湖北省鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析.pdf

Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报2023,31(3):41-45研究论文湖北省鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析朱玲玲1，孙敏华2，胡 怡1，汪 婷1，徐 欢1，汪 威1，殷世彬1，汪招雄1（1.长江大学动物科学学院，荆州 434025；2.广东省农业科学院兽医研究所，广州 510640）摘 要：鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏杆菌（RA）感染引起的一种雏鸭高度接触性传染病。为了解该病在鸭群中的发病情况、细菌耐药性变化，本研究从湖北省不同地区鸭场采集鸭传染性浆膜炎疑似病例肝脏，分离到34株细菌，对分离细菌进行培养、形态观察、生化鉴定、耐药性检测和氟苯尼考耐药基因测定。药敏试验显示34株分离株对头孢噻肟、大观霉素和阿米卡星敏感性比较高，对新霉素和诺氟沙星耐药性最强。PCR扩增RA氟苯尼考flor基因，16株分离株可以扩增出该基因，所得序列与Flor蛋白全基因序列比对，相似性高达100%。关键词：鸭疫里默氏杆菌；PCR鉴定；耐药性检测；fl or基因测定中图分类号：S852.61 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2023）03-0041-05Isolation,Identifi cation and Drug Resistance of Riemerella anatipestifer in Hubei ProvinceZHU Lingling1,SUN Minhua2,HU Yi1,WANG Ting1,XU Huan1,WANG Wei1,YIN Shibin1,WANG Zhaoxiong1(1.College of Animal Science,Yangtze University,Jingzhou 434025,China;2.Institute of Veterinary Medicine,Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou 510640,China)收稿日期：2021-01-03基金项目：湖北省农业科学学院农业部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室开放课题资助（KLAEMB-2017-04）作者简介：朱玲玲，女，硕士，主要从事为动物传染病防制和病原感染宿主致病机制研究通信作者：汪招雄，E-mail：Abstract:Infectious serositis in duck is a highly contagious infection caused by Riemerella anatipestifer.In order to understand the incidence of this disease in the duck population and the drug resistance,liver samples were collected from ducks suspicious of infectious serositis from different regions of Hubei province and 34 bacterial strains were isolated and identifi ed as R.anatipestifer based on culture,morphology,biochemical reaction.These strains were tested for their drug resistance.These strains were susceptible to cefotaxime,spectinomycin and amikacin and resistant to neomycin and norfl oxacin.In addition,the fl orfenicol fl or gene was amplifi ed in PCR from 16 isolates and compared with the whole fl or gene sequence at 100%identity.Key words:Riemerella anatipestifer;PCR identifi cation;drug resistance test;fl or gene鸭传染性浆膜炎（infectious serositis of duck）是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）感染鸭引起的一种高度接触性败血性传染病1-2。该病多见于18周龄雏鸭，发病率和死亡率都非常高，其特征症状为肝周炎、纤维素性心包炎、脑膜炎和气囊炎，是当前严重危害养鸭业的细菌性传染病之一，每年给我国养鸭业造成严重的经济损失3-4。在生产实践中由于抗生素的长期大量使用，越来越多 42 中国动物传染病学报2023 年 6 月的RA表现出耐药性，其耐药谱广泛且不同的菌株耐药性存在极大的差异5。目前已对RA检测到氯霉素、氟苯尼考、红霉素等抗生素的耐药基因，耐药株的广泛出现，严重影响了抗生素防治该病的临床效果6-7。本试验从湖北不同地区规模化鸭场采集了鸭传染性浆膜炎疑似病例肝脏，分离鉴定了34株RA菌株，并对菌株进行了耐药谱分析，测定了氟苯尼考flor基因，为今后湖北省RA的药物防控提供了近期的实验数据，为flor耐药性机制的研究奠定了良好基础。1 材料和方法1.1 病料和主要试剂 从湖北荆州、潜江、荆门等地多个患病鸭场采集疑似鸭传染性浆膜炎肝脏，病鸭均表现神经症状，解剖可见典型的纤维性心包膜炎、肝周炎等病理变化。胰蛋白酶大豆琼脂培养基（TSA）和胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）均购自美国BD Bifco公司；药敏片购自中国药物研究所。1.2 引物的设计与合成 根据RA OmpA基因序列设计特异性检测引物，RA-OmpA-F为ATGTTG ATGACTGGACTTGGT，RA-OmpA-R为CTTCAC TACTGGAAGGTCAGA，扩增片段长度为1119 bp；根据RA flor基因序列设计特异性检测引物，上游引物flor-F为ATGACCACCACACGC，下游引物为RA-OmpA-R为TTAGACGACTGGCGACT，扩增片段长度为1215 bp。引物序列均由华大基因有限公司合成。1.3 细菌的分离 无菌采集鸭传染性浆膜炎疑似病例肝脏，在TSA培养基上划线接种，37培养2448 h，挑取单菌落于TSB中，37振荡培养1640 h。1.4 细菌革兰氏染色 挑取纯化过的单菌落，涂抹于干净的载玻片，用细菌革兰氏染色法进行染色，在油镜下观察其形态特征。1.5 生化试验 对分离细菌进行葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、甘露醇和山梨醇，靛基质、VP试验、硝酸盐还原、硫化氢产生、甲基红、触酶、氧化酶等试验。1.6 RA的PCR鉴定 取50 L菌液在沸水中煮5 min作为模板备用，构建20 L PCR反应体系：2Taq PCR Master Mix 10 L，ddH2O 6 L，10 mol/L上、下游引物各1 L，模板2 L。PCR反应条件：94预变性8 min；94变性30 s，55退火1 min，72延伸90 s，共30个循环；72终延伸1 min。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像下观察。1.7 药敏试验 取200 L菌液均匀涂布于TSA平板上，待菌液吸收后，在平皿上均匀贴上药敏纸片，37培养16 h，测量、记录结果。1.8 RA氟苯尼考耐药基因PCR鉴定 取50 L菌液在沸水中煮5 min作为模板备用，构建20 L PCR反应体系：2 Taq PCR Master Mix 10 L，ddH2O 6 L，10 mol/L上、下游引物各1 L，模板2 L。PCR反应条件：94预变性8 min；94变性30 s，58退火1 min，72延伸90 s，共30个循环；72终延伸1 min。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳后于凝胶成像下观察。2 结果2.1 鸭疫里默氏杆菌培养特性 分离的菌株在普通培养基和麦康凯培养基上不能生长，TSA培养基上生长旺盛，菌落为白色圆形，大小12 mm，表面光滑。在含有胰蛋白酵母的肉汤中37培养48 h后，培养基中呈现轻微浑浊现象，管底出现少量沉淀。2.2 形态及染色 革兰氏染色可见分离菌株呈现典型的两极着色红色短小杆菌。多数单个存在，少数成双或短链排列（图1）。图 1 RA 革兰氏染色形态特征Fig.1 Morphological characteristics of RA2.3 分离菌株的生化鉴定 对分离菌株进行生化试验，结果表明34株分离菌株不发酵葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇和山梨醇。枸橼酸盐、甲基红试验、VP试验均为阴性，氧化酶、尿素反应为阳性。2.4 分离菌株特异性PCR鉴定 34株菌株PCR扩增产 43 朱玲玲等：湖北省鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析第 31 卷第 3 期物菌呈现特异性条带，大小与目的基因片段一致。将PCR胶回收产物送至擎科生物科技有限公司测序，测序结果经NCBI数据库比对，与RA的OmpA基因序列同源性高达99%。2.5 RA耐药性分析 药敏试验显示，34株分离株耐药性较强，对头孢噻肟、大观霉素和阿米卡星敏感性比较高，对新霉素和诺氟沙星耐药性最强，对氟苯尼考、新霉素、阿莫西林、卡那霉素、环丙沙星、庆大霉素、链霉素、多西环素的耐药性介于二者之间。表 1 34 株鸭疫里默氏杆菌对 12 种抗生素耐药性分析Table 1 Drug resistance of 34 strains of Riemerella anatipestifer to 12 antibiotics抗生素Antibiotics纸片药物含量（g/片）Paper drug content(g/table)耐药菌株数量Number of resistant strains判定标准（mm）Criterion(mm)耐药Resistant(R)中敏Medium sensitive(M)高敏Hypersensitive(H)耐药Resistant(R)中敏Medium sensitive(M)高敏Hypersensitive(H)氟苯尼考3018142 1213 17 18新霉素3024100 1213 16 17阿莫西林2020102 1314 17 18卡那霉素3019121 1314 17 18阿米卡星3031813 1415 16 17环丙沙星52491 1516 20 21庆大霉素102093 1213 14 15头孢噻肟3001618 1415 22 23链霉素102482 1112 14 15多西环素301895 1213 15 16大观霉素10011717 1415 17 18诺氟沙星1022120 1213 16 17代表直径stands for diameter图 2 RA OmpA基因 PCR 检测结果Fig.2 The detection of RA OmpA gene by PCRM:DNA相对分子质量标准(DL2000);1:阴性对照;2:阳性对照;336:临床菌株的PCR产物M:DL2000 DNA marker;1:Negative control;2:Positive control;3-36:PCR products of clinical strains200010007505002501001119bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24200010007505002501119100bpM 1 2 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 44 中国动物传染病学报2023 年 6 月2.6 RA氟苯尼考flor基因的PCR鉴定及序列分析 对34株RA进行氟苯尼考耐药基因flor、fexA、fexAv、fexB、cfr进行PCR测定，结果只有flor基因显示目的条带，其他基因均不显示。其中16株RA扩增出与目的片段大小一致的特异性片段，胶回收产物送至擎生物科技有限公司测序，所得序列与flor全基因序列比对，相似性高达100%。图 3 RA 氟苯尼考fl or基因 PCR 鉴定结果Fig.3 PCR identifi cation of fl or gene in RAM:DNA相对分子质量标准(DL2000);1:阴性对照;2:阳性对照;319:临床菌株的PCR产物M:DL2000 DNA marker;1:Negative control;2:Positive control;3-19:PCR products of clinical strains3 讨论本研究从湖北省鸭场采集了鸭传染性浆膜炎疑似感染鸭病料，分离和鉴定了34株鸭疫里默氏杆菌。药物敏感性试验表明，34株分离株耐药性普遍较强，耐药谱较广，很多分离的菌株对3种以上的抗生素产生了耐性性。对12种抗生素耐药性比较分析显示，头孢噻肟、大观霉素和阿米卡星对大部分分离菌株比较敏感，但是分离菌株对新霉素和诺氟沙星耐药性最强，超过三分之二的菌株产生了耐药性，对氟苯尼考、新霉素、阿莫西林、卡那霉素、环丙沙星、庆大霉素、链霉素、多西环素的耐药性介于两者之间。对耐药性统计表明在临床上用于治疗RA的常规药物品种有限，有些药物在较低的浓度下基本上失去作用，预示着加大了临床药物防治该病的难度，穿梭用药、联合用药以及使用高成本药物势必会增加养殖成本，将进一步提高RA对少数品种药物耐药性的风险8-11。氯霉素类药物具有抗菌谱广、吸收快的特点，广泛分布于体内，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考都是该类药物里的经典药物等。氟苯尼考价格低廉，近些年在鸭场被广泛用来防控RA，近年来分离出来的具有氟苯尼考抗性的RA比例逐渐增加，呈现越来越广泛的趋势12-13。本研究在药物敏感试验的基础上，对34株分离株测定了氟苯尼考flor基因，发现其中16株分离株携带该基因，进一步验证了RA对氟苯尼考耐药的广泛性和严重性。参考文献1 Wang Y,Li S,Gong X,et al.Characterization of RaeE-RaeF-RopN,a putative RND efflux pump system in Riemerella anatipestiferJ.Vet Microbiol,2020(251):108852.2 李生斗.鸭疫里默氏杆菌ABC外排泵的RIA1614基因功能研究D.北京:中国农业科学院,2019.3 杨殿江,蒲龄,向小英,等.一株鹅源鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及药敏试验J.贵州畜牧兽医,2020,44(5):61-63.4 Li S,Chen Q,Gong X,et al.RanB,a putative ABC-type multidrug efflux transporter contributes to aminoglycosides resistance and organic solvents tolerance in Riemerella anatipestiferJ.Vet Microbiol,2020(243):108641.5 张喜懿,温贵兰,陈广,等.一株鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定与药敏试验J.贵州畜牧兽医,2020,44(5):36-39.6 左春生,李迎晓,徐光科,等.14株鸭疫里默氏杆菌的200010007505002501001215bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 45 朱玲玲等：湖北省鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析第 31 卷第 3 期部分生物学特性分析J.江苏农业科学,2020,48(15):221-225.7 刘玲俐,赵亚楠,靳亚洁,等.鸭疫里默氏杆菌耐药机制研究进展J.中国动物传染病学报,2020,30(4):206-210.8 Tao Z,Zhu C,Xu W,et al.Riemerella anatipestifer infection affects intestinal barrier structure and immune reactions in the duck caecumJ.Avian Pathol,2020,49(6):572-580.9 孔桂慧,王方昆,孙淑红,等.一株鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定及其免疫原性研究J.中国预防兽医学报,2020,42(5):451-456.10 Xu X,Xu Y,Miao S,et al.Evaluation of the protective immunity of Riemerella anatipestifer OmpAJ.Appl Microbiol Biotechnol,2020,104(3):1273-1281.11 赵巧雅,马秀丽,于可响,等.1株鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究J.畜牧与兽医,2020,52(2):87-90.12 陈阳阳.猪源大肠杆菌对氟苯尼考的耐药性分析及其floR基因研究D.长春:吉林农业大学,2014.13 邢林林.鸭疫里默氏杆菌红霉素耐药机制的研究D.泰安:山东农业大学,2015