臂上 3 区第 2 条带（图 4），在应用中可方便定位染色体每林 业 与 环 境 科 学2023 年8 月第 39 卷第 4 期32一条带的大致位置，从而判断华南虎染色体带纹是否存在异常，也可以利用该方法将华南虎与东北虎等其他虎亚种的染色体带纹进行比较，看看两者在染色体核型带纹形态上是否具备显著差异。对比前人的东北虎染色体 G 带研究4,15，显示其核型与本文华南虎核型分组结果有个别差异，这种差异可能是测量误差和计算差异造成。3结论与讨论3.1 华南虎是我国国家一级重点保护野生动物，也是我国特有虎亚种，其已被认为野外灭绝，濒危程度远超国宝大熊猫。因猫科动物的核型模式非常保守，家猫的染色体核型在国际上普遍被作为猫科动物的核型模式。家猫的 G 带模式和分带编号已有报道7，将染色体分成 6 组和性染色体组。其中 A 型（大亚中着丝粒染色体）6 条、B 型（大亚端着丝粒染色体）8 条、C 型（大中着丝粒染色体）4 条、D 型(小亚中着丝粒染色体)8 条、E 型（小中着丝粒染色体）8 条、F 型（端着丝粒染色体）4 条和性染色体 X、Y。为方便与家猫的带型进行比较，图 3 按其顺序进行了排列，经比较，华南虎与家猫的染色体 G 显带高度相似，但也存在少部分明显区别。如华南虎 D3 短臂上存在一条较粗的深染带，而家猫 D3 短臂上只有较浅的深染带；华南虎 F1 着丝粒远端明显为浅带更宽，家猫 F1 着丝粒远端明显为深带更宽。染色体标本片的制备受较多因素影响，实验材料、秋水仙素浓度、处理时间、低渗溶液种类、滴片时温差等均可对染色体的实际长度、相对长度及臂比值产生影响13。本文经采集多头华南虎血液培养进行 G 显带和 R 显带实验，带型经多次比对具有一定的代表性，基本可以排除因实验原因造成与家猫带型的差异。目前华南虎染色体带型的研究还处于初级阶段，希望能给以后高分辨的带型研究提供参考，便于以后学者进行华南虎染色体研究时横向比较某些或某条染色体易位和变异等情况。3.2 华南虎的 G 带同家猫的分带高度近似，表明猫科动物在遗传上的同源性。显带方法的分子基础涉及核苷酸碱基组成、相关蛋白和基因组功能注：左-G 带模式，中-G 带，右-R 带。Note:Left-G banding karyotype pattern,middle-G banding,right-R banding.图 4 华南虎 1 号染色体的区、带命名示例Fig.4Exampleofnomenclatureofchromosome1ofregionandbandofSouthChinatiger33任小冬等：华南虎染色体带型分析结构，染色体带的分布决定着某些基因的位置，在染色体核型带型识别时，这些连续的染色体带分布特征具有重要意义。在本研究中，我们对华南虎的 G 带命名方法进行了示意（图 4），对比家猫而言，华南虎的分带命名的精确性仍有待提高。同家猫染色体带型7比较图 3 中 B2、B3、B4 和E1 及 Y 染色体的分类彼此不同，解决这些差异需要使用顺序条带技术对两者 R 带和 G 带进行直接比较。本研究成功制备华南虎染色体 G 带和 R 带标本，初步形成华南虎染色体 G 带模式，希望为华南虎等濒危物种的种群遗传研究提供参考。参考文献1 曹志红.虎种中国起源说的学术史述略J.文教资料,2015(26):78-80.2 潘天乐,刘凤霞,毛毅斌,等.华南虎外周淋巴血细胞培养及染色体铺展分析J.浙江林业科技,2022,42(6):1-5.3 张锡然,朱红阳,陈俊才,等.华南虎(Panthera tigris am-oyensis)的染色体研究J.南京师大学报(自然科学版),1991(1):68-71.4 张锡然,陈宜峰,朱红阳,等.东北虎和华南虎染色体比较研究J.动物学报,1993(3):334-337,352.5 WURSTER-HILL D H,GRAY C W.Giemsa band-ing patterns in the chromosomes of twelve species of cats(Felidae)J.Cytogenetics and cell genetics,1973,12(6):388-397.6 WURSTER-HILL D H,GRAY C W.The interrelation-ships of chromosome banding patterns in procyonids,viverrids,and felidsJ.Cytogenetics and cell genet-ics,1975,15(5):306-312.7 CHO K W,YOUN H Y,WATARI T,et al.A proposed no-menclature of the 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