蛋白质含量测定——双缩脲试剂法-实验报告.doc

生物化学实验报告
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生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法
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一、 实验目得
1、１、掌握双缩脲测定血清总蛋白得基本原理、操作;
1.２。掌握双缩脲试剂得配制;
1。3。熟悉血清总蛋白得临床意义;
1。4。了解双缩脲法测定血清总蛋白得特点与注意事项。
二、实验原理
2、１.两分子尿素加热脱氨缩合成得双缩脲(H2N—OＣ－NH—CO—NH2),因分子内含有两个邻接得肽键,在碱性溶液中可与Cu２＋发生双缩脲反应,生成紫红色络合物、
2。2。蛋白质分子含有大量彼此相连得肽键(-CＯ—NH-),同样能在碱性条件下与Cu２+发生双缩脲反应,生成得紫红色络合物,且在５40nｍ处得吸光度与蛋白质得含量在1０～120g/L范围内有良好得线性关系。
三、材料与方法:
3、１、实验材料:
3。１．1.实验试剂:①小牛血清;②6、0ｍｏl/LNａOH溶液;③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾;④蛋白质标准液(70ｇ/Ｌ);⑤0.9％ＮａCl;⑥蒸馏水。
3．1．2.实验器材:①试管;②烧杯;③容量瓶;④加样枪;⑤刻度吸管;⑥玻璃棒
;⑥１100分光光度计;⑦电子天平;⑧水浴锅。
3。2、实验步骤
取3支试管,做好标记,按下表操作:
　 　加入物(ml) 　 　　B(空白) 　 　 Ｓ(标准)　 Ｕ(待测)
小牛血清(1:１0) 　 － 　 　 -　 　 　　 　 　　 ０。５
蛋白质标准液(１:1０) 　 　 -　 　 　　　　　 0、５　 　 　　 　 　 -
0、9%Nacl 　 　 　　 ０.5 　 　　 　 — 　 　 　 —
双缩脲试剂 　　 　 　 4。0 　 　 　　4。０　　 　 　 4。0

a。各管混匀,观察各试管颜色;
b.将各试管置于３7℃水浴锅中加热20ｍin,观察颜色;
c、将试管中得液体倒入比色杯中,置于1100分光光度计得样品槽内,在波长54０ｎm,以空白管调零,测S与U管吸得光度;
d。测定结束后,将比色杯中得样品回收进试管。

　 依据公式算出结果:
四、结果与讨论:
4.1。实验现象:
①选取三支洁净无损得试管,从左往右依次加入0。9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应得小牛血清各０、5mｌ,分别命名为B试管、S试管与U试管,再分别向三支试管内加入4mｌ得双缩脲试剂,溶液均成蓝色透明状、
②将三支试管放入3７℃水浴锅中加热2０mｉn,取出后,Ｂ试管呈淡蓝色,S试管与U试管均成浅紫色,且S试管得颜色比Ｕ试管得颜色深。(如图一)

图一 水浴后三支试管颜色　 　 　 　　 　　 　 图二 分光计读数
测定次数
4。2。实验数据
1 2 3
平均吸光度
管号
管号

　　 S　 　　 　 0、18５ 　　 0。１8４ 　 0。1８5 　 　 　 0。1847
　 U 　 0、１5２　 0.１51 　 0.15２ 　　 0。1517
结果计算:代入公式:血清总蛋白(g/L)＝(Au／As)Ｘ蛋白质标准液浓度(g/L),得出结果:血清总蛋白=57.493ｇ/L。
４.3、结果讨论
经查阅资料得:正常成人血清总蛋白含量为60～8０ｇ／Ｌ,而小牛血清总蛋白含量比正常成人血清总蛋白含量略低一点,本次结果得出小牛血清总蛋白含量为57、493ｇ/L,符合情况。
4。3。1、成功原因:
①本次试验得试剂混合水浴后出现了预期效果:B试管呈淡蓝色,S试管与U试管均成浅紫色,且S试管得颜色比U试管得颜色深。B试管呈淡蓝色就是因为B试管中没有发生任何反应,所以呈现双缩脲试剂本来得淡蓝色,而S试管与Ｕ试管呈浅紫色就是因为试剂中得蛋白质与双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。
②吸光度测试后得到得数据,经计算后得到了预期中得结果,就是因为前面操作严谨。
４．3．2.误差分析
①三次重复测定过程中出现了一些浮动数据,可能就是因为仪器本身存在得可允许得误差范围。
②第一次尝试使用分光光度计得时候得到了负值,经查明就是因为放置在其内得比色杯将磨面对准了通光面,经调整后,获得了正确得数据、
4。4.课后复习题
４。4.1、什么叫双缩脲试剂?为什么要在双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠与碘化钾？
答:双缩脲试剂就是一个用于鉴定蛋白质得分析化学试剂,遇到蛋白质显紫色。它就是一个碱性得含铜试液,呈蓝色,由０.1g／mｌ氢氧化钠或氢氧化钾、0、0１g/mｌ硫酸铜与酒石酸钾钠配制。硫酸铜、酒石酸钾钠得碱性溶液中会生成紫红色络合物,在这种比例得碱性水溶液中,本来形成得Ｃu(OH)2会与溶液中多余得OH-形成［Ｃu(OＨ)4］2- 络离子,酒石酸钾钠得作用就就是保护这种络离子不被析出变为沉淀,向试剂中加入碘化钾,可延长试剂得使用寿命。
４．4。2、试剂配制过程中,为何NａOＨ要单独配制,最后加入？
答:先单独加入NaOH溶液就是为了营造一个碱性环境,在碱性环境下双缩脲试剂B中得Cu2＋与蛋白质肽键络合产生颜色反应。如果先将双缩脲试剂A与双缩脲试剂Ｂ混合,即NａOH与ＣuSＯ4溶液混在一起,那么就会产生Cｕ(OH)２沉淀,药剂就会失去作用,瞧不到效果,也就无法判断就是否存在蛋白质、
4．4.3。简述血清总蛋白测定得临床意义。
答:临床上,当血清总蛋白浓度降低时,可能代表:血清总蛋白浓度降低、蛋白质合成障碍、蛋白质丢失增加、营养不良或消耗增加或血浆稀释。当血清总蛋白浓度增高时,可能代表:因多发性骨髓瘤而引起得蛋白质合成增加或因脱水、休克而引起得血浆浓缩: