DB37∕T 3985-2020 鸡沙门氏菌的胶体金试纸条检测技术规程.doc

ICS65.020.30B 41DB37山东省地方标准DB37/T 39852020鸡沙门氏菌的胶体金试纸条检测技术规程Technical code of colloidal gold test strip for Avian Salmonella detection2020 - 06 - 08发布2020 - 07 - 08实施山东省市场监督管理局发布前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：泰安市动物疫病预防控制中心、山东农业大学。 本标准主要起草人：唐德宏、孙淑红、王方昆、唐辉、孙建华、王莉莉、鞠孜敬、张富友、伊惠、樊丽。引言沙门氏菌在自然界分布广泛，能侵害人和动物，是一种常见的人畜共患病原，在医学、兽医学和公共卫生学中占有重要地位。传统沙门氏菌的检测方法耗时长，操作步骤繁琐，技术难度大，家禽养殖业和相关检测机构难以对鸡沙门氏菌病做到准确实时监控。本项目拟根据对国内多种血清型、多种来源沙门氏菌检测的基础上，建立本检测技术规程。本标准将规定用两步增菌法对疑似沙门氏菌感染样品进行增菌后，再使用胶体金试纸条进行快速检测的技术（30 h内完成）。本标准适用于鸡群中携带沙门氏菌的检疫、流行病学调查、也可用于规模化种禽场沙门氏菌病的净化。鸡沙门氏菌的胶体金试纸条检测技术规程1 范围本标准规定了鸡沙门氏菌快速检测技术。本标准规定用两步增菌法对疑似沙门氏菌感染样品进行增菌后，再使用胶体金试纸条进行快速检测的技术。本标准适用于沙门氏菌的检疫、诊断、监测和流行病学调查，也可用于规模化种禽场中沙门氏菌的净化。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27401实验室质量控制规范动物检疫GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技术要求NY/T 5412016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范GB 4789.42016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验3 试剂或材料3.1 除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。实验所用水均符合GB/T 6682二级水的规定。实验中人员配置、实验室管理、仪器设备使用、样品实验试剂和废弃物处理等均符合GB/T 27401的规定。3.2 BPW增菌液（参见附录A.1）。3.3 SC增菌液（参见附录A.2）。3.4 TTB增菌液（参见附录A.3）。3.5 鸡白痢沙门氏菌（CVCC535）和肠炎沙门氏菌（CVCC3377）作为阳性对照。3.6 灭菌水为阴性对照。3.7 沙门氏菌胶体金试纸条。3.8 营养肉汤均质袋。4 仪器设备4.1 冰箱（0 8 ）。4.2 生化培养箱（温度范围：5 50 ，温度均匀度：1 ）。4.3 二级生物安全柜。4.4 控温摇床（温度范围：5 50 ）。4.5 高压灭菌锅（工作压力：0.35 MPa，工作温度：142 ）。4.6 组织研磨仪（干磨、湿磨及冷冻研磨均可）。4.7 电子天平（感量0.001）。4.8 微量移液器（量程50 L200 L、300 L1 000 L）。5 沙门氏菌快速检测方法整个实验操作严格按照GB/T 27401、GB/T 19495.2和GB 4789.42016要求执行。5.1 样品采集、运输和储存取约0.5 g样品（新鲜粪便或肝脏等组织）或500 L卵黄囊液到均质袋中，置于2 8 保存，迅速送实验室待检，运输或储存需低温冷藏。参见NY/T 5412016。5.2 样品处理往均质袋中加入4.5 mL BPW增菌培养基，放入均质器中均质2 min。整个过程无菌操作。肝脏等实质性组织样本需经组织研磨仪处理备用。5.3 培养过程5.3.1 BPW增菌培养置于37 摇床中，220 rpm 培养8 h12 h。5.3.2 取培养后的增菌液500 L分别加入到4.5 mL SC和TTB增菌液中，置于37 摇床中，220 rpm 培养18 h24 h。6 胶体金试纸条检测将5.3.2的培养物混合均匀，取1 mL到离心管内，盖严盖子，置于沸水（100 ）中加热10 min，后冷却至室温，摇匀，滴加34滴（约100 L）至胶体金试纸条的样本孔，反应5 min15 min，判读结果，超过30 min显色无效。鸡白痢沙门氏菌（CVCC535）和肠炎沙门氏菌（CVCC3377）作为阳性对照。参见附录B。7 判断标准7.1 试验成立标准30 min内，C线和T线同时显色或者只有C线显色，则反应成立。若C线不显色，则测试失败或检测卡失效，为无效反应。7.2 结果判定阳性反应：若C、T线均显色，可判定待检样本为沙门氏菌阳性。阴性反应：若C线显色，T线不显色，可判定待检样本为沙门氏菌阴性。AA附录A （资料性附录）培养基配制A.1 BPW增菌液A.1.1 成分蛋白胨 10.0 g氯化钠 5.0 g磷酸氢二钠(含12个结晶水) 9.0 g磷酸二氢钾 1.5 g水 1 000 mLA.1.2 制备将各成分加热溶解于1 000 mL水中，121 高压灭菌 15 min备用。A.2 SC增菌液A.2.1 成分蛋白胨 5.0 g乳糖 4.0 g亚硒酸氢钠 4.0 g磷酸氢二钠 10.0 gL-胱氨酸 0.01 g水 1 000 mLA.2.2 制备将各成分加热溶解于1 000 mL蒸馏水中，无菌操作分装于灭菌三角瓶或试管中备用。当天制备当天使用，无需高压灭菌。A.3 TTB增菌液A.3.1 成分蛋白胨 9.0 g牛肉粉 4.5 g氯化钠 2.7 g碳酸钙 40.5 g胆盐 5.0 g硫代硫酸钠 50.0 g水 1 050 mLA.3.2 制备将各成分溶解于1 050 mL蒸馏水中，加热煮沸，临用前加入20 %碘液20 mL，0.1 % 煌绿10 mL，现配现用，不宜久置。BB附录B （资料性附录）胶体金检测结果模式图胶体金检测结果模式图见图B.1。说明：1为沙门氏菌阴性；2为沙门氏菌阳性；3和4为无效反应。图B.1 沙门氏菌胶体金检测图片_