急性白血病实验室诊断分型程.ppt

急性白血病急性白血病(AL)的诊断除临床症状、的诊断除临床症状、体征与血象外，骨髓细胞形态学分类是体征与血象外，骨髓细胞形态学分类是确诊确诊AL的主要依据之一。急性白血病因的主要依据之一。急性白血病因分型不同，导致治疗方案和疗效不同，分型不同，导致治疗方案和疗效不同，预后也不同，因而正确诊断分型非常重预后也不同，因而正确诊断分型非常重要。日常工作中急性白血病的诊断分型要。日常工作中急性白血病的诊断分型常因骨髓取材、制片或经验不足而造成常因骨髓取材、制片或经验不足而造成漏检，也可能由于染色、形态学鉴别能漏检，也可能由于染色、形态学鉴别能力或未按程序进行而致误诊，从而引发力或未按程序进行而致误诊，从而引发医疗纠纷。医疗纠纷。为为了了提提高高急急性性白白血血病病的的实实验验室室诊诊断断水水平平，减减少少医医患患之之间间的的矛矛盾盾，在在“举举证证倒倒置置”情情况况下下，应应做做到到程程序序明明确确，证证据据充充足足。参参照照国国际际血血液液学学标标准准化化委委员员会会(ICSH)11、英英国国血血液液学学标标准准制制定定委委员员会会(BCSH)22及及欧欧州州白白血血病病免免疫疫分分型型研研究究组组(EGIL)推推荐荐的的方方法法，结结合合我我国国国国情情，提提出出适适合合基基层层临临床床实实验验室室急急性白血病诊断分型程序如下。性白血病诊断分型程序如下。我我国国的的实实验验室室目目前前已已推推行行了了FAB协协作作组组分分型型方方案案，形形态态学学分分型型都都严严格格执执行行1986年年天天津津会会议议提提出出的的分分型型诊诊断断标标准准。这这种种标标准准尽尽管管不不够够完完善善，但但简简便便易易行行，已已为为国国内内广广大大血血液液学学工工作作者者所所接接受受。单单纯纯的的骨骨髓髓细细胞胞形形态态学学有有主主观观因因素素，其其诊诊断断符符合合率率常常为为60%70%，若若结结合合细细胞胞化化学染色，可使诊断符合率接近学染色，可使诊断符合率接近90%。1.骨骨髓髓涂涂片片 取取有有骨骨髓髓小小粒粒部部分分，制制备备厚厚薄薄、长长短短适适宜宜的的涂涂片片数数张张，同同时时作作外外周周血涂片数张。血涂片数张。2.2.染色染色 虽然国际血液学标准化委员虽然国际血液学标准化委员会（会（ICSH）推荐使用纯化天青推荐使用纯化天青B和伊红和伊红Y的的Romanowsky染色，限于天青染色，限于天青B难以买到和难以买到和价格较贵的原因，提倡使用瑞价格较贵的原因，提倡使用瑞（Wright）姬（姬（Giemsa）染色，兼取两染色，兼取两种染色之优点进行骨髓涂片染色。种染色之优点进行骨髓涂片染色。1.镜镜检检 严严格格按按先先低低倍倍视视野野后后油油镜镜观观察察的的步步骤骤进进行行形形态态学学分分析析，分分类类计计数数至至少少200个个有核细胞。有核细胞。2.2.分型注意事项分型注意事项 （1）原原始始细细胞胞典典型型形形态态的的鉴鉴别别十十分分重重要要。按按天天津津会会议议精精神神，原原粒粒细细胞胞应应分分两两型型：型型为为典典型型原原粒粒细细胞胞；型型具具有有典典型型原原粒粒细细胞胞特特征征，但但胞胞质质中中出出现现少少量量、细细小小嗜嗜天天青颗粒。青颗粒。（2 2）伴随细胞：白血病细胞难以）伴随细胞：白血病细胞难以判断类型时，可观察伴随细胞形态学判断类型时，可观察伴随细胞形态学特点，有利于原始或早期细胞形态的特点，有利于原始或早期细胞形态的鉴别。鉴别。（3 3）非红系细胞（）非红系细胞（NECNEC）：）：急性髓急性髓细胞白血病（细胞白血病（AMLAML）分型应强调分型应强调NECNEC，准确计数原始细胞的比例。准确计数原始细胞的比例。（4 4）AuerAuer小体：仔细寻找涂片中小体：仔细寻找涂片中AuerAuer小体有利于小体有利于AMLAML的诊断，一般认为的诊断，一般认为急性淋巴细胞白血病（急性淋巴细胞白血病（ALLALL）AuerAuer小体小体缺如。缺如。（5 5）丝状分裂：）丝状分裂：ALLALL白血病细胞有白血病细胞有丝分裂染色体短而粗，且占细胞绝大丝分裂染色体短而粗，且占细胞绝大部分，可供分型时参考。部分，可供分型时参考。（6 6）浆浆细细胞胞：急急性性单单核核细细胞胞白白血血病病（AMoLAMoL）时时，浆浆细细胞胞出出现现率率高高于于其其他他类类型型白血病，对急性白血病分型具有参考意义。白血病，对急性白血病分型具有参考意义。（7 7）核核影影：也也称称篮篮细细胞胞，多多数数出出现现在在治治疗疗前前骨骨髓髓中中，为为ALLALL特特征征之之一一，但但决决非非特特异性的。异性的。（8 8）分分型型应应以以骨骨髓髓象象为为准准，血血象象仅仅供供参参考考。但但在在白白血血病病细细胞胞识识别别困困难难时时，观观察察血血象象中中白白血血病病细细胞胞分分化化程程度度，有有助助于于细细胞胞类类型的正确判断。型的正确判断。从事急性白血病诊断的实验室都应采用从事急性白血病诊断的实验室都应采用细胞化学染色方法。细胞化学染色方法。ICSHICSH提出使用髓过氧化提出使用髓过氧化物酶（物酶（MPO）、）、氯乙酸氯乙酸AS-D萘酯酶（萘酯酶（CAE）和和-乙酸萘酯酶（乙酸萘酯酶（ANAE）三种染色，必要三种染色，必要时再加苏丹黑时再加苏丹黑B（SBB）染色。染色。BCSH 则主张则主张使用使用SBB或或MPO和非特异性酯酶（和非特异性酯酶（NSE）染染色。色。史敏等史敏等33以以ICSHICSH推荐的三种主要细胞推荐的三种主要细胞化学染色对化学染色对110110例急性白血病骨髓标本进行例急性白血病骨髓标本进行观察，结果表明基本符合专家小组设定的观察，结果表明基本符合专家小组设定的模式。从我国实际情况出发，同时考虑到模式。从我国实际情况出发，同时考虑到患者的经济负担，细胞化学染色选项宜少患者的经济负担，细胞化学染色选项宜少的原则，主要细胞化学提倡使用两项，的原则，主要细胞化学提倡使用两项，MPO（SBB）、）、-NAE（ANAE）见表见表1。表表1主要细胞化学染色结果主要细胞化学染色结果MPO（SBB）-NAE（ANAE）诊诊 断断说说 明明+-AML-M1、M2+/-AML-M3M3a的的ANAE 阳性阳性+AML-M4、M5+/-+AML-M5-/+分分 类类 不不 明明、ALL、AML-M7部部 分分 T-ALL、M7ANAE阳性阳性 1.1.髓过氧化物酶髓过氧化物酶 MPO是髓系特征是髓系特征的专有酶，应作为识别髓系细胞的首的专有酶，应作为识别髓系细胞的首选。一般原粒细胞多为阴性，有的可选。一般原粒细胞多为阴性，有的可阳性，阳性率阳性，阳性率3%，有助于诊断，有助于诊断AML。ICSH增补增补SBB意义在于意义在于MPO-的的AL时时SBB可提供诊断依据。可提供诊断依据。2.2.非特异性酯酶：非特异性酯酶：-乙酸萘酯乙酸萘酯酶（酶（-NAE）和酸性和酸性-乙酸萘酯酶乙酸萘酯酶（ANAE）均属非特异性酯酶，其基均属非特异性酯酶，其基质液都是质液都是-乙酸萘酚，前者要求乙酸萘酚，前者要求PH为为7.6，后者，后者PH为为5.96.3。单核细胞系。单核细胞系为阳性反应，并对氟化钠敏感。为阳性反应，并对氟化钠敏感。1.3.方法学评价方法学评价（1）髓髓过过氧氧化化物物酶酶染染色色方方法法较较多多，国国内内多多使使用用Washburn法法，由由于于联联苯苯胺胺有有致致癌癌作作用用，ICSH推推荐荐使使用用3，3-二二氨氨基基联联苯苯胺胺的的配配方方，目目前前国国内内已已有有试试剂剂盒盒生生产产。从从检检验验人人员员免免受受化化学学品品损损害害方面考虑，建议使用方面考虑，建议使用ICSH推荐的方法。推荐的方法。（2）氯乙酸）氯乙酸AS-D萘酯酶虽为粒细胞标志萘酯酶虽为粒细胞标志酶，且酶，且ICSH又推荐为主要细胞化学染色，又推荐为主要细胞化学染色，但这种染色在但这种染色在AML-M1时多为阴性，不如时多为阴性，不如MPO敏感，而在敏感，而在AML-M2、M3及及M4时其结时其结果与果与MPO一致，从减少工作量和经济负一致，从减少工作量和经济负担考虑，可不列入常规项目。担考虑，可不列入常规项目。（3）非特异性酯酶染色中，）非特异性酯酶染色中，-丁酸萘丁酸萘酯酶（酯酶（-NBE）染色对单核细胞系特异染色对单核细胞系特异性强，但试剂价格较贵，不宜在国内推性强，但试剂价格较贵，不宜在国内推广。广。-NAE及及ANAE各有优点，两种染色各有优点，两种染色可任选一种。可任选一种。（4）苏丹黑）苏丹黑B染色是鉴别急性白血病较染色是鉴别急性白血病较好的染色方法，好的染色方法，BCSH主张选主张选SBB或或MPO，ICSH由于由于SBB+的的ALL已有报道，认为已有报道，认为SBB的特异性不如的特异性不如MPO，因此列为补充因此列为补充细胞化学染色，基层医院不能开展细胞化学染色，基层医院不能开展MPO的实验室可选用的实验室可选用SBB。（5）ICSH提倡使用主要细胞化学以外，提倡使用主要细胞化学以外，也主张在有条件的单位应用其他细胞化也主张在有条件的单位应用其他细胞化学染色协助学染色协助AL诊断。诊断。目前国内有的实验室采用阿利新目前国内有的实验室采用阿利新蓝染色协助诊断蓝染色协助诊断AML-M3a，采用罗丹采用罗丹尼蓝染色协助诊断尼蓝染色协助诊断AML-M7，采用甲苯采用甲苯胺蓝染色协助诊断嗜碱粒细胞白血病，胺蓝染色协助诊断嗜碱粒细胞白血病，采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色协助诊采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色协助诊断毛细胞白血病等。断毛细胞白血病等。一般认为细胞形态学和主要细胞化学一般认为细胞形态学和主要细胞化学可使绝大多数髓系白血病得出正确诊断，可使绝大多数髓系白血病得出正确诊断，当当MPO和和NSE均为阴性或结果不明确时，均为阴性或结果不明确时，应选用免疫表型确定诊断。应选用免疫表型确定诊断。ICSH主张分为主张分为细胞内免疫表型和膜免疫表型两个程序。细胞内免疫表型和膜免疫表型两个程序。BCSH则则主主张张一一线线和和二二线线单单克克隆隆抗抗体体（McAb）组组合合。检检测测免免疫疫表表型型的的方方法法，国国外外多多采采用用流流式式细细胞胞术术，国国内内有有条条件件的的医医院院已已使使用用流流式式细细胞胞术术，有有的的采采用用骨骨髓髓涂涂片片进进行行免免疫疫细细胞胞化化学学染染色色，尚尚有有一一些些实实验验室室未未能能开开展展上上述述技技术术。根根据据我我国国实实际际情情况况，从从事事急急性性白白血血病病诊诊断断的的实实验验室室，最最低低的的要要求求应应开开展展免免疫疫细细胞胞化化学学染染色色方方法法，并并以以最最少少单单克克隆隆抗抗体体进进行行诊诊断断，免免疫疫表表型型提提倡倡使使用用两两项项，cCD3（CD2）和和cCD22（CD19），必必要要时加作抗时加作抗MPO（CD13），），见表见表2。抗抗MPO（CD13）CD3（CD2）CD22（CD19）诊诊 断断说说 明明+-AML-+-T-ALL-+B-ALL-分类不明分类不明ALL可可能能性性不不大大注：优选细胞质注：优选细胞质CD3、CD22表表2 免疫表型结果免疫表型结果 1.ICSH方案中推荐方案中推荐B淋巴细胞系列特异淋巴细胞系列特异的胞质的胞质CD22（cCD22）。）。BCSH方案中一线方案中一线单克隆抗体（单克隆抗体（McAb）推荐推荐cCD79a、cCD22、CD19和和CD10。结合我国实际情况，可选结合我国实际情况，可选cCD22或或CD19。由于新抗体由于新抗体cCD79a对对B系的系的高度特异性和敏感性，有条件的实验室高度特异性和敏感性，有条件的实验室也可选用。也可选用。2.ICSH方案中推荐方案中推荐T 淋巴细胞系列淋巴细胞系列特异的胞质特异的胞质CD3（cCD3）。）。BCSH方案方案中一线中一线McAb为为 cCD3和和CD2。结合我国结合我国实际情况，可选实际情况，可选cCD3或或CD2。3.3.当细胞化学当细胞化学MPO/NSE阴性或模棱两阴性或模棱两可时，可时，ICSH方案检测方案检测cCD22和和cCD3表达常表达常可得到明确结果。由于抗可得到明确结果。由于抗MPO抗体容易得抗体容易得到，必要时可加做抗到，必要时可加做抗MPO。抗。抗MPO 是急性是急性髓细胞白血病敏感的特异性标志，特别是髓细胞白血病敏感的特异性标志，特别是对于未分化型急性白血病和双表型急性白对于未分化型急性白血病和双表型急性白血病的诊断有重要意义。可选用抗血病的诊断有重要意义。可选用抗MPO或或CD13。近年又推出新抗体近年又推出新抗体CD117，其对髓系其对髓系的特异性比的特异性比CD13和和CD33更好，且有较好的更好，且有较好的敏感性，也可选用。敏感性，也可选用。4.4.上述上述McAb的选择是从实用和经济方的选择是从实用和经济方面考虑的，且适合于基层实验室免疫细胞面考虑的，且适合于基层实验室免疫细胞化学染色方法，但若实验室条件许可，也化学染色方法，但若实验室条件许可，也可多选用一些系列特异性或系列相关性标可多选用一些系列特异性或系列相关性标志，如志，如B淋巴系的淋巴系的CD10、T淋巴系的淋巴系的CD7等。等。在髓系相关在髓系相关McAb中，选用中，选用CD13而不用而不用CD33，因为前者能检出更多的因为前者能检出更多的AML患者患者2 2 。5.5.方法学评价（方法学评价（1）流式细胞术是检）流式细胞术是检测白血病细胞内和细胞膜免疫表型最好测白血病细胞内和细胞膜免疫表型最好的方法，近年又有许多新技术和新抗体的方法，近年又有许多新技术和新抗体在临床上应用，而且具有非常良好的发在临床上应用，而且具有非常良好的发展前景。有条件的实验室应选用这种技展前景。有条件的实验室应选用这种技术。但常规标本中一般是正常细胞和白术。但常规标本中一般是正常细胞和白血病细胞混杂存在，使标志报告和结果血病细胞混杂存在，使标志报告和结果解释会遇到一些困难。可用解释会遇到一些困难。可用SSC/CD45设设门，多色免疫表型分析法。门，多色免疫表型分析法。因此要求流式细胞术的标本采集、保因此要求流式细胞术的标本采集、保存、送检和检测都要按严格的程序进行，存、送检和检测都要按严格的程序进行，检测人员应通过培训，并具有一定免疫分检测人员应通过培训，并具有一定免疫分型经验，同时要结合细胞形态学进行结果型经验，同时要结合细胞形态学进行结果的解释。当流式细胞术检测得不出确定结的解释。当流式细胞术检测得不出确定结果时，果时，BCSH提出可用免疫细胞化学方法提出可用免疫细胞化学方法核查。（核查。（2）在我国尚难普及流式细胞术）在我国尚难普及流式细胞术的情况下，基层实验室可采用免疫细胞化的情况下，基层实验室可采用免疫细胞化学染色方法。学染色方法。免疫细胞化学方法虽然不如流式细胞免疫细胞化学方法虽然不如流式细胞术客观、精确，但对形态学和细胞化学难术客观、精确，但对形态学和细胞化学难以分型的急性白血病，仍有十分重要的诊以分型的急性白血病，仍有十分重要的诊断价值，如断价值，如T-ALL与非与非T-ALL的鉴别，伴有的鉴别，伴有淋巴细胞系相关抗原阳性的急性髓系白血淋巴细胞系相关抗原阳性的急性髓系白血病（病（Ly+-AML）和伴有髓细胞系相关抗原和伴有髓细胞系相关抗原阳性的急性淋巴细胞白血病（阳性的急性淋巴细胞白血病（My+-ALL）的诊断，以及急性巨核细胞白血病（的诊断，以及急性巨核细胞白血病（AML-M7）的确诊等。的确诊等。免免疫疫细细胞胞化化学学染染色色方方法法容容易易普普及及，但但常常用用的的抗抗体体质质量量问问题题较较多多，国国内内应应组组织织专专业业人人员员研研究究生生产产用用于于免免疫疫细细胞胞化化学学染染色色的的常常用用抗抗体体，以以使使尚尚无无流流式式细细胞胞仪仪的的单单位位用用免免疫疫细细胞胞化化学学染染色色检检测测白白血血病病细细胞胞免免疫疫表表型型。采采用用免免疫疫细细胞胞化化学学染染色色方法也应注意除外正常细胞的干扰。方法也应注意除外正常细胞的干扰。经经主主要要细细胞胞化化学学和和免免疫疫表表型型仍仍不不能能诊诊断断的的不不典典型型白白血血病病，ICSH方方案案又又选选用用一一些些系系列列相相关关的的McAb进进一一步步检检测测，其其中中包包括括AML-M7的的CD41、CD61及及AML-M6的的血血型型糖糖蛋蛋白白A等等。BCSH方方案案二二线线McAb组组合合也也提提出出CD41、CD42、CD61及及血血型糖蛋白型糖蛋白A等。等。1.AML-M7的的原原始始细细胞胞形形态态学学鉴鉴别别比比较较困困难难，常常容容易易漏漏检检或或误误诊诊，细细胞胞化化学学染染色色虽虽有有一一定定参参考考意意义义，但但特特异异性性不不如如免免疫疫表表型型，CD41、CD42、CD61对对AML-M7具有重要诊断价值。具有重要诊断价值。2.AML-M6细胞形态学诊断并不困难，细细胞形态学诊断并不困难，细胞化学染色的过碘酸胞化学染色的过碘酸-Schiff反应也可提供诊反应也可提供诊断依据，但断依据，但AML-M6变异型以细胞形态学和变异型以细胞形态学和细胞化学进行诊断则非常困难，常借助血细胞化学进行诊断则非常困难，常借助血型糖蛋白型糖蛋白A确诊。同时确诊。同时CD36在早期红系急性在早期红系急性白血病细胞也呈阳性。白血病细胞也呈阳性。3.HLA-DR虽虽为为非非特特异异性性McAb，临临床床实实践践证证明明，AML-M3、AML-M6和和半半数数以以上上的的AML-M7的的HLA-DR为为阴阴性性，这这一一结结果果对对急急性性白白血血病病诊断分型也有参考价值。诊断分型也有参考价值。4.4.急性混合性白血病（急性混合性白血病（MAL）时，骨髓时，骨髓细胞形态学和细胞化学对诊断帮助不大，细胞形态学和细胞化学对诊断帮助不大，免疫表型分析对确认双表型急性白血病免疫表型分析对确认双表型急性白血病（BAL）是有意义的。尤其是是有意义的。尤其是EGIL修改积分修改积分系统，可供系统，可供AL诊断分型时参考。诊断分型时参考。5.ICSH建建议议，在在有有条条件件的的实实验验室室特特别别是是诊诊断断研研究究较较先先进进的的领领域域内内，急急性性白白血血病病的的诊诊断断还还可可开开展展细细胞胞遗遗传传学学及及分分子子生生物物学学诊诊断技术，不断提高断技术，不断提高AL诊断分型的水平。诊断分型的水平。6.6.方法学评价方法学评价 （1）AML-M7国内有些实国内有些实验室以免疫细胞化学染色方法检测，由于验室以免疫细胞化学染色方法检测，由于国产国产CD41单抗质量较好，可协助单抗质量较好，可协助AML-M7的的诊断。（诊断。（2）有些）有些AML-M3从形态学难以确从形态学难以确定，若定，若HLA-DR阴性，也有助于诊断。阴性，也有助于诊断。随着流式细胞术及分子生物学技术在临随着流式细胞术及分子生物学技术在临床上的普及，大大提高了急性白血病的诊断床上的普及，大大提高了急性白血病的诊断水平。但有经验的血液学家一直认为，骨髓水平。但有经验的血液学家一直认为，骨髓细胞形态学和主要细胞化学染色仍然是急性细胞形态学和主要细胞化学染色仍然是急性白血病诊断的首选程序，在此基础上，择优白血病诊断的首选程序，在此基础上，择优选出系列特异性和系列相关性免疫表型进行选出系列特异性和系列相关性免疫表型进行检测，可使绝大多数急性白血病获得正确诊检测，可使绝大多数急性白血病获得正确诊断，从而减少漏诊和误诊，避免医疗纠纷。断，从而减少漏诊和误诊，避免医疗纠纷。1.Scott CS，Ottolander GJD,Swirsky D,et al.Recommended Procedures for the Classification of Acute Leukemias.Leukemia and Lymphoma,1995,18:1-122.王王 一一 译译，肖肖志志坚坚、郝郝玉玉书书校校.急急性性白白血血病病和和慢慢性性淋淋巴巴增增殖殖性性疾疾患患免免疫疫分分型型的的修修订订指指南南.国国外外医医学学输输血血及及血血液液学学分册，分册，2002,25（4）：）：2893.史敏、李波、李顺义，等史敏、李波、李顺义，等.主要细胞化学染色在急性白主要细胞化学染色在急性白血病分型中的评价血病分型中的评价.临床检验杂志，临床检验杂志，2002，20（5）：）：303