DB21∕T 2549-2015 仔猪乳糖酶基因检测技术规程.pdf

ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 25492015 仔猪乳糖酶基因检测技术规程 Method of detecting lactase gene in piglets 20151215 发布 20160215 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 25492015 1 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009标准给出的规则制定。 附录A、附录B和附录C均为规范性附录。 本标准由辽宁医学院提出。 本标准由锦州市质量技术监督局归口。 本标准起草单位：辽宁医学院。 本标准主要起草人：田玉民、苏玉虹、朱弘焱、陶晓丽、王 希。 DB21/T 25492015 2 仔猪乳糖酶基因检测技术规程 1 范围 本标准规定了仔猪乳糖酶基因启动子和增强子多态性的检测条件、检测步骤和结果判定的技术要求。 本标准适用于仔猪乳糖酶基因检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2-2004 转基因产品检测实验室技术要求 GB/T 27476.1-2014 检测实验室安全 第1部分：总则 3 术语和定义 3.1 乳糖酶基因 Lactase gene, LCT 乳糖酶（LCT）又称-半乳糖苷酶，在特定条件下将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，进而被消化道吸收。仔猪的乳糖酶基因位于染色体15q13，预测CDS全长为5 793 bp，在基因序列数据库(GenBank)中的登录号为XM_003359430。 4 防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 19495.2第七章规定执行。 5 安全防护 实验室安全防护按GB/T 27476.1第五章规定执行。 6 检测条件 6.1 实验室条件 按GB/T19495.2中的规定执行。 6.2 扩增仔猪乳糖酶基因片段的 PCR 引物 DB21/T 25492015 3 扩增启动子 SNP G-308C 和 A-301G 片段的 PCR 引物： 上游引物F：5-AAA AAG TTT GGT AAG GAC CT-3； 下游引物R：5-GGA ACT GTT AGG AGG TAT GTG-3 扩增增强子 SNP G-797A 片段的 PCR 引物： 上游引物F：5-TAA ACA AAG CCA AGG ACA TT-3； 下游引物R：5-CTG GGG TGT ATG TGC TTG TGG-3 6.3 主要试剂 用水应符合GB/T 6682的灭菌双蒸水。 裂解液、10% SDS、饱和酚、TE缓冲液、2 Pfu PCR Master Mix、蛋白酶K、凝胶回收纯化试剂盒、测序试剂盒等。具体配制方法参见附录 A。 6.4 主要仪器 微量移液器、高速冷冻离心机、核酸蛋白测定仪、PCR热循环仪、pH计、精度0.1 g分析天平、涡旋混合仪、电泳仪、全自动DNA测序仪等。 7 检测步骤 7.1 样品的采集 用猪耳号钳子夹取仔猪耳部边缘组织0.5 cm3，立即置于装有75%乙醇的1.5 mL Ep白色塑料管中，-20保存备用。 7.2 仔猪基因组 DNA 提取 采用常规的酚-三氯甲烷法提取，并测定DNA溶液浓度。具体方法参见附录 B。 7.3 乳糖酶基因 5UTR 区启动子 SNP G-308C 和 A-301G 的检测 15 L反应体系：DNA模板50 ng、10 mol/L 上下游引物各1 L、2 Pfu PCR Master Mix 7.5 L、加灭菌双蒸水至15 L。可根据需要调整反应体系（注：为保证实验准确性，需设置以灭菌双蒸水为模板的PCR反应作为阴性对照）。PCR扩增产物长度为318 bp。 PCR反应循环参数：94 预变性5 min；94 变性30 s，52 退火30 s，72 延伸30 s，30个循环；72 延伸10 min，4保存。 用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0凝胶回收纯化试剂盒对PCR产物纯化。用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0测序试剂盒对PCR产物测序反应。然后在ABI 3730XL全自动DNA测序仪进行毛细管电泳和序列测定，获得序列色谱图ABI文件。通过Sequencing Analysis 和Sequencher软件包进行测序峰图的多重比对和对多态性位点的判读。 7.4 乳糖酶基因5UTR区增强子SNP G-797A的检测 DB21/T 25492015 4 15 L反应体系：DNA模板50 ng、10 mol/L 上下游引物各1 L、2 Pfu PCR Master Mix 7.5 L、加灭菌双蒸水至15 L。可根据需要调整反应体系（注：为保证实验准确性，需设置以灭菌双蒸水为模板的PCR反应作为阴性对照）。PCR扩增产物长度为147 bp。 PCR反应循环参数：94预变性5 min；94变性30 s，52退火30 S，72延伸30 s，30个循环；72延伸 10 min；4保存。 用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0凝胶回收纯化试剂盒对PCR产物纯化。用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0测序试剂盒对PCR产物测序反应。然后在ABI 3730XL全自动DNA测序仪进行毛细管电泳和序列测定，获得序列色谱图ABI文件。通过Sequencing Analysis 和Sequencher软件包进行测序峰图的多重比对和对多态性位点的判读。 8 结果判定 8.1 启动子SNP G-308C和A-301G基因型判定 启动子G-308C和A-301G呈完全连锁，因此仅有2个等位基因：GA和CG。如果测序结果仅有等位基因GA，基因型为纯合子GAGA；如果测序结果仅有等位基因CG，基因型为纯合子CGCG；如果测序结果有两种等位基因：GA和CG，基因型为杂合子GACG。测序结果参考附录 C中图 C.1判定。 8.2 增强子SNP G-797A基因型判定 增强子SNP G-797A仅有2个等位基因：G和A。如果测序结果仅有等位基因G，基因型为纯合子GG；如果测序结果仅有等位基因A，基因型为纯合子AA；如果测序结果有两种等位基因：G和A，基因型为杂合子GA。参考附录 C中图 C.2判定。 9 废弃物处理 实验过程中所产生的废弃物按 GBT 27476.1 中的规定执行。 DB21/T 25492015 5 附 录 A （规范性附录） 主要试剂及配制方法 表 A.1 主要试剂及配制方法 试 剂 配 制 方 法 裂解液（pH 8.0） 50 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L Na2EDTA，SDS 30 g/L，使用 HCl 或 NaOH 调节 pH 蛋白酶 K 溶液 20 mg/mL 蛋白酶 K，无菌水溶解，-20 保存，避免反复冻融 10% SDS（pH 7.2） 100 g/L SDS，37去离子水加热溶解，使用 HCl调节 pH，室温保存 饱和酚：三氯甲烷：异戊醇 25:24:1(体积比) 三氯甲烷：异戊醇 24:1(体积比) TE 缓冲液（pH 8.0） 10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L Na2EDTA，使用 HCl或 NaOH 调节 pH 2 Pfu PCR Master Mix 0.05 U/L Pfu DNA Polymerase， 0.4mmol/L dNTPs， 4mmol/L MgCl2 DB21/T 25492015 6 附 录 B （规范性附录） 仔猪基因组 DNA 提取方法 B.1 组织消化 将需要提取 DNA 的耳组织剪碎（无肉眼可见颗粒状组织）置于 1.5 mL EP 管中，加入 400 L 裂解液、10% SDS 200 L，蛋白酶 K 10 L，混匀置于 56金属浴过夜。 B.2 DNA 提取 DNA提取方法： a) 取出金属浴内的样品管，凉至室温，4，12 000 r/min，离心 10 min； b) 取上清液至新的 EP 管中，加入等体积的饱和酚，颠倒混匀 10 min； c) 4，12 000 r/min，离心 10 min； d) 取上清液至新的 EP 管中，加入等体积的饱和酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀 10 min； e) 4，12 000 r/min，离心 10 min； f) 取上清液至新的 EP 管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，颠倒混匀 10 min； g) 4，12 000 r/min，离心 10 min； h) 取上清液至新的 EP 管中， 加入 2.5 倍体积的冰无水乙醇， 轻柔混匀， 置-20冰箱中放置 30 min。 i) 4，12 000 r/min，离心 20 min； j) 弃上清液，加入 1 mL 75%酒精漂洗，4，12 000 r/min，离心 10 min（此步骤重复 2 次）； k) 4，12 000 r/min，离心 20 min； l) 弃上清液，使管内酒精挥发干净；根据沉淀情况加入适量（建议 40 L）TE 缓冲液溶解，-20保存。 B.3 DNA 含量的测定 样品中提取的 DNA 含量测定用核酸蛋白测定仪进行测定。 取适量 DNA 溶液加 TE 缓冲液进行稀释， 分别检测 260 nm和 280 nm 处的吸光值 A260和 A280， DNA的浓度按式（1）计算： c = A N 50/1 000 (1) 式中： cDNA 浓度，g/L； A260 nm处的吸光值； N核酸稀释倍数。 当A260/A280比值处于在1.6 1.9之间时，即可用于PCR扩增。 DB21/T 25492015 7 附 录 C （规范性附录） 仔猪 LCT 基因启动子和增强子测序结果图 图C.1 仔猪乳糖酶基因启动子SNP G-308C和A-301G的序列峰图 图注：A为等位基因GA；B为等位基因CG 图C.2 仔猪乳糖酶基因增强子SNP G-797A的序列比对峰图 图注：A为等位基因G；B为等位基因A _ A B A B