流式细胞仪的荧光补偿问题.ppt

1.荧光素为什么会出现荧光？2.检测前为什么需要进行(jnxng)荧光补偿？3.荧光补偿的方法有哪些？4.荧光补偿的原则是什么？第一页，共二十四页。荧光(ynggung)发生的机理 室温下荧光素分子大部分处于(chy)“基态”，当荧光素在一定波长（激发波长）的光的照射下吸收光能后（经染色后的细胞在激光束的照射下），荧光染料吸收能量能级跃迁，进入新的状态，称为“激发态”，处于(chy)激发态的分子极不稳定，它可以通过在10-910-7秒的极短时间内以发射一定波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返回到基态。这一过程称为荧光发射，也就是发光。第二页，共二十四页。第三页，共二十四页。荧光(ynggung)素的激发光谱和发射光谱任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱激发光谱（Excitation，Ex）：是指能特异性地激发(jf)某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max发射光谱（Emission）：是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光。发射波峰（最大发射波长）：Em-Max第四页，共二十四页。发射(fsh)波峰-最大发射波长FITC-异硫氰酸荧光异硫氰酸荧光(ynggung)素素第五页，共二十四页。PE-藻红蛋白藻红蛋白(dnbi)第六页，共二十四页。PE-Cy5-藻红蛋白藻红蛋白(dnbi)偶联物偶联物第七页，共二十四页。荧光染色(rns)对照的设置阴性对照空白对照（自发荧光(ynggung)）同型（ISO)对照（自发荧光非特异荧光）实验样本（特异荧光自发荧光非特异荧光）第八页，共二十四页。荧光荧光(ynggung)(ynggung)染料平均荧光染料平均荧光(ynggung)(ynggung)强度比较强度比较 PerCP APC FITC ECD PC5 PE第九页，共二十四页。同型对照(duzho)的选择与实验染色的单克隆抗体特异性无关(wgun)的免疫球蛋白亚型；与染色的单克隆抗体 相同种属来源 相同免疫球蛋白及亚型 相同荧光素标记 相同剂量和浓度第十页，共二十四页。分析类型管功能 加入的抗体单色分析1Isotype1-FITC2Sample1,2A-FITC双色分析1Isotype1-FITC2a-PE2Compensation1A-FITC2a-PE3Compensation21-FITCB-PE4Sample1,2A-FITCB-PE三色分析1Isotype1-FITC2a-PE1-PC52Compensation1A-FITC2a-PE1-PC53Compensation21-FITCB-PE1-PC54Compensation31-FITC2a-PEC-PC55Sample1,2A-FITCB-PEC-PC5四色分析1Isotype1-FITC2a-PE1-ECD1-PC52Compensation1A-FITC2a-PE1-ECD1-PC53Compensation21-FITCB-PE1-ECD1-PC54Compensation31-FITC2a-PEC-ECD1-PC55Compensation41-FITC2a-PE1-ECDD-PC56Sample1,2A-FITCB-PEC-ECDD-PC5第十一页，共二十四页。荧光(ynggung)补偿（compensation）定义：指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠(chngdi)（spectral overlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。第十二页，共二十四页。补偿(bchng)方法手动补偿自动补偿（flow-set)无论手动或自动补偿都需将单种荧光素标记的单克隆抗体分别进行单色荧光染色即几色分析就需要(xyo)制备几个补偿对照管第十三页，共二十四页。现举例进行FITC、PE、PC5三色手动补偿(bchng)1.准备ISO（阴性对照管）；IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PC52.通过调节电压，使阴性群体落在双阴性区域；FITC与PE、FITC与PC5、PE与PC5第十四页，共二十四页。第十五页，共二十四页。FITCFITC与PE PE第十六页，共二十四页。3.上单染管(CD3-PC5、CD4-FITC、CD8-PE)，准备补偿；（注：保持电压(diny)绝对不变；开始补偿前，将原补偿全部归零；）第十七页，共二十四页。调节补偿(bchng)原则横平竖直即X-mean或Y-mean相等(xingdng)第十八页，共二十四页。双色双色荧光光补偿(bchng)1第十九页，共二十四页。双色双色荧光光补偿(bchng)2 第二十页，共二十四页。第二十一页，共二十四页。双阴双阳单阳CD3-CD4-CD8-CD3-CD4+CD8+CD3+CD4+CD8-CD3+CD4-CD8+前T细胞(xbo)胸腺皮质(pzh)细胞胸腺髓质细胞(xbo)外周血第二十二页，共二十四页。恳请恳请(knqng)各位老师指正！各位老师指正！第二十三页，共二十四页。内容(nirng)总结1.荧光素为什么会出现荧光。1.荧光素为什么会出现荧光。是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max。发射波峰（最大发射波长）：Em-Max。发射波峰-最大发射波长。同型（ISO)对照（自发荧光非特异荧光）。荧光染料平均荧光强度比较。PerCP APC FITC ECD PC5 PE。2.通过调节电压，使阴性(ynxng)群体落在双阴性(ynxng)区域第二十四页，共二十四页。