现代医学实验学-成骨细胞的培养和骨折模型的制作.ppt

成骨细胞的培养及骨折模型的制作成骨细胞的培养及骨折模型的制作青岛大学医学院青岛大学医学院阎春玲阎春玲l成骨细胞的培养可广泛应用于骨折及骨损伤的疾病研究中，同时为筛选新型药物和研究机制提供离体研究。l原代培养原代培养l细胞株细胞株 成骨细胞的培养及检测成骨细胞的培养及检测 原代培养原代培养l成骨细胞的来源国内外文献报道新生动物的颅骨或胚胎颅骨为成骨细胞的常用来源。l有不少学者尝试用新生大鼠的颅骨分离成骨细胞，结果表明所培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞的形态特征、生物学活性及发生钙化的功能。l有学者研究兔盖骨的成骨细胞增殖代谢及钙化的能力发现，来自兔盖骨的成骨细胞具有较高的增殖能力，但碱性磷酸酶的生成较低，而且兔盖骨来源的成骨细胞在体外培养中可以形成有序的钙化结节和羟基磷灰石(HA)结晶。小鼠原代培养小鼠原代培养1.取新生取新生3d以内以内BALB/c小鼠，断颈处死后立即投入小鼠，断颈处死后立即投入75%酒精酒精中消毒中消毒5min。2.D-Hanks液漂洗后分离颅盖骨，刮除骨膜和结缔组织，液漂洗后分离颅盖骨，刮除骨膜和结缔组织，DMEM清洗颅骨骨片并剪碎清洗颅骨骨片并剪碎3.加入加入0.25%胰蛋白酶（含胰蛋白酶（含0.02EDTA），），37恒温消化恒温消化20min，吸出消化液，之后，吸出消化液，之后1mg/1mlI型胶原酶型胶原酶37恒温消化恒温消化20min后后离心（离心（1000r/min，5min），弃上清液），弃上清液4.加入含加入含15%血清的血清的DMEN培养基，吹打骨片（力气不要过大，培养基，吹打骨片（力气不要过大，但要吹打次数多一下，尽量使细胞从松解得骨片上脱落），将但要吹打次数多一下，尽量使细胞从松解得骨片上脱落），将细胞悬液接种于培养瓶中，置于细胞悬液接种于培养瓶中，置于37 CO2恒温孵育箱中培养恒温孵育箱中培养。传代培养步骤传代培养步骤1.弃除旧的培养液（可以吸，可以倒，倒的时候小心）弃除旧的培养液（可以吸，可以倒，倒的时候小心）2.用用PBS冲洗一遍（加冲洗一遍（加PBS清洗或换液时，不要将细胞冲刷下来）清洗或换液时，不要将细胞冲刷下来）3.用用0.25%的胰酶消化液消化的胰酶消化液消化30-45s，在显微镜下观察，细部变圆，在显微镜下观察，细部变圆，间距增大时，可用手拍打瓶侧壁与底壁，会发现细胞很快悬浮。间距增大时，可用手拍打瓶侧壁与底壁，会发现细胞很快悬浮。4.加入含加入含15%的牛血清培养液终止消化的牛血清培养液终止消化5.用吸管反复细心吹打瓶底，置离心管中后，可以用用吸管反复细心吹打瓶底，置离心管中后，可以用PBS或或D-HANKS再吹打，可以反复几次，目的是将细胞尽可能的洗刷干净再吹打，可以反复几次，目的是将细胞尽可能的洗刷干净6.离心离心 大鼠成骨细胞的培养大鼠成骨细胞的培养l将将SD SD 乳鼠置入乳鼠置入75%75%酒精中浸泡酒精中浸泡5min5min。于超净。于超净 台台上取顶骨上取顶骨,放入放入PBS PBS 皿中皿中,刮除附着组织刮除附着组织,待骨质发待骨质发 白、透亮白、透亮,再放入再放入PBS PBS 小瓶反复冲洗小瓶反复冲洗,换液换液3 3 次次,以以0.1%II0.1%II型胶原酶消化型胶原酶消化30min 30min 后吸弃酶液后吸弃酶液,再以再以PBS PBS 冲洗冲洗3 3 次次 ，加入，加入0.1%II0.1%II型胶原酶型胶原酶,将骨剪成将骨剪成1mm2 1mm2 大小大小,放置放置15min 15min 后加入与酶液等量的含后加入与酶液等量的含15 15%小牛血清的小牛血清的DMEM DMEM 培养基培养基,吸取上清液吸取上清液,以以1 000r/1 000r/min min 离心离心10min,10min,将下层液接种于将下层液接种于50ml 50ml 培养瓶培养瓶,离离心液去上清后接种于心液去上清后接种于25ml 25ml 培养瓶培养瓶,分别加入上述分别加入上述培养基培养基,置入置入37 37、5%CO2 5%CO2、饱和湿度培养箱内。、饱和湿度培养箱内。每每2 2 日换液日换液1 1 次次,待细胞长满后待细胞长满后,用用0.25%0.25%胰蛋白胰蛋白酶消化酶消化,按按12 12 比例传代。比例传代。l1.1.成骨细胞的取材：成骨细胞的取材：新生新生SDSD大鼠的乳鼠大鼠的乳鼠 新生新生24h-72h24h-72h的乳鼠的乳鼠l 2.2.将去除血管及结缔组织的骨片放置在将去除血管及结缔组织的骨片放置在1mlPBS1mlPBS液体中（液体中（PBSPBS不要放太不要放太多，否则延长剪碎时间），用剪刀剪成多，否则延长剪碎时间），用剪刀剪成1*1mm1*1mm的组织快，越小越好的组织快，越小越好（越小越能消化完全），一只乳鼠的头盖骨加胰酶（越小越能消化完全），一只乳鼠的头盖骨加胰酶2ml2ml，3737水浴中水浴中消化消化30min30min（目的是消化掉附着骨片上的结缔组织），离心去酶，加（目的是消化掉附着骨片上的结缔组织），离心去酶，加入入2ml2ml胶原酶胶原酶2 2，水浴中继续消化，水浴中继续消化1h1h（中间间隔晃动，使消化下来的胶（中间间隔晃动，使消化下来的胶原离开团块溶于液体中）。如此消化下来的混悬液可能比较稠，可以原离开团块溶于液体中）。如此消化下来的混悬液可能比较稠，可以加适量的加适量的PBSPBS，尽量让胶原溶于液体中，否则不利于离心细胞沉降到，尽量让胶原溶于液体中，否则不利于离心细胞沉降到离心管的底壁。离心管的底壁。l3.3.培养基问题：低糖的培养基问题：低糖的DMEMDMEM培养基培养基 4.4.培养瓶培养瓶 培养瓶在接种前，使用培养瓶在接种前，使用1%1%多聚赖氨酸快速包被（具体方多聚赖氨酸快速包被（具体方法：每个法：每个50ml50ml培养瓶加培养瓶加3-4ml1%3-4ml1%多聚赖氨酸，尽量是底壁均铺满液体，多聚赖氨酸，尽量是底壁均铺满液体，拧上盖子，放置拧上盖子，放置30min30min，倒掉，倒掉1%1%多聚赖氨酸液体，用去离子水或多聚赖氨酸液体，用去离子水或PBSPBS液液冲洗两遍），冲洗两遍），包被的培养瓶，细胞很容易贴壁包被的培养瓶，细胞很容易贴壁 。注意问题注意问题大鼠成骨细胞成骨细胞的鉴定成骨细胞的鉴定形态学观察形态学观察碱性磷酸酶染色碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase(alkaline phosphatase，ALP)ALP)钙化结节染色钙化结节染色 细胞株细胞株 lMC3T3-E1（小鼠胚胎成骨细胞），MC3T3-E1 Subclone 14（小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14）MC3T3-E1 细胞体外培养成骨细胞的影响因素体外培养成骨细胞的影响因素l物理因素l1 电离辐射l单次低剂量辐射（40 cGy 以下）对大鼠成骨细胞样细胞不会引起明显的改变,而单次高剂量辐射（400 cGy）却使克隆成骨细胞系MC3T3-E1 的ALP 活性增加.l2 微重力l目前认为失重条件下骨形成受到抑制是造成骨质脱钙的主要原因，特别是成骨细胞数目的减少和活性的降低。l3 外力lHasegawa 等将鼠成骨细胞培养在可变形塑料膜上，使膜均匀变形，发现机械拉伸能刺激成骨细胞增加DNA 合成，适当的拉应变 刺激，可使培养的细胞中DNA 含量明显增加，还可导致成骨细胞的增殖变快。微量元素l微量元素在骨的形成和生长分化过程中起着重要作用，微量元素缺乏可能使骨骼发育受到碍，甚至可能发生畸形，成骨细胞增殖分化的过程与某些微量元素有着密切的关系1 锌l锌是人体所必需的微量元素，它参与了机体新陈代谢的各个方面。近年来的研究证实锌与骨代谢及机能的关系非常密切，锌缺乏会影响骨骼的生长发育，促进骨质疏松的发生与发展。体外实验表明，锌能够促进大鼠成骨细胞的增殖及分化，促进MC3T3-E1 成骨细胞蛋白质及DNA 的合成。而锌缺乏则抑制大鼠成骨细胞的增殖分化；锌浓度过高会对细胞产生毒性.2 铝l目前认为一些疾病如骨质疏松、骨软化等与铝中毒有关。铝蓄积于骨骼，对骨骼和神经系统等产生危害。文献报道低浓度铝可刺激体外培养的成骨细胞的增殖和分化，铝对成骨细胞的作用不受培养液中生长因子变化的影响。高剂量铝可抑制成骨细胞的生长发育并对其产生一定的毒性作用3 氟l氟 一方面 作为骨基质构成物参与骨形成过程，另一方面，过量的氟摄入可导致齿、骨等组织及器官的损害。体外研究则表明，氟通过对成骨细胞的有丝分裂的作用促使成骨细胞的生长速度加快、数量增多、功能增强。氟对成骨细胞的作用与铝有所不同，需依赖于培养液中部分生长因子，除去这些生长因子，可消除氟对成骨细胞的作用.其它l 铜对骨骼的形成和维持很重要。缺铜骨质中胶原纤维合成受损，骨骼发育受限，结构疏松，长骨易碎，骨发育停止。l锰对粘多糖、溶胶原的合成和骨形成有特殊作用。故补充锰对粘多糖的合成有利l镁、钙等对体外培养SD大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞的增殖分化都具有一个最佳峰值.生长因子l1 骨形态发生蛋白（BMP）1982 年，Urist 等人从牛骨中提纯了牛的BMP,并提出了诱导成骨的新概念。BMP 是一种多肽，具有高效的骨诱导能力，能够促进未分化的间充质细胞和成骨细胞的前体细胞分化为成骨细胞；引导成骨细胞表型的表达等。体外实验中，将BMP 与载体结合临床治疗骨缺损已有许多成功例证.l2 血小板衍生生长因子（PDGF）lPDGF 是一种存在于多种组织中的促细胞有丝分裂的多肽生长因子，能刺激多种细胞分裂、增殖。有研究表明，PDGF促进鸡胚颅骨和新生小鼠颅骨来源的骨细胞的增殖，并使胶原蛋白合成增加。3 成纤维细胞生长因子（FGF）l骨组织内FGF 主要贮存在胞外基质中 是成骨样细胞和骨细胞的强促分裂因子。研究显示，FGF 能刺激成骨细胞内的DNA 合成，使成骨细胞内骨钙素增加，加速骨的钙化，使新骨形成。4 转化生长因子-（TGF-）l骨是TGF-最大的组织来源和储存库，成骨细胞是骨组织中合成TGF-的主要细胞。同时，在成骨细胞的细胞膜上有TGF-的特异性受体，TGF-可作用于成骨细胞，调节其增殖和分化。体外研究表明，TGF-对成骨细胞的作用是非常复杂的。激素激素l1 生长激素（GH）lGH 对骨有促生长作用 人类生长激素能够增加人类骨髓基质细胞的胶原产物 l2 雌激素（E）l绝经后雌激素水平下降造成骨质疏松，提示了雌激素对成骨细胞的重要性。有研究发现，雌二醇（E2）可浓度依赖性的刺激人的类成骨细胞株TE85 细胞增殖促进细胞胶原蛋白及碱性磷酸酶和骨钙素的合成。l 3 甲状腺激素l T3 可刺激骨钙素和胶原的产生，还可通过成骨细胞增加生长因子和结合蛋白的合成和分泌l1 鼠模型 l鼠价格低廉、喂养方便、生长周期短，并且基因组图谱详尽，可以更好地研究骨修复分子机制，是常用的骨折愈合动物模型。鼠的骺板终生存在，可用于制作婴幼儿骨骺坏死的模型。并且鼠没有呕吐反射，在进行口服给药并且需要定量的实验中较为适用。l在大鼠胫骨 和股骨 上制备横形骨折模型。这种模型可重复性高、操作简便。骨折模型的建立骨折模型的建立2 犬模型 l犬是制备骨折愈合模型最常用的动物。成年犬与人类骨骼相似程度最高，并且根据 检测，犬的骨折强度也与人类相似 。l另一方面，犬是杂食类动物，其消化系统与人相似，可进行口服给药。3 兔模型 l兔性情温顺，便于饲养，耳缘静脉便于取血，也是制备模型时较为常用的动物。兔的骨骼转化速度快，约达到了人类的 3 倍，因此可以在短期内观察骨折愈合时骨组织的变化 l但兔是草食类动物，消化系统与人差异较大，不应用于骨折愈合的药物治疗实验。兔的后肢发达，股骨粗大，可用于股骨头坏死的动物模型制备，也多用于疲劳性骨折的模型制备家兔骨折模型的复制家兔骨折模型的复制l将实验动物用戊巴比妥钠 耳缘静脉麻醉，在无菌操作下,取右挠骨中段背侧纵行切2cm,在肱挠肌键深面纵行切开骨膜约6cm,、环形剥离骨膜,用特制宽度为3mm 单叶手锯,将挠骨垂直锯断造成3mm缺损(分离移位,对侧骨膜完整)冲洗缝合骨膜皮肤.大鼠骨缺损模型的建立大鼠骨缺损模型的建立：l选用健康体重为25020gWistar大鼠，用3%戊巴比妥钠30mg/Kg腹腔注射全麻，在无菌操作下，用12号针头经皮钻孔消弱右侧胫骨皮质。经前正中做皮肤切口至近端胫骨结节，用9号针头经相应的皮质插入髓腔，终于远端胫骨生长板的近端。在预先消弱点做胫骨骨折。术后用1号线缝合皮肤，摄X线片证明固定和复位。麻醉清醒后，自由活动 骨质疏松模型的建立l雌性SD大鼠 体重220260 g，分为对照组、假手术组、去势组。除对照组外，其他各组大鼠行卵巢切除术，以l戊巴比妥钠34 mlkg腹腔注射麻醉，无菌条件下行背部肋下双侧卵巢切除，假手术组术式相同，但不摘除卵巢。术后常规饲养、自由饮水摄食 挤压挫伤模型的建立挤压挫伤模型的建立l分别将家兔四肢固定,以50kg的重物压迫家兔的左右肢,持续1小时,1小时后解除压迫和固定,家兔左右后肢出现强直,失去运动能力，活动以健肢代替，除去后肢骨折和脱臼的家兔，即为实验用左后肢软组织损伤病理模型。