血液学血细胞化学染色.ppt

第三章 细胞化学染色技术 .学习目标1.掌握：细胞化学染色的基本步骤；铁染 色、过氧化物酶染色、酯酶染色、过碘 酸-希夫染色、碱性磷酸酶染色、酸性磷 酸酶染色的正常血细胞染色反应和临床 意义。2.熟悉：细胞化学染色的概念和临床应用。3.了解：细胞化学染色的原理和影响因素。.第一节第一节 概概 述述一、概念 细胞化学染色是细胞学和化学相结合细胞化学染色是细胞学和化学相结合而形成的一门科学。它以而形成的一门科学。它以细胞形态学细胞形态学为为基础，结合运用基础，结合运用化学反应的原理化学反应的原理对血细对血细胞内的各种胞内的各种化学成分化学成分(酶类酶类/脂类脂类/糖类糖类/铁铁/蛋白质蛋白质/核酸等核酸等)作作定性、定位、半定量定性、定位、半定量分析的方法。分析的方法。.要求：血细胞化学染色的基本要求是在血细胞化学染色的基本要求是在原位原位显显示细胞成分和结构，反应产物应是示细胞成分和结构，反应产物应是有色有色沉淀物沉淀物，具有一定的，具有一定的稳定稳定性。性。血细胞化学染色可显示血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、糖原、脂类、酶、蛋白质蛋白质等。等。.二、必要性从形态学观察，存在较多的主观性；从形态学观察，存在较多的主观性；有些原始细胞形态较相似，难以鉴别；有些原始细胞形态较相似，难以鉴别；结合细胞化学染色，提高疾病的诊断率。结合细胞化学染色，提高疾病的诊断率。.三、临床应用1.辅助判断急性白血病的细胞类型辅助判断急性白血病的细胞类型2.辅助血液系统疾病的诊断和鉴别辅助血液系统疾病的诊断和鉴别诊断诊断3.观察疾病的疗效和预后观察疾病的疗效和预后4.疾病疾病发病机制的探讨发病机制的探讨.白血病的诊断：白血病的诊断：MICM分型分型M：morphologyI：immunologyC：cytogeniticsM：molecularbiology形态学分型：进行初步的诊断形态学分型：进行初步的诊断免疫学分型：明确细胞种类免疫学分型：明确细胞种类细胞遗传学分型：与疾病预后有关细胞遗传学分型：与疾病预后有关分子生物学分型：提高到分子水平分子生物学分型：提高到分子水平.四、基本步骤1.固定固定（1）物理法：干燥、火焰）物理法：干燥、火焰（2）化学法：）化学法：A、蒸气固定：、蒸气固定：甲醛甲醛B、液体固定、液体固定：甲醛、乙醇、甲醇、丙酮。甲醛、乙醇、甲醇、丙酮。.2.显示：有色沉淀反应显示：有色沉淀反应（1）偶氮偶联法：酯酶染色）偶氮偶联法：酯酶染色（2）联苯胺法：）联苯胺法：POX（3）普鲁士蓝反应：）普鲁士蓝反应：Fe（4）希夫反应：）希夫反应：PAS（5）金属沉淀法：）金属沉淀法：NAP（6）物理显色法：）物理显色法：SBB.3.复染：使各种细胞能显示出来复染：使各种细胞能显示出来铁染色铁染色-中性红、伊红中性红、伊红PAS-甲基绿甲基绿核：中性红、甲基绿、沙黄等。核：中性红、甲基绿、沙黄等。浆：伊红、刚果红、光绿等。浆：伊红、刚果红、光绿等。.五、研究对象五、研究对象 外周血和骨髓外周血和骨髓新鲜涂片新鲜涂片单个细胞中单个细胞中的化学物质：的化学物质：酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等 .第二节 常用细胞化学染色技术 铁染色铁染色 过氧化物酶染色过氧化物酶染色 苏丹黑苏丹黑B B染色染色 酯酶染色酯酶染色 过碘酸过碘酸-希夫反应希夫反应 中性粒细胞碱性磷酸酶染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色 酸性磷酸酶染色酸性磷酸酶染色.一、一、铁铁 染染 色色 （ferric stainferric stain）.亚铁氰化钾亚铁氰化钾 亚铁氰化铁亚铁氰化铁(蓝色沉淀在含蓝色沉淀在含FeFe部位部位)铁铁酸性环境酸性环境普鲁士蓝普鲁士蓝 反应反应 骨髓小粒中的含骨髓小粒中的含FeFe血黄素（细胞外铁）血黄素（细胞外铁）骨髓中贮存铁骨髓中贮存铁 幼红细胞内的幼红细胞内的FeFe（细胞内铁）（细胞内铁）原理原理.二、结果判断二、结果判断1.细胞外铁细胞外铁(骨髓小粒含铁血黄素骨髓小粒含铁血黄素)铁颗粒、铁颗粒、铁铁小珠、小珠、铁铁团块团块.细胞外铁细胞外铁(低倍镜观察低倍镜观察)（）：无颗粒（）：无颗粒（）：有少量铁颗粒或偶见铁小珠（）：有少量铁颗粒或偶见铁小珠（）：有较多的铁颗粒或铁小珠（）：有较多的铁颗粒或铁小珠（）：有很多的铁颗粒、铁小珠（）：有很多的铁颗粒、铁小珠 和少数铁小块和少数铁小块（）：有极多铁颗粒、小珠和（）：有极多铁颗粒、小珠和 很多铁小块，密集成堆。很多铁小块，密集成堆。.2.细胞内铁(中晚幼红细胞，油镜观察)（1）分级）分级(按铁颗粒数量的多少及大小按铁颗粒数量的多少及大小)细小颗粒：细沙样铁小粒，不易看清细小颗粒：细沙样铁小粒，不易看清。粗大颗粒：很容易看清的颗粒。粗大颗粒：很容易看清的颗粒。（2）阳性率）阳性率 观察观察100个中个中晚幼红细胞，计算出铁晚幼红细胞，计算出铁 粒幼红细胞的百分比。粒幼红细胞的百分比。.【结果判断】【结果判断】幼红细胞核染色为鲜红色幼红细胞核染色为鲜红色,铁粒呈蓝铁粒呈蓝绿色。绿色。.细胞内铁细胞内铁(油镜观察幼红细胞油镜观察幼红细胞)型：型：12个小铁颗粒；个小铁颗粒；型型：35个小铁颗粒；个小铁颗粒；型：型：610个小铁个小铁颗粒或颗粒或14个大颗粒；个大颗粒；型：型：10个以上小铁颗粒个以上小铁颗粒或或5个以上大颗粒。个以上大颗粒。.环形铁粒幼红细胞环形铁粒幼红细胞(ringedsideroblast)幼红细胞胞质内铁颗粒幼红细胞胞质内铁颗粒6个，围绕个，围绕核周核周2/3以上者。以上者。铁粒幼红细胞铁粒幼红细胞(sideroblast)：胞质中出现蓝色铁颗粒的幼红细胞。胞质中出现蓝色铁颗粒的幼红细胞。铁粒红细胞铁粒红细胞(siderocyte)：胞质中出现蓝色铁颗粒的成熟红细胞。胞质中出现蓝色铁颗粒的成熟红细胞。.绿色箭头示：环形铁粒幼红细胞；蓝色箭头示：铁粒红细胞绿色箭头示：环形铁粒幼红细胞；蓝色箭头示：铁粒红细胞.1.细胞外铁细胞外铁：（+）（+）2.细胞内铁：细胞内铁：铁粒幼红细胞阳性率大约铁粒幼红细胞阳性率大约1244%，III型（型（I型为主），无型为主），无型、型、型、环形铁粒幼红细胞及铁粒型、环形铁粒幼红细胞及铁粒红细胞。红细胞。三、参考范围三、参考范围.四、临床意义 铁染色是评估铁缺乏最实用的方法，是反映储存铁的金标准，是临床应用最广泛的细胞化学染色之一。.1.缺铁性贫血：缺铁性贫血：外铁（），内铁外铁（），内铁15%。4.非缺铁性贫血：非缺铁性贫血：溶贫、巨幼贫、再障、溶贫、巨幼贫、再障、白血病等，内外铁白血病等，内外铁正常或增多。正常或增多。5.感染、肝硬化、慢性肾炎、血色病等：感染、肝硬化、慢性肾炎、血色病等：外铁外铁增多增多。.五、应用评价铁染色是临床常用的一种细胞化学铁染色是临床常用的一种细胞化学染色，虽不如血浆铁蛋白敏感，但是反染色，虽不如血浆铁蛋白敏感，但是反映机体储存铁的映机体储存铁的金标准金标准。外铁外铁：反映骨髓中铁的储存量；：反映骨髓中铁的储存量；内铁内铁：反映骨髓中可利用的铁量。：反映骨髓中可利用的铁量。.二、过氧化物酶染色二、过氧化物酶染色 （peroxidase,POXperoxidase,POX）.一、原 理 粒粒细细胞胞和和部部分分单单核核细细胞胞的的溶溶酶酶体体颗颗粒粒中中含含有有过过氧氧化化物物酶酶(POX)，它它可可分分解解H2O2释释放放出出新新生生态态的的氧氧，后后者者氧氧化化二二氨氨基基联联苯苯胺胺，形形成成金金黄黄色色不不溶性沉淀，定位于溶性沉淀，定位于胞质内酶所在的活性胞质内酶所在的活性部位。部位。二甲基联苯胺法（二甲基联苯胺法（DABDAB）原理）原理 .POX 新生态氧新生态氧 O O过氧化氢过氧化氢（基质中）（基质中）四甲基联苯胺四甲基联苯胺 （无色）（无色）联苯胺蓝（蓝色）联苯胺蓝（蓝色）亚硝基铁氰化钠亚硝基铁氰化钠 蓝色颗粒蓝色颗粒（浆内酶部位）（浆内酶部位）粒、单核粒、单核细胞胞浆细胞胞浆【原理】【原理】.二、二、ICSH推荐的三种方法推荐的三种方法 二氨基联苯胺法（二氨基联苯胺法（DBA）二盐酸联苯胺法二盐酸联苯胺法 过氧化物酶氨基过氧化物酶氨基-甲基卡巴唑染色法甲基卡巴唑染色法.三、结果判断三、结果判断 在细胞质内出现金黄色颗粒为阳在细胞质内出现金黄色颗粒为阳性反应。性反应。（二氨基联苯胺法二氨基联苯胺法）.二氨基联苯胺法二氨基联苯胺法.二盐酸联苯胺法二盐酸联苯胺法.二盐酸联苯胺法二盐酸联苯胺法.【结果判断】【结果判断】-、+、+、+、+弱阳性弱阳性 颗粒小，分布稀疏颗粒小，分布稀疏阳性阳性 颗粒稍粗，分布较密集颗粒稍粗，分布较密集强阳性强阳性 颗粒粗大，密布于整个胞浆颗粒粗大，密布于整个胞浆.POX结果判断结果判断细胞质内有细胞质内有蓝黑色颗粒蓝黑色颗粒者为阳性。者为阳性。（）（）无颗粒沉着；（无颗粒沉着；（a）（）颗粒细小颗粒细小，分布稀疏；，分布稀疏；（b）（+）颗粒较粗，局灶分布；颗粒较粗，局灶分布；（c）（+）颗粒粗大，分布较密，颗粒粗大，分布较密，占胞质占胞质1/22/3；（；（d）（+）颗粒粗大，呈团块分布；颗粒粗大，呈团块分布；（e）（+）全部胞质均部满颗粒，全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核（可覆盖胞核（f）。.【正常血细胞染色反应】【正常血细胞染色反应】1.1.粒细胞系统粒细胞系统 POXPOX主要存在于粒系细胞中。主要存在于粒系细胞中。分化差的原粒细胞阴性分化差的原粒细胞阴性;分化好的原粒细胞至中性成熟粒细胞各分化好的原粒细胞至中性成熟粒细胞各阶段均呈阳性，阳性反应程度随细胞的成阶段均呈阳性，阳性反应程度随细胞的成熟逐渐增强。熟逐渐增强。中性分叶核粒细胞：中性分叶核粒细胞：强阳性强阳性嗜酸粒细胞：嗜酸粒细胞：阳性最强阳性最强嗜碱粒细胞：嗜碱粒细胞：（）（）.2.2.单核细胞系统单核细胞系统 阴性或弱阳性阴性或弱阳性 3.3.淋巴细胞系统淋巴细胞系统 红细胞系统红细胞系统 巨核细胞系统巨核细胞系统 阴性阴性 浆细胞浆细胞 组织细胞组织细胞 .四、临床意义 鉴别急性白血病的类型鉴别急性白血病的类型首选首选（1）急淋和急性髓细胞系的鉴别：急淋和急性髓细胞系的鉴别：急淋：（），阳性率急淋：（），阳性率3%；急单：弱阳性；急单：弱阳性；急粒：阳性（急粒：阳性（+）。）。.2.单核细胞系统：单核细胞系统：（）（）或弱（或弱（+），阳性颗粒少而细小。），阳性颗粒少而细小。3.其它系统细胞：其它系统细胞：淋巴细胞系统、红细胞系统、巨核淋巴细胞系统、红细胞系统、巨核 细胞系统、浆细胞、组织细胞细胞系统、浆细胞、组织细胞（）。（）。.【临床评价】【临床评价】急性髓细胞白血病急性髓细胞白血病 急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病 鉴别鉴别.1.1.急性髓细胞白血病急性髓细胞白血病 （1 1）急性粒细胞白血病）急性粒细胞白血病 阳性阳性反应反应 （2 2）急性单核细胞白血病）急性单核细胞白血病 弱阳性弱阳性反应反应.2.2.急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病 阴性阴性反应或反应或阳性率阳性率 3%(3%(残留原粒细胞残留原粒细胞).ALLALL.ALLALL.原粒阴性原粒阴性原粒阴性原粒阴性.原粒弱阳性原粒弱阳性原粒弱阳性原粒弱阳性.原粒阳性原粒阳性原粒阳性原粒阳性.早幼粒早幼粒早幼粒早幼粒强阳性强阳性强阳性强阳性.一、原理 苏丹黑苏丹黑B是一种是一种脂溶性脂溶性重氮染料，可溶解重氮染料，可溶解 细胞内含脂结构细胞内含脂结构(中性脂肪、磷脂、糖脂和类中性脂肪、磷脂、糖脂和类固醇固醇)，而使脂类物质显示出来，呈而使脂类物质显示出来，呈棕黑色或棕黑色或 深黑色深黑色(粒细胞：丰富；单核细胞：少量粒细胞：丰富；单核细胞：少量)。三、三、苏丹黑苏丹黑B染色染色（SudanblackB，SBB）.正常血细胞的染色反应与POX染色基本一致临床意义 与POX染色相似.二、SBB与POX区别：1.POX特异性高于特异性高于SBB，而敏感性，而敏感性低于低于SBB；2.POX染色要求涂片新鲜，保持酶活染色要求涂片新鲜，保持酶活性，性，SBB染色可用陈旧涂片。染色可用陈旧涂片。.1.特异性酯酶（特异性酯酶（specificesterase）主要存在于粒细胞，又称主要存在于粒细胞，又称“粒细胞酯酶粒细胞酯酶”氯乙酸氯乙酸AS-D萘酚酯酶萘酚酯酶（NAS-DCE）。一、分类一、分类四、酯四、酯 酶酶 染染 色色.2.非特异性酯酶非特异性酯酶(nonspecificesterase)单核、组织细胞中含量较多，粒细单核、组织细胞中含量较多，粒细胞、淋巴细胞中含量少，且胞、淋巴细胞中含量少，且氟化钠抑氟化钠抑制单核细胞中的非特异性酯酶制单核细胞中的非特异性酯酶，而不，而不抑制粒细胞、抑制粒细胞、淋巴细胞及其他细胞。淋巴细胞及其他细胞。.醋酸醋酸AS-D奈酚酯酶：奈酚酯酶：NAS-DAE -醋酸醋酸奈酚酯酶：奈酚酯酶：-NAE -丁酸奈酚酯酶：丁酸奈酚酯酶：-NBE酸性酸性-醋酸醋酸奈酚酯酶：奈酚酯酶：ANAE(-NBE敏感性敏感性不如不如NAS-DAE但但特异性特异性较之强较之强).（一）特异性脂酶染色一）特异性脂酶染色1.氯乙酸氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色萘酚酯酶染色NaphtholAS-Dchloroacetateesterase.1.原理原理氯乙酸氯乙酸AS-D萘酚萘酚AS-D萘酚萘酚不溶性的有色不溶性的有色(红红)沉淀。沉淀。NAS-DCE几乎仅出现在粒细胞，其特异性高，几乎仅出现在粒细胞，其特异性高，因此又称为因此又称为“粒细胞酯酶粒细胞酯酶”NAS-DCE重氮盐重氮盐(坚牢蓝紫酱坚牢蓝紫酱).氯氯乙酸乙酸AS-D萘酚酯酶染色萘酚酯酶染色.2.正常血细胞的染色反应粒系粒系(酶活性酶活性不随细胞成熟而增强不随细胞成熟而增强)原粒（）或（原粒（）或（+）早幼粒早幼粒成熟中性粒细胞（成熟中性粒细胞（+）嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞（）或弱（）或弱（+）嗜碱性粒细胞（嗜碱性粒细胞（+）.单核细胞系统：单核细胞系统：（）（）肥大细胞：肥大细胞：（+）淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、巨核细胞、血小板：巨核细胞、血小板：（）（）.3.临床意义主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型：主要用于辅助鉴别急性白血病细胞类型：急性粒细胞白血病急性粒细胞白血病：（+）急性早幼粒细胞白血病：强（急性早幼粒细胞白血病：强（+）急性单核细胞白血病：（）急性单核细胞白血病：（）急粒急粒-单单：粒细胞（：粒细胞（+）单核细胞（）单核细胞（）急性巨核细胞性白血病：（）急性巨核细胞性白血病：（）急性淋巴细胞白血病：（）急性淋巴细胞白血病：（）.原原理理 ：非特异性脂酶在相应的非特异性脂酶在相应的pH环境中，环境中，将基质液中相应底物水解，产生含萘酚将基质液中相应底物水解，产生含萘酚 的物质，后者与重氮盐发生偶联反应，的物质，后者与重氮盐发生偶联反应，形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质 内酶所在的部位。内酶所在的部位。（二）非特异性脂酶染色二）非特异性脂酶染色.根据根据pH值的不同分为：值的不同分为：酸性：酸性：酸性酸性-醋酸萘酚酯酶染色醋酸萘酚酯酶染色(ANAE)中性：中性：-醋酸萘酚酯酶染色醋酸萘酚酯酶染色(-NAE)醋酸醋酸AS-D萘酚酯酶染色萘酚酯酶染色(NAS-DAE)碱性：碱性：-丁酸萘酚酯酶染色丁酸萘酚酯酶染色(-NBE).名称名称pHpH底物底物生成物生成物重氮盐重氮盐(产物颜色产物颜色)-醋酸萘酚酯酶醋酸萘酚酯酶(-NAE)中中-醋酸萘酚醋酸萘酚-萘酚萘酚坚牢蓝坚牢蓝B棕黑棕黑,灰黑灰黑醋酸醋酸AS-D萘酚酯萘酚酯酶酶(AS-DNAE)中中醋酸醋酸AS-D萘萘酚酚AS-D萘萘酚酚坚牢蓝坚牢蓝BB蓝蓝-丁酸萘酚酯酶丁酸萘酚酯酶(-NBE)碱碱-丁酸萘酚丁酸萘酚-萘酚萘酚坚牢紫酱坚牢紫酱GBC红红酸性酸性-醋酸萘酚醋酸萘酚酯酶酯酶(ANAE)酸酸-醋酸萘酚醋酸萘酚-萘萘酚酚六偶氮六偶氮付品红付品红红红.1.1.-醋酸萘酚酯酶染色醋酸萘酚酯酶染色（-naphthol acetate esterase-naphthol acetate esterase，-NAE-NAE）.-醋酸萘酚酯酶醋酸萘酚酯酶 （细胞内）（细胞内）-醋酸萘酚醋酸萘酚 （基质液中）（基质液中）-萘酚萘酚 重氮盐重氮盐（坚牢蓝（坚牢蓝B B）胞浆不溶性灰黑色胞浆不溶性灰黑色 或棕黑色沉淀或棕黑色沉淀水解水解【原理】【原理】.【结果判断】【结果判断】胞浆内有胞浆内有灰黑色或棕黑色灰黑色或棕黑色弥散性颗粒弥散性颗粒状沉淀为阳性。状沉淀为阳性。.-醋酸萘酚酯酶染色醋酸萘酚酯酶染色(灰黑色、棕黑色灰黑色、棕黑色).-醋酸萘酚酯酶染色醋酸萘酚酯酶染色a:单核单核b:BPCc:巨核巨核d:LC(+)e:幼红幼红(-).氟化钠抑制试验氟化钠抑制试验 在基质液中加入适量在基质液中加入适量NaF,NaF,其余染色方其余染色方法同上。法同上。两种方法染色后用油镜计数两种方法染色后用油镜计数100100或或200200个个被检细胞，分别计算出抑制前和抑制后被检细胞，分别计算出抑制前和抑制后的阳性率或阳性积分。的阳性率或阳性积分。.氟化钠抑制率氟化钠抑制率=抑制前阳性率或阳性积分抑制前阳性率或阳性积分 -抑制后阳性率或阳性积分抑制后阳性率或阳性积分抑制前阳性率或阳性积分抑制前阳性率或阳性积分100%.A A图：急性单核细胞白血病图：急性单核细胞白血病-NAE-NAE染色染色 原始、幼稚单核细胞多呈强阳性 B B图：急性单核细胞白血病图：急性单核细胞白血病 -NAE氟化钠抑制染色原始、幼稚单核细胞阳性反应被氟化钠抑制（与A图为同一标本）A A B B.【临床评价】【临床评价】急单急单 急粒急粒 急性早幼粒急性早幼粒 急粒单急粒单 急淋急淋-NAE-NAE +或或 -或或 +阳性阳性 -+弱弱+NaF NaF 被抑制被抑制 不被不被 不被抑制不被抑制 部分被抑制部分被抑制 抑制抑制 部分未被抑制部分未被抑制主要用于鉴别急性白血病类型主要用于鉴别急性白血病类型.2.临床意义辅助鉴别急性白血病细胞类型辅助鉴别急性白血病细胞类型急单：单核细胞阳性，急单：单核细胞阳性，能被能被NaF抑制抑制。急粒：粒细胞弱阳性，急粒：粒细胞弱阳性，不被不被NaF抑制抑制。.M3：强阳性，：强阳性，不能被不能被NaF抑制抑制。M4：部分部分阳性细胞阳性细胞能被能被NaF抑制抑制，部分部分阳性细胞阳性细胞不能被不能被NaF抑制抑制。ALL：原幼淋阴性或阳性，：原幼淋阴性或阳性，不能被不能被NaF抑制抑制。.【正常血细胞染色反应】【正常血细胞染色反应】1.1.单核细胞系统单核细胞系统 原始单核细胞原始单核细胞 分化差分化差 阴性阴性 分化好分化好 阳性阳性 幼稚及成熟单核细胞幼稚及成熟单核细胞 阳性阳性被氟化钠抑制被氟化钠抑制.2.2.粒细胞系统粒细胞系统 原粒细胞原粒细胞阴性或弱阳性阴性或弱阳性 以下阶段为以下阶段为弱阳性弱阳性 3.3.淋巴细胞系统淋巴细胞系统 多数多数阴性阴性，少数，少数弱阳性弱阳性 不不被被氟氟化化钠钠抑抑制制.2.-丁酸奈酚酯酶染色丁酸奈酚酯酶染色-NBE原理：原理：血细胞中血细胞中-NBE在碱性条件下，基在碱性条件下，基质液中的质液中的-丁酸奈酚水解，产生丁酸奈酚水解，产生-奈酚，奈酚，后者与坚牢酱紫后者与坚牢酱紫GBC偶联，形成不溶性偶联，形成不溶性红色沉淀，定位于胞质内。红色沉淀，定位于胞质内。.-NBE染色反应染色反应1.粒系：各期（粒系：各期（-）2.单单核核系系：分分化化差差的的原原单单（-）；分分化化好好的的原原单单（+）幼单幼单成熟单核（成熟单核（+），），可被可被NaF抑制抑制3.淋巴系：淋巴系：TC、非、非T非非B（+）BC（+）4.其他细胞其他细胞：巨核、有核红细胞、浆细胞（巨核、有核红细胞、浆细胞（-）或弱（）或弱（+）组织细胞组织细胞(+),不被不被NaF抑制抑制.3.酸性酸性-醋酸奈酚酯酶染色醋酸奈酚酯酶染色ANAE 原理：血细胞中的酸性酸性-醋酸奈酚酯酶醋酸奈酚酯酶（ANAE）在）在pH弱酸性（弱酸性（pH5.8）的条件）的条件下，可水解基质液中的下，可水解基质液中的-醋酸奈酚，产醋酸奈酚，产生生-奈酚，进而与重氮盐六偶氮付品红奈酚，进而与重氮盐六偶氮付品红形成不溶性红色沉淀，定位于细胞质内形成不溶性红色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。酶所在的部位。.酸性酸性-醋酸萘酚酯酶染色（弥漫性棕红色）醋酸萘酚酯酶染色（弥漫性棕红色）-M5.ANAE染色反应1.单核系：强（+）可被可被NaF抑制抑制2.淋巴系：TC（+）BC（-）3.其他细胞：粒系（-）或弱（+）不被被NaF抑制抑制红系、巨核系（红系、巨核系（-）.4.酯酶双染色酯酶双染色 在同一张涂片上进行两种酯酶染色在同一张涂片上进行两种酯酶染色特异性酯酶特异性酯酶 +非特异性酯酶非特异性酯酶 对诊断急性粒对诊断急性粒-单细胞白血病有独特价值单细胞白血病有独特价值-NAE-NAE与与与与NNAS-DCEAS-DCE红色红色红色红色(单单单单)-NBE-NBE与与与与 NNAS-DCEAS-DCE兰色兰色兰色兰色(粒粒粒粒).骨髓涂片特异性酯酶（CE）和非特异性酯酶（NAE）的双酯酶染色显示，原始粒细胞胞浆呈蓝色CE阳性反应；而原始单核细胞胞浆呈棕色的NAE阳性反应。.NAS-DCE：M1弱弱(+)/M2(+)/M3强强(+)，M5/ALL()；-NBE：M5(+)NaF抑制，抑制，M1/M2/M3/ALL()；-NAE/NAS-DAE：M5强强(+)NaF抑制抑制M3强强(+)/M1M2a/ALL(+)NaF不抑制。不抑制。.五、过碘酸五、过碘酸-希夫反应希夫反应 (糖原染色糖原染色 )（periodic acid-Schiff reactionperiodic acid-Schiff reaction，PASPAS）.双醛基双醛基过碘酸过碘酸希夫试剂中希夫试剂中的无色品红的无色品红 紫红色化合物紫红色化合物 (附于含多糖类附于含多糖类 的胞浆内的胞浆内)乙二醇基乙二醇基(多糖类物质含有多糖类物质含有)氧化氧化【原理】【原理】.过碘酸是氧化剂，使含有过碘酸是氧化剂，使含有乙二醇乙二醇 基基的多糖类物质的多糖类物质(糖原、糖蛋白、糖脂、糖原、糖蛋白、糖脂、粘多糖粘多糖等等)氧化，氧化，形成形成双醛基双醛基。醛基与。醛基与Schiffs液中的无色品红结合，使无色液中的无色品红结合，使无色品红变成紫红色化合物，定位于品红变成紫红色化合物，定位于含多糖含多糖类类的细胞内。的细胞内。一、原理一、原理.【结果判断】【结果判断】阳性阳性 胞浆内红色阳性物呈弥散状、颗胞浆内红色阳性物呈弥散状、颗 粒状或块状。粒状或块状。阴性阴性 胞浆内无色或无颗粒胞浆内无色或无颗粒,核淡绿。核淡绿。.1.粒细胞系统：粒细胞系统：（阳性逐渐增强）（阳性逐渐增强）原始粒原始粒C（）或（）或（+）早幼粒早幼粒C成熟中性粒成熟中性粒C（+）：）：细颗粒均匀红色细颗粒均匀红色嗜酸粒嗜酸粒C：颗粒不着色，：颗粒不着色，胞质呈红色胞质呈红色。嗜碱粒嗜碱粒C：颗粒阳性颗粒阳性，胞质不着色。，胞质不着色。二、正常血细胞的染色反应二、正常血细胞的染色反应.2.单核细胞系统：分化差（）其他（单核细胞系统：分化差（）其他（+），），粗颗粒状粗颗粒状。3.淋巴细胞系统：多数（）少数（淋巴细胞系统：多数（）少数（+），），粗颗粒或块状粗颗粒或块状。4.红细胞系统：（），红细胞系统：（），病理情况可（病理情况可（+）。）。5.巨核细胞系统：（巨核细胞系统：（+），颗粒状或块状。），颗粒状或块状。6.其它细胞：浆细胞（），巨噬细胞（其它细胞：浆细胞（），巨噬细胞（+）.a粒细胞、粒细胞、b巨核细胞、巨核细胞、c单核细胞、单核细胞、d幼红细胞幼红细胞.三、结果判断三、结果判断1.粒细胞系统：粒细胞系统：红色、弥散状。红色、弥散状。各种细胞阳性反应强弱不同各种细胞阳性反应强弱不同 2.淋巴细胞系统：淋巴细胞系统：粗颗粒状、小块状、大块状红色。粗颗粒状、小块状、大块状红色。.1、+2、+3、+4、+5、.3.红细胞系统：红细胞系统：均匀红色或块状均匀红色或块状4.单核细胞系统：单核细胞系统：粗颗粒状粗颗粒状 5.巨核细胞和血小板巨核细胞和血小板：颗粒状、块状。颗粒状、块状。.1.巨核细胞和血小板阳性巨核细胞和血小板阳性.1.帮助鉴别巨幼细胞性贫血和骨帮助鉴别巨幼细胞性贫血和骨髓增生异常综合征、红白血病髓增生异常综合征、红白血病:前者（），后两者（前者（），后两者（+）。）。四、临床意义四、临床意义.急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病PAS染色染色原始、幼稚淋巴细胞均阳性，呈粗颗粒状阳性.109急淋急淋急淋急淋PASPAS阳性细胞阳性细胞阳性细胞阳性细胞.110PASPAS阳性的幼红细胞阳性的幼红细胞阳性的幼红细胞阳性的幼红细胞.2.帮助鉴别急性白血病的细胞类型：帮助鉴别急性白血病的细胞类型：急淋：（急淋：（+）呈粗颗粒状或块状。）呈粗颗粒状或块状。急粒：（急粒：（+）细颗粒状或均匀红色。）细颗粒状或均匀红色。急单：（急单：（+）细颗粒状，均匀分布，）细颗粒状，均匀分布，有时胞质边缘颗粒较粗大。有时胞质边缘颗粒较粗大。.3.其他细胞：其他细胞：骨髓转移性腺癌细胞细胞呈强阳性骨髓转移性腺癌细胞细胞呈强阳性 霍奇金淋巴瘤霍奇金淋巴瘤RSRS细胞多呈细胞多呈阴性或弱阳性阴性或弱阳性 戈谢细胞呈强阳性戈谢细胞呈强阳性 尼曼尼曼-皮克细胞多呈阴性皮克细胞多呈阴性或弱阳性或弱阳性.CLLALL.六、六、中性粒细胞碱性磷酸酶染色中性粒细胞碱性磷酸酶染色 （neutrophilic alkalineneutrophilic alkaline phosphatase phosphatase，NAPNAP）.磷酸萘酚钠磷酸萘酚钠 （基质中）（基质中）中性粒细胞中性粒细胞胞浆中胞浆中NAPNAP磷酸钠磷酸钠-萘酚萘酚 重氮盐重氮盐（坚牢蓝盐（坚牢蓝盐RRRR）紫黑色偶氮染料紫黑色偶氮染料 （胞浆中）（胞浆中）水解水解【原理】【原理】KaplowKaplow偶氮偶联法偶氮偶联法.【结果判断】【结果判断】胞浆中有紫黑色颗粒为阳性胞浆中有紫黑色颗粒为阳性(+(+）.【正常血细胞染色反应】【正常血细胞染色反应】1.1.中性成熟粒细胞中性成熟粒细胞阳性反应阳性反应NAP主主要要存存在在于于成成熟熟的的中中性性粒粒细细胞胞胞胞质质中中。严严重重的的化化脓脓性性感感染染时时，晚晚幼幼阶阶段段粒粒细细胞胞也可见有阳性反应。也可见有阳性反应。2.2.其他细胞基本呈阴性反应其他细胞基本呈阴性反应 .NAP染色反应强度标准：染色反应强度标准：（）：胞质中无颗粒；（）：胞质中无颗粒；（）：胞质含少量颗粒，约占（）：胞质含少量颗粒，约占1/4；（）：胞质含中等量颗粒，约占（）：胞质含中等量颗粒，约占1/2；（）（）：胞质含较多颗粒，约占胞质含较多颗粒，约占3/4；（）：胞质充满颗粒，无空隙。（）：胞质充满颗粒，无空隙。.2.NAP2.NAP积分值积分值 计数计数100100个成熟中性粒细胞（杆状个成熟中性粒细胞（杆状和分叶）和分叶）,分别记录其分级情况：分别记录其分级情况：.(-)0 (-)0分分 (+)1 (+)1分分 (+)2 (+)2分分 (+)3 (+)3分分 (+)4 (+)4分分 阳性率阳性率 全部阳性反应细胞之和全部阳性反应细胞之和 积分值积分值 各种阳性程度细胞的分值之和各种阳性程度细胞的分值之和.NAP染色结果报告包括阳性率和积分值。染色结果报告包括阳性率和积分值。阳阳性性率率：指指计计数数100个个中中性性成成熟熟粒粒细细胞胞，其其阳阳性性细细胞胞的的数数量量即即为为阳阳性性率率；积积分分值值：指指计计数数100个个中中性性成成熟熟粒粒细细胞胞，不不同同阳阳性性程程度度细细胞胞数数量量乘乘以以其其阳阳性性程程度度之之和和即即为为积积分分值值，其其计计算算公公式式为为：积积分分值值=()数数量量1+()数数量量2+()数量数量3+()数量数量4。2.NAP染色结果报告染色结果报告：.例：4分 占20%420=80分3分 占40%340=120分2分 占18%218=36分1分 占10%110=10分0分 占12%012=0分阳性率88%积分=246分.0级 0 胞浆呈原色，无颗粒。级 +胞浆呈浅灰色，细小蓝黑色颗粒占胞浆面积的25%50%。级 +胞浆呈棕色片状沉淀，小到中等颗粒约占胞浆面积的50%75%。.级 +胞浆充满棕黑色沉淀，分布均匀，中到大颗粒占胞浆面积的75%100%。级 +胞浆充满深黑色致密的团块状沉淀，甚至遮盖胞核，中到大颗粒占胞浆面积的l00%。.3.参考范围：参考范围：中性粒细胞中性粒细胞NAP阳性率：阳性率：40%NAP积分为：积分为：30130分分.【临床评价】【临床评价】（1 1）细菌性感染与病毒性感染）细菌性感染与病毒性感染 （尤其是化脓性感染）（尤其是化脓性感染）明显增加明显增加 无明显变化无明显变化.四、临床意义1.生理性变化：应激状态、妊娠、新生儿等。生理性变化：应激状态、妊娠、新生儿等。2.病理性变化：病理性变化：(1)NAP：细菌性感染、慢粒细菌性感染、慢粒(加、急加、急)、急、急 淋、慢淋、恶性淋巴瘤、转移癌、淋、慢淋、恶性淋巴瘤、转移癌、骨纤、真红、再障、原发性血小骨纤、真红、再障、原发性血小 板增多症、使用糖皮质激素等。板增多症、使用糖皮质激素等。.3.疾病的鉴别：(1)类白与慢粒类白与慢粒:前者前者 后者后者 (2)慢粒慢性期与慢粒慢性期与慢性中性粒细胞白血病：慢性中性粒细胞白血病：前者前者 后者后者 (3)细菌性感染与病毒性感染细菌性感染与病毒性感染/寄生虫感染：寄生虫感染：前者前者 后两者正常或后两者正常或(2)NAP：慢粒慢粒(慢慢)、PNH、MDS、恶组等。、恶组等。.(6)恶组与反应性组织细胞增多症：恶组与反应性组织细胞增多症：前者前者 后者常后者常(7)急性白血病类型：急性白血病类型：急性髓细胞急性髓细胞 急淋急淋(4)慢粒病情观察：慢粒病情观察：(5)再障与阵发性睡眠性血红蛋白尿：再障与阵发性睡眠性血红蛋白尿：前者前者 后者后者.CML类白类白.(2(2）类白血病反应与慢性粒细胞白血病）类白血病反应与慢性粒细胞白血病 明显增加明显增加 明显下降且常为零分，明显下降且常为零分，缓解时又上升到正常缓解时又上升到正常.五、应用评价NAP染色有多种检测方法，国际标准化委员会推荐染色有多种检测方法，国际标准化委员会推荐Kaplow萘酚萘酚AS-BI磷酸钠法和磷酸钠法和Tomonaga萘酚萘酚AS-MX磷酸钠法。钙磷酸钠法。钙-钴法试剂成本低廉，操作繁琐，反应钴法试剂成本低廉，操作繁琐，反应时间长，临床上逐步被偶氮偶联法取代，阳性产物色时间长，临床上逐步被偶氮偶联法取代，阳性产物色泽鲜明、定位精确，尤其以萘酚泽鲜明、定位精确，尤其以萘酚AS-BI磷酸钠法最为磷酸钠法最为广泛使用，利于评定广泛使用，利于评定NAP活性强度的分级。常用重氮活性强度的分级。常用重氮盐有坚牢蓝盐有坚牢蓝RR、坚牢蓝、坚牢蓝BB、坚牢紫酱等，不同偶联、坚牢紫酱等，不同偶联有不同的灵敏度。有不同的灵敏度。.七、酸性磷酸酶染色七、酸性磷酸酶染色(acidphosphatase，ACP)一一一一、原理、原理1.Gomori硫化铅法硫化铅法.棕黑色pH5.0.2.偶氮偶联法偶氮偶联法(常用常用)六偶氮付品红六偶氮付品红棕红色沉淀棕红色沉淀 磷酸萘酚磷酸萘酚磷酸萘酚磷酸萘酚磷酸萘酚磷酸萘酚AS-BIAS-BIAS-BI 萘酚萘酚萘酚萘酚萘酚萘酚AS-BIAS-BIAS-BI棕红色棕红色棕红色棕红色棕红色棕红色沉淀沉淀沉淀沉淀沉淀沉淀 ACPACPPh5.0Ph5.0重氮盐重氮盐重氮盐重氮盐.3.抗酒石酸酸性磷酸酶染色（一组同工酶）抗酒石酸酸性磷酸酶染色（一组同工酶）两张相同标本涂片两张相同标本涂片+两份基质液两份基质液(加加L-L-酒石酸，不加酒石酸，不加 L-L-酒石酸酒石酸)ACP染色染色耐耐L-酒石酸酒石酸两份（两份（+）不耐不耐L-酒石酸酒石酸不加不加L-酒石酸（酒石酸（+）加加L-酒石酸（）酒石酸（）.二、正常血细胞染色反应 粒细胞、单核细胞、淋巴细粒细胞、单核细胞、淋巴细 胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、胞、巨核细胞、血小板、浆细胞、巨噬细胞均呈阳性反应。巨噬细胞均呈阳性反应。.三、临床评价1.诊断多毛细胞白血病诊断多毛细胞白血病多毛细胞白血病：多毛细胞白血病：（+），不被），不被L-酒石酸抑制。酒石酸抑制。慢淋和恶性淋巴瘤细胞慢淋和恶性淋巴瘤细胞:（+），被），被L-酒石酸抑制。酒石酸抑制。.多毛细胞白血病多毛细胞白血病多毛细胞白血病多毛细胞白血病慢性淋巴细胞慢性淋巴细胞慢性淋巴细胞慢性淋巴细胞白血病白血病白血病白血病.抗酒石酸酸性磷抗酒石酸酸性磷抗酒石酸酸性磷抗酒石酸酸性磷酸酶染色酸酶染色酸酶染色酸酶染色酸性磷酸酶染色酸性磷酸酶染色酸性磷酸酶染色酸性磷酸酶染色多毛细胞白血病多毛细胞白血病多毛细胞白血病多毛细胞白血病多毛细胞白血病多毛细胞白血病.多毛细胞白血病多毛细胞白血病抗抗L-酒石酸酒石酸ACP阳性阳性.2.鉴别戈谢鉴别戈谢(Gaucher)细胞和尼曼细胞和尼曼-匹匹克克(Niemann-Picks)细胞：细胞：前者（前者（+）后者（）后者（）3.鉴别鉴别T淋巴细胞和淋巴细胞和B淋巴细胞：淋巴细胞：前者（前者（+）后者（）后者（）.GaucherGauchersscellcell.八.细胞化学染色综合分析.四种常见急性白血病的细胞化学染色结果四种常见急性白血病的细胞化学染色结果项目项目M3M1/M2M5ALLPOX强阳性强阳性阳性阳性/阴性阴性弱阳性弱阳性/阴性阴性阴性阴性 NAS-DCE强阳性强阳性阳性阳性/阴性阴性多阴性多阴性阴性阴性-NAE强阳性强阳性阴性阴性/弱阳性弱阳性阳至强阳性阳至强阳性阴性阴性/阳性阳性-NAE+NaF 不抑制不抑制 不抑制不抑制抑制抑制不抑制不抑制-NBE阴性阴性阴性阴性阳性阳性阴性阴性 -NBE+NaF抑制抑制.急非淋急非淋 脂酶染色脂酶染色NAP：类白与慢粒、感染类型、再障与类白与慢粒、感染类型、再障与PNH、慢粒分期；、慢粒分期；ACP：毛白、毛白、T细胞细胞/B细胞、脂代谢障碍；细胞、脂代谢障碍；PAS：巨幼贫与巨幼贫与MDS-RA、红白血病；、红白血病；铁染色：铁染色：缺铁贫、铁粒幼贫、缺铁贫、铁粒幼贫、MDS-RAS。急淋急淋POX急性白血病急性白血病.151PAS:阳性，颗阳性，颗粒状粒状NAP:积分增高积分增高PAS:大小不大小不定定块状阳性块状阳性NAP:积分增高积分增高L1、L2、L3形态区分形态区分M7，可做免疫分型，可做免疫分型ANAE+NaFANAE+NaF抑制抑制M5：阳性强阳性，：阳性强阳性，抑制率抑制率50M4:阳性，抑制率阳性，抑制率50（形态、做酯酶双染）（形态、做酯酶双染）NAP:积分减低积分减低涂片可见较多幼稚细胞涂片可见较多幼稚细胞POX染色染色阴阴 性性（阳阳 性性 率率3%)阳性，强阳性阳性，强阳性 阴性或弱阳性阴性或弱阳性（部分阴性，部分阳性（部分阴性，部分阳性）PAS+NAPM2、M3最强最强M1M1、M5M5最弱最弱最弱最弱（CECE阳性，形阳性，形阳性，形阳性，形态区分）态区分）态区分）态区分）NAP:积分减低积分减低CE.1.1.常用的化学反应种类不包括下列哪种常用的化学反应种类不包括下列哪种A.A.偶氮偶联法偶氮偶联法 B.B.联苯胺法联苯胺法C.C.普鲁士蓝反应普鲁士蓝反应 D.D.中和反应中和反应 E.E.希夫反应希夫反应2.2.临床上辅助判断急性白血病类型首选最重要的细临床上辅助判断急性白血病类型首选最重要的细胞化学染色是胞化学染色是A.A.特异性酯酶特异性酯酶 B.B.非特异性酯酶非特异性酯酶 C.C.过氧化物酶过氧化物酶D.D.中性粒细胞碱性磷酸酶中性粒细胞碱性磷酸酶 E.E.酸性磷酸酶酸性磷酸酶3.3.特异性及非特异性酯酶的染色方法是特