黄精叶斑病病原菌分离鉴定及其生物学特性研究.pdf

现代农业科技2023 年第 19 期植物保护学黄精叶斑病病原菌分离鉴定及其生物学特性研究胡正雨陈美琪郑家雪李子安王 越梁绪康王信行赵文琪田 园*（山东第一医科大学（山东省医学科学院）生命科学学院，山东泰安 271016）摘要黄精是重要的药食同源植物，黄精叶斑病影响了黄精的品质。为明确泰山黄精叶斑病的病原菌及其生物学特性，本文采集患病黄精叶片，通过组织分离法、致病性测定、形态学鉴定及分子生物学鉴定，确定了黄精叶斑病病原菌种类，分析了碳源、氮源、pH值、温度、培养基以及病原菌的致死温度对菌丝体生长的影响，进而研究了黄精叶斑病病原菌的生物学特性。共从患病黄精叶片中分离获得33株真菌，具有致病能力的菌株两株，分别鉴定为Fusarium fujikuroi HJ-B-20和F.proliferatum HJ-B-32。生物研究学特性研究表明，HJ-B-20最适碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母浸膏，最适生长温度为28，最适pH值范围为68，最适培养基为PDA；HJ-B-32最适碳源为葡萄糖，最适氮源为蛋白胨，最适生长温度为28，最适pH值范围为68，最适培养基为PDA。关键词黄精叶斑病；病原菌；分离；鉴定；生物学特性中图分类号S435.672文献标识码A文章编号 1007-5739（2023）19-0088-06DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2023.19.025开放科学（资源服务）标识码（OSID）：黄精（Polygonatum sibiricum Delar.ex Redoute）为多年生草本植物，广泛分布于我国除南方热带外的地区1。传统医学认为，黄精具有补肾益精、滋阴润燥之功效，可用于治疗肾虚亏损、体倦乏力等症2。现代医学研究发现，黄精还具有抗衰老、提高免疫力、消除水肿、消炎、抗肿瘤和降血糖等多种功效3-5。泰山黄精是泰山四大名药之一6，属知名道地药材，一直在 中国药典 之列。近年来，由于泰山黄精的需求量越来越大，人们开始采用人工栽培的模式来加大生产，黄精的种植基地也遭受到多种病害侵扰。其中，黄精叶斑病是主要的病害之一7。该病害常从夏秋开始发生，在雨季最为严重。发病初期叶片出现椭圆形或不规则形的病斑并向下扩散，造成叶片枯焦而死亡，地上部位逐渐失去光合能力；地下部位可能被叶斑病菌进一步侵染，造成软化、枯萎，甚至绝产。目前，对造成黄精叶斑病的病原菌尚存有争论。刘思睿等8认为，棕榈拟盘多毛孢（Pestalotiopsis trachi-carpicola）是贵州黄精叶斑病的病原菌；邹 娟等9发现，草茎点霉（Phoma herbarum）是湖南省怀化市黄精叶斑病的病原菌；杨汝10认为，链格孢属（Alternaria）、叶点霉属（Phyllosticta）和刺盘孢属（Colletotrichum）都可引起贵州地区的黄精叶斑类病害，根据不同的病害症状将其划分为黑斑病、叶斑病和炭疽病。由此推测，不同地区的黄精，其叶斑类病害的病原菌可能不同。因此，本项目拟分离泰山黄精叶斑病主要致病菌，验证其致病活性，并对其进行鉴定，在此基础上对病原菌进行生物学特性研究，以期为泰山黄精叶斑病的科学防治提供依据。1材料与方法1.1试验材料和培养基1.1.1试材以学校中草药种植园中的黄精（Polygonatumsibiricum Delar.ex Redoute）作为试验材料，于 2021 年6 月黄精叶斑病多发的季节，采集具有典型叶斑病症状的叶片，供下一步进行病原菌的分离使用。1.1.2培养基参照 微生物学实验教程11以及 植病研究方法12制备培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基、马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基、查氏琼脂（Czapek）培基金项目山东第一医科大学（山东省医学科学院）青年科学基金培育资助计划（202201-034）；山东省大学生创新创业计划项目“基于高通量测序的黄精叶斑病微观机制解析及其拮抗菌的生防作用探究”（S202210439012）；山东省医药卫生科技发展计划（202101060623）。第一作者 胡正雨（2001），女，本科在读。研究方向：生物制药。E-mail：*通信作者 E-mail：收稿日期 2023-02-0388养基、麦芽浸膏琼脂（MEA）培养基、水琼脂（WA）培养基和燕麦片琼脂（OMA）培养基。1.2菌株分离与测定1.2.1黄精叶斑病菌株的分离用无菌手术刀取病健交接处 0.2 cm0.2 cm 的叶片组织，用组织分离法分离病原真菌13。依次用 75乙醇漂洗 23 min、1次氯酸钠消毒 35 min、无菌水冲洗 46 次，然后用灭菌滤纸吸干水分，用无菌刀片切取组织后置于 PDA 培养基上分离真菌。待培养基上长出可见菌落时，及时挑取菌落，在 PDA 培养基平板上多次划线分离，获得纯培养物。1.2.2致病性测定采用无伤接种法14处理，即接种前将黄精离体叶片用 75%乙醇进行消毒，随后用无菌水冲洗。取直径为 0.6 cm 的真菌饼接种至无损伤叶片，每个叶片接种 2 块，以空白 PDA 菌饼为对照，置于 28 培养箱中保湿培养，逐日观察记录，每处理 3 次重复。取接种发病后的部位进行组织分离并镜检观察。1.2.3病原菌的鉴定形态特征观察：将病原菌接种至 PDA 培养基上，于 28 恒温培养 7 d，观察培养皿内菌落的形态特征，并于显微镜下观察孢子形态和子实体的有无、大小等。分子生物学鉴定：在超净工作台上刮取少量菌丝，采用微波法快速提取其基因组 DNA15。以基因组DNA 为模板、ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和 ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）为引物进行 PCR 扩增，产物通过 2%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶、纯化后由青岛睿博兴科公司完成测序工作。将测定的 ITS 序列与 GenBank 中已知核酸序列进行BLSAT 分析，从中获得与菌株相似的序列，利用MEGA 7.0 软件构建系统发育树16。1.3病原菌生物学特性研究1.3.1碳源、氮源对菌丝体生长的影响以查氏培养基为基础培养基，用等量的碳源（葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、D-果糖）替代基础培养基中的蔗糖，用等量的氮源（蛋白胨、酵母浸膏、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸）替代基础培养基中的硝酸钠，以不含碳源或氮源的培养基为对照，取直径为 0.6 cm 的菌饼接种于各培养皿中央。于 28 恒温培养 7 d 后，用十字交叉法测量菌落直径8，所有处理组均设 3 次重复。1.3.2温度对菌丝体生长的影响在 PDA 培养基上接种病原菌菌饼，分别置于 5、10、15、20、25、28、30、35 共 8 种温度条件下恒温培养 7 d，用十字交叉法测量菌落直径，所有处理组均设3 次重复。1.3.3pH 值对菌丝体生长的影响用 1 mol/L HCl 和 1 mol/L NaOH 溶液将 PDA 的pH 值分别调节至 4、5、6、7、8、9、10，共 7 个处理，接种病原菌菌饼后 28 恒温培养 7 d，用十字交叉法测量菌落直径，所有处理组均设 3 次重复。1.3.4培养基对菌丝体生长的影响将病原菌菌饼分别接种至 PDA、PSA、Czapek、OMA、MEA 和 WA 培养基上，于 28 恒温培养 7 d，用十字交叉法测量菌落直径，所有处理组均设 3 次重复。1.3.5病原菌致死温度测定在盛有 5 mL 无菌水的试管中加入病原菌菌饼，分别于 40、45、50、55、60、65 的恒温水浴锅中加热10 min，随后置于 PDA 培养基上，在 28 恒温条件下培养 7 d，用十字交叉法测量菌落直径，所有处理组均设 3 次重复。1.4数据统计与分析数据整理分析采用 Excel 2019，数据统计检验采用 SPSS 20.0，显著水平设置为 P=0.05。2结果与分析2.1病害症状泰山黄精叶斑病主要危害黄精的叶片，如图 1 所示。患病初期叶片出现褪绿色小点，逐渐扩大形成不规则的黄褐色病斑，病斑上常伴有黑色小点；患病后注：A、B、C 分别为发病初期、中期、后期。图 1黄精叶斑病发病症状ABC胡正雨等：黄精叶斑病病原菌分离鉴定及其生物学特性研究89现代农业科技2023 年第 19 期植物保护学期病斑大面积连在一起，叶片变黄、脱落，甚至最终导致整个植株死亡。2.2病原菌分离及致病性测定共分离出真菌 33 株，用离体接种法对分离的菌株进行致病性测定。结果显示，HJ-B-20 和 HJ-B-32两株菌在叶片无伤接种的情况下能够产生黄褐色不规则病斑，见图 2（B）（C），其余菌株接种后没有典型病斑。利用组织分离法对发病叶片进行再分离、纯化，获得菌株与原始菌株一致，完成柯赫氏法则，表明HJ-B-20 和 HJ-B-32 均为致病菌株。2.3叶斑病病原菌鉴定黄精叶斑病病原菌 HJ-B-20 的菌落在 PDA 培养基上正面呈白色、毛绒状，见图 3（A）；菌落背面呈白色，见图 3（B）；在显微镜下观察，可见大型分生孢子无色、多胞、镰刀形、略弯曲，小型分生孢子卵圆形至柱形，见图 3（C）。病原菌 HJ-B-32 的菌落在 PDA 培养基上正面呈白色至淡黄色、毛绒状，见图 3（D）；菌落背面呈黄色，见图 3（E）；在显微镜下观察，可见大型镰刀形分生孢子和小型圆柱形分生孢子，见图 3（F）。两株菌均符合镰刀菌属（Fusarium）菌株的特征。两株菌的 ITS 基因测序结果与 NCBI 核酸序列比对（图 4）表明，菌株 HJ-B-20 与藤仓镰刀菌（F.fuji-kuroi LS-S-4）菌株的相似性为 99.81%，在系统发育树上聚为一支；菌株 HJ-B-32 与层出镰刀菌（F.proli-feratum LrBF45）的相似性为 99.43%，在系统发育树上聚为一支。结合菌株形态特征，确定菌株 HJ-B-20为藤仓镰刀菌，命名为 F.fujikuroi HJ-B-20；菌株 HJ-B-32 为层出镰刀菌，命名为 F.proliferatum HJ-B-32。2.4病原菌生物学特性分析2.4.1碳源、氮源对菌丝体生长的影响试验结果表明，不同氮源和碳源均能促进病原菌注：A 为对照；B 为 HJ-B-20；C 为 HJ-B-32；箭头代表放置菌饼的位置。图 2黄精叶斑病病原菌致病性测定ABC注：A、B、C 分别为 HJ-B-20 菌落正面形态、背面形态和显微形态；D、E、F 分别为 HJ-B-32 菌落正面形态、背面形态和显微形态；标尺为 10 m。图 3黄精叶斑病病原菌形态ABCDEF生长，但存在明显差异。HJ-B-20 最适宜的碳源是葡萄糖，见图 5（A）；HJ-B-32 最适宜的碳源是葡萄糖，见图 5（B）；HJ-B-20 最适宜的氮源是酵母浸膏，见图6（A）；HJ-B-32 最适宜的氮源是蛋白胨，见图 6（B）。2.4.2温度对菌丝体生长的影响如图 7 所示，不同温度对病菌菌丝体生长有显著影响，HJ-B-20 和 HJ-B-32 在 1035 均可生长，最适生长温度均为 28，在 510 范围内生长缓慢，90在 2530 范围内生长速度较快。2.4.3pH 值对菌丝体生长的影响如图 8 所示，病原菌在 pH 值 410 范围内均可生长，但在中性 pH 值为 68 范围内，两株病原菌的长势较好。2.4.4培养基对菌丝体生长的影响如图 9 所示，除了 WA 培养基之外的其他 5 种培养基均可促进两株病原菌的生长，两株病原菌的最适培养基均为 PDA 培养基，其次为 PSA 培养基和 Cza-pek 培养基。2.4.5病原菌菌丝体致死温度研究发现，病原菌 HJ-B-20 和 HJ-B-32 经 55 处理 10 min 后接种于 PDA 培养基上不能继续生长，因而推测两株病原菌的致死温度均为 55。NR 158423.1 Fusarium algeriense NRRL MOLD:6664744MW016484.1 Fusarium proliferatum strain LC13663MG543763.1 Fusarium proliferatum isolate LrBF45HJ-B-32OP163792.1 Fusarium fujikuroi isolate LS-S-4HJ-B-20KT192276.1 Fusarium fujikuroi strain P-DZ-3-2-2NR 138275.1 Fusarium annulatum CBS 258.54NR 130698.1 Fusarium nygamai NRRL 13448NR 111142.1 Fusarium acutatum CBS 402.97NR 111886.1 Fusarium concentricum NRRL 25181NR 171109.1 Fusarium hostae NRRL 29888872621643198450.002 0图 4黄精叶斑病病原菌基于 ITS 序列的系统发育树葡萄糖菌落直径/cm76543210菌落直径/cm76543210乳糖可溶性淀粉D-果糖蔗糖无碳源碳源葡萄糖乳糖可溶性淀粉D-果糖蔗糖无碳源碳源acedbfacdebfAB注：A 为 HJ-B-20；B 为 HJ-B-32。不同小写字母表示差异显著（P0.05）。下同。图 5不同碳源对菌落生长的影响蛋白胨酵母浸膏L-半胱氨酸L-苯丙氨酸硝酸钠无氮源氮源菌落直径/cm76543210菌落直径/cm76543210蛋白胨酵母浸膏L-半胱氨酸L-苯丙氨酸硝酸钠无氮源氮源badecfcadebfAB图 6不同氮源对菌落生长的影响胡正雨等：黄精叶斑病病原菌分离鉴定及其生物学特性研究91现代农业科技2023 年第 19 期植物保护学3结论与讨论镰刀菌属（Fusarium）是常见的植物病原菌，在环境中分布广泛，可感染粮食、蔬菜、水果等作物的茎、叶、根、果实等17。近年来，研究发现，镰刀菌属可对黄精属植物造成感染，引起多种病害。例如，Xu 等18发现，燕麦细镰刀菌 F.avenaceum 可引起四川多花黄精根腐病；梁忠厚等19发现，湖南多花黄精根腐病病原菌为 F.foetens 和 F.hostae；迟惠荣20证实，浙江多花黄精叶枯病的病原菌为尖孢镰刀菌 F.oxysporum；Zhou等21首次报道了层出镰刀菌 F.proliferatum 能够引起福建多花黄精叶枯病；有研究发现，藤仓镰刀菌 F.fu-jikuroi 是引起湖南省玉竹（黄精属）叶斑病的病原菌。本研究对泰山地区的鸡头黄精叶斑病样品进行分离、纯化，从中获得病原菌，然后通过柯赫氏法则验证，根据形态学特征、ITS 序列分析，将两株病原菌鉴定为藤仓镰刀菌 F.fujikuroi HJ-B-20 和层出镰刀菌F.proliferatum HJ-B-32，这两株病原菌均已被证实可导致黄精属叶斑类病害21。多种致病菌共同侵染同一寄主是自然界中的常见现象。韩 凤等22研究发现，将尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌共同接种到多花黄精根状茎上，其致病性比单独接种一种病原菌的要强，表明多花黄精根腐病的发生可能存在复合侵染现象。本研究发现的两株叶斑病病原菌是否能够协同侵染，还需要进一步探究。图 7不同温度对菌落生长的影响菌落直径/cm876543210菌落直径/cm76543210温度/510152025283035温度/510152025283035ABhgfdcabehgfdcabe图 8不同 pH 值对菌落生长的影响pH 值54678910pH 值54678910菌落直径/cm9876543210菌落直径/cm876543210ABedaaabcedaaabc图 9不同培养基对菌落生长的影响菌落直径/cm876543210菌落直径/cm876543210AB培养基PSAPDACzapekOMAMEAWA培养基PSAPDACzapekOMAMEAWAabdbceefdcba92通过对黄精叶斑病病原菌生物学特性研究发现，两株病原菌在添加不同碳源和氮源的培养基，以及不同种类的培养基中，菌丝均能较好地生长，表明病原菌可利用的碳源谱和氮源谱较广。其中，HJ-B-20 最适碳源为葡萄糖，最适氮源为酵母浸膏，最适培养基为 PDA；HJ-B-32 最适碳源为葡萄糖，最适氮源为蛋白胨，最适培养基为 PDA。本研究还表明，两株病原菌生长的温度范围较广，对不同酸碱度范围（pH 值 410）的适应能力较强，最适生长温度均为 28，最适pH 值范围均为 68。综上可见，不同地理位置及黄精品种均有可能导致黄精叶斑病的发生情况及其病原菌存在差异，在一定程度上增加了黄精叶斑病防治工作的难度。对病原菌进行分离鉴定和生物学特性研究，不仅为黄精叶斑病的科学诊断与综合防治提供了理论依据，也为今后开展黄精叶斑病病菌原致病物质和致病机制研究提供了重要的参考。参考文献1 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志：第一卷：总论M.北京：科学出版社，2004.2 陈晔，孙晓生.黄精的药理研究进展J.中药新药与临床药理，2010，21（3）：328-330.3 崔阔澍，肖特，李慧萍，等.我国黄精种质资源研究进展J.江苏农业科学，2021，49（11）：35-39.4 XIAN Y F，LIN Z X，XU X Y，et al.Effect of Rhizoma Poly-gonati on 12-O-tetradecanoylphorbol-acetate-induced earedema in miceJ.Journal of Ethnopharmacology，2012，142（3）：851-856.5 王慧，袁德培，曾楚华，等.黄精的药理作用及临床应用研究进展J.湖北民族学院学报（医学版），2017，34（2）：58-60.6 毕研文，宫俊华，杨永恒.泰山黄精人工栽培技术研究J.中药研究与信息，2005，7（9）：33-34.7 杨永恒，毕研文，宫俊华，等.50%退菌特等防治泰山黄精叶斑病试验研究J.北京农业，2008（15）：27-30.8 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