DB37∕T 4093—2020 用于核酸提取的鱼类样本野外采集、处理及保存技术规范(山东省).pdf

TCS 65.150 B 50 DB37 山东省山巳ET且，万标准DB37/T 4093-2020 用于核酸提取的鱼类样本野外采集、处理及保存技术规范Technical specification for collection, processing and storage of fish samples for nucleic acid extraction in nature environment 2020 - 08 -20发布2020 - 09 -20实施山东省市场监督管理局发布DB37/T 4093-2020 目次前言. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1范围. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2规范性引用文件. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3术语和定义. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4缩回各i吾. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5样本采集前准备.2 5. 1采集方案设计.2 5. 2稀有或珍惜物种的采集.2 5. 3采集工具和材料.2 6鱼类获取.2 6.1获取方法.2 6. 2鱼类信息记录.2 6. 3拍照规范.2 7样本采集及处理. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7. 1消毒.3 7. 2鱼的预处理. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 7. 3取样3 7. 4样本处理.4 7. 5取样量. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 8编码规则.5 8.1鱼类凭证编号. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 8. 2组织样本编号. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 9样本运输.5 9.1运输要求. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 9. 2样本包装. . 5 9. 3干冰需求量. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 10样本储存. . . . . . 6 11质量控制. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 附录A(规范性附录)野外鱼类采集信息表. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 附录B(规范性附录)拍照例图.8 附录c(规范性附录)鱼体各器官对应的英文缩写. I 目IJ昌本标准按GB!T1. 1-2009给出的规则起草。本标准白山东省海洋局提出并组织实施。本标准由山东省海洋标准化技术委员会归口o本标准负责起草单位:青岛华大基因研究院。本标准主要起草人:张梦琪、刘姗姗、王萌萌、苏小珊、孟亮。DB37/T 4093-2020 II DB37/T 4093-2020 用于核酸提取的鱼类样本野外采集、处理及保存技术规范1 范围本标准规定了用于核酸提取的鱼类样本野外采集、处理及保存的技术规范及其相关要求。本标准适用于在野外获取分子生物学、基因组学相关研究的鱼类样本。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。HJ 628 生物遗传资源采集技术规范3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1 野外nature environment 泛指市场、码头、养殖场、海水以及淡水水域等非实验室环境。3. 2 用于核酸提取的鱼类样本fish sample for nucleic acid 在鱼体上采集到的、可进行高质量核酸提取并应用于分子生物学、基因组学相关研究的组织和器官。3. 3 伤害性取样destructive samp i ing 将鱼体进行有效麻醉或低温休克，通过解剖来获得新鲜鱼类组织、器官等样本的取样方法。3.4 轻微伤害性取样non-destructive sampl ing 将鱼体进行有效麻醉或低温休克，通过来集血液、鳝条等组织，保证鱼体存活并对其生理机能和生命不产生重大影响的取样方法。3.5 尾静脉ta i I ve i n 尾静脉是指紧贴于鱼体尾椎骨下方的静脉血管。4缩略i吾下列缩略i吾适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸CDeoxyribonucleicAcid) RNA:核糖核酸CRibonucleicAcid) DB37/T 4093-2020 MS-222:间氨基苯甲酸乙醋甲E黄酸盐C3-Aminobenzoicacid ethyl ester methanesulfonate) 5 样本采集前准备5. 1 采集方案设计采集鱼类之前应制定完整的采集方案，了解野外采集区域鱼类的分布，根据当地自然情况制定采集路线，避免无目的的采集活动破坏鱼类的自然栖息地。5.2 稀有或珍惜物种的采集若需采集的鱼类属于稀有或珍惜物种，应当按照相关法律法规的要求，向相关主管部门提出申请，获得批准后方可实施采集。5.3 采集工具和材料5.3.1 样本处理器材医用剪刀、解剖刀、摄子、解剖盘、乳胶于套、医用口罩、毛巾、酒精棉球、j去存管、冻存管盒、封口袋、封口膜、注射器、巴民吸管、液氮罐。器材应进行洗净并消毒，确保无核酸酶污染。5.3.2 处理和保存试剂0.65 %生理盐水(淡水鱼用)、1.2%生理盐水(海水鱼用)、75%乙醇、无水乙醇、抗i疑剂、MS-222、无RNA酶水、RNA保存液。5.3.3 记录工具抗冻标签纸、拍照背号恨、比色卡、标尺(量程20cm、分度值O.1 cm)、蓄电电子秤、高清相机、记号笔、铅笔等。5.3.4 运输耗材泡沫箱、棉花、冰袋、干冰。6 鱼类获取6. 1 获取方法在市场、码头、养殖场、自然水域等地，通过购买、垂钓、捕捞等方法获取。6. 2 鱼类信息记录现场获取到新鲜活体鱼类后，填写野外鱼类采集信息表)，详见附录Ao6. 3 拍照规范2 DB37/T 4093-2020 选取干净的白色平板作为背景板，同批鱼类尽量保证用同一背景板。同时，准备比色卡(消除因光照、拍摄原因造成的误差)、标尺、鱼类对应的采集编号等。具体要求如下:a) 建议选用500万以上像素的相机进行拍照;b) 鱼体摆放方向为头朝左尾朝右;c) 标尺和比色卡需要与鱼体同框;d) 照片必须要有鱼类采集编号的体现，具体图例见附录B。7 样本采集及处理7. 1 消毒选择通风、整洁的环境，解剖盘置于平整的台面上，解剖工具用75%乙醇消毒。7. 2 鱼的预处理7.2.1 总则取样前需对鱼体进行预处理使其失去知觉，在最大程度减少鱼体痛苦的情况下进行操作。对于进行伤害性取样的鱼类及轻微伤害性取样的冷水性鱼类，推荐使用麻醉的处理方式;对于轻微伤害性取样的其它鱼类，尤其是稀有或珍惜物种，推荐使用低温休克的处理方式。7. 2. 2 麻醉用MS-222麻醉剂对采集到的鲜活鱼进行麻醉，麻醉剂的推荐使用量为20mg/L，并根据鱼体大小及水温来进行适当调整。如需添加，每次添加量小于当前用量的10%。在添加麻醉剂后注意观察鱼的活性，若鱼体失去平衡、鲍盖活动减弱以至消失且对外界剌激无反应则表明麻醉剂浓度适中，可以进行下一步操作。7. 2. 3 低温休克将鱼放入冰水混合仰中进行低温处理，使其产生低温休克。若鱼体失去平衡、自思盖活动减弱以至消失且对外界剌激无反应则表明但己经休克，可以进行下一步操作，操作完后将鱼放入常温水体中进行复苏。7. 3 取样7.3.1 伤害性取样按照HJ628伤害性取样的要求，选用医用剪刀及解剖刀对麻醉或低温休克后的鱼进行解剖。将取材后的组织和器官用慑子夹取在生理盐水中进行漂洗，以去除血渍和司物，并剔除结缔组织和脂肪组织等非研究所需的组织类型。;票洗过后的组织和器官剪碎成O.5 cmX 0.5 cm小块，放入2.0mL带螺纹旋盖的冻存管中，对样本进行编号，并贴好样本信息标签。7. 3. 2 鱼类凭证保存解剖取样后的鱼类尸体不得去弃，用封口袋装好后，放置于-20C条件中保存，作为鱼类凭证，鱼类凭证编号详见8.107. 3. 3 轻微伤害性取样3 DB37/T 4093-2020 7.3.3.1 总则特殊情况下，需进行轻微伤害性取样，轻微伤害性取样要求采集鱼体的血液和鳝条。采样时，在解剖盘上放置消毒海绵豆豆棉布，以免采样过程中刮伤鱼鳞造成损伤。取样完成后，及时将复苏后的鱼放回其原生的水域环境。7. 3. 3. 2 鳝条取样流程用医用剪刀沿尾鳝边缘剪下一部分鳝条，用摄子夹取放入2.0mL带螺纹旋盖的冻存营中，贴好样本标签，并用酒精棉球对尾部进行消毒处理。7. 3. 3. 3 血液取样流程使用经抗J疑剂润洗过的注射器在鱼体尾静脉处进行抽血，抽出的血液尽快打入装好抗凝剂的冻存管中，来回颠倒冻存管使血液与抗凝剂混匀，井贴好样本标签。7.4 样本处理7.4.1 总则根据样本处理以及研究内容的差异，分为液氮、RNA保存液和无水乙醇三种处理方式，推荐的处理方式排序为:液氮RNA保存液无水乙醇。7.4.2 液氮处理将冻存管直接放入盛有液氮的液氮罐中进行速冻，在采样过程中注意对液氮进行定期的补充。本方法处理过后的样本可以满足高质量的RNA、DNA的提取及后续的分子生物学、基因组学方面的研n坦7L。7.4.3 RNA保存液处理向冻存管中加入RNA保存液(血液样本除外)，使用RNA保存液比例为1:5，例如:0.5 g组织，2.5 mL RNA保存液，置于40C浸泡12h24 h，后将冻存管放入冻存管盒中，再将冻存管盒统一放置于-20 oC条件中保存。本方法处理过后的样本可 以满足高质量的RNA、DNA的提取及后续的分子生物学、基因组学方面的研 7Lo 7.4.4 无水乙醇处理向装有新鲜鱼类组织的冻存管中加满无水乙醇(血液样本|在外)，且在12h、24h、48h后分别对无水乙醇进行更换，目的是让组织尽快脱水以延长保存时间。用封口!民对流存管进行封口，阵、存管放入冻存管盒中，再将哥、存管盒统一放置于-20 oC条件中保存。本方法处理过后的样本可以满足DNA的提取及后续的分子生物学、基因组学方面的研究。7.5 取样量每种组织取样3份(样本备份)，每份样本的取样量尽量满足以下要求:a) 新鲜鱼类组织、二三1g; b) 血液二三2mL; c) 轻微伤害性取样的鳝条取样量，建议取0.5cmXO. 5 cm大小。4 DB37/T 4093-2020 8 编码规则8. 1 鱼类凭证编号采用时间地点流水号规则来对鱼类凭证进行命名。时间为采样当天日期，八位数字:地点以来样地的拼音首字母表示:流水号为当天采集到的鱼类!顺序号。示例20140504QD004oD 004+, 工一时:表主当天果草草囚尾鱼+ 某草地点:景示青岛果革时间:表示2口14年05月04日图1鱼类凭证编号说明8.2 组织样本编号采用时间地点流水号组织名称分管号规则来对样本进行命名。时间地点流水号与鱼类凭证编号相对应:组织名称用鱼类器官、组织对应的英文缩写表示，详见附录C;分管号为一位数字。示例20140504QD004Mul。汕川川川14阳削4剌柑rr盯39 样本运输9. 1 运输要求一一一一一清;.号:罪示当二是某草草四尾4+ 一采草地点:表示青岛某集时间:衰:12014年05月04日图2组织样本编号说明待采样结束或条件允许后，尽快进行样本的运输。统一用干冰进行运输，且干冰运输时间建议不超过72h。9.2 样本包装5 DB37/T 4093-2020 组织样本用2.0mL的带螺纹旋盖的冻存管装载井统一置于冻存管盒中，为防止冻存管在在运输过程中受到碰撞而破裂，将棉花填充在冻存管的问阳中牢存管盒用橡皮筋绑紧以防运输过程中开盖。9.3 干冰需求量样本运输过程中需要添加干冰的重量与季节、运输时间长短、泡沫盒的薄厚有关。宜选用厚泡沫箱和大块干冰，安全的干冰维持量为5kg/d，确保样本送达接收地点时有足够的干冰剩余以保证低温。10 样本储存待样本运输至实验室时，尽快将其存放于实验室-80 oc冰箱中并尽早进行后续实验，样本在-80 oc 冰箱储存时间不要超过1年。11 质量控制用于核酸提取的鱼类样本野外采集、处理、运输及储存过程中，需要进行质量控制，保证组织样本质量及操作人员安全，要求如下:a) 采集人员应掌握目标采集物种的分类学、形态学知识及生活习性、栖息环境和捕捉技巧等lb) 采集到的样本应采用唯一的编号进行样本识别，避免不同样本的泪淆;c) 采集人员应接受生物安全、操作规范等专业培训方可上岗:d) 严格控制样本来集、处理、运输及储存的时间及温度，避免采集到的样本阵解或污染:e) 定期对样本保存设施、设备进行维护和检修。6 附录A(规范性附录)野外鱼类采集信息表表A.1给出了野外鱼类采集信息表。表A.1 野外鱼类采集信息表采集时间*采集地点*鱼类凭证编号*采集方式*采集人*采集人联系方式*鉴定人*鉴定人联系方式*口购买口垂钓|采集人机构*|鉴定人机构*DB37/T 4093-2020 口捕捞形态学鉴定分类信息*备注纲目科属种全长(cm)体长(cm)注:带*的为必填I页，其余为选填工页。|性别(自/)i 7 图B.1给出了拍照的图例。附录B(规范性附录)拍照例图图B.1 拍照例图DB37/T 4093-2020 比色卡8 DB37/T 4093-2020 附录c(规范性附录)鱼体各器官对应的英文缩写表C.1给出了鱼体各器官对应的英文缩写。表C.1 鱼体各器官对应的英文缩写组织名称英文名缩写血b100d B1 脑brain Br eye Ey 鳝fin Fi 鱼思gill Gi 心脏heart He 肠lntest llle In 头肾head kidney Hk 中肾midd1e kidney Mk 后肾after kidney Ak 肝脏liver Li 由V西a、swim b1adder Sb 肌肉muscle Mu 卵巢ovary Ov 精巢testis Te 垂体pituitarium Pi 皮肤ski口Sk 脾脏sp1een Sp 9 DB37/T 4093-2020 参考文献1中华人民共和国国务院.医疗废物管理条例JJ.中华人民共和国国务院公报，2003, 3 (21) : 5-10. 2J马琳.鱼类学实验MJ.中国海洋大学出版社，2010. 3J成庆泰，郑碟珊.中国鱼类系统检索MJ.科学出版社，1987. 4J水柏年，赵盛龙，韩志强，等.鱼类学MJ.同济大学出版社，2015. 5J赵战勤，李健，刘志军.鱼形态学彩色图谱M.化学工业出版社，2017. 6J孟庆闻.鱼类比较解剖MJ.科学出版社，1987. 7J吴娜.南海鱼类凭证标本采集及DNA条形码库构建与应用DJ.上海海洋大学，2017. 8J董蓓亚.鱼类生理盐水JJ.科学养鱼，1986 :24. 9J Satish KP. 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