生物检测PCR技术.ppt

生物技术教研室：郑 鸣目 录pPCR技术简史 pPCR的原理pPCR的反应条件pPCR的类型和应用PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖Kary B.Mullis 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCR只是一个简单的不起眼玩艺。凯利穆利斯（KaryMullis)我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。它的发明并没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们能在更广的范围内更快、更容易地进行基因操作，学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一种新工具。凯利穆利斯（KaryMullis)生物样品生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段DNA聚合酶引物引物M13噬菌体Sanger的测序技术引物DNA聚合酶引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段94变性50-65退火XX延伸945537Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性(%)温度()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20729455PCR循环PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCRPCR的基本原理的基本原理1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCRPCR的基本原理的基本原理50引物1引物2DNA引物PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCRPCR的基本原理的基本原理72引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCRPCR的基本原理的基本原理第1轮结束95第2轮开始PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCRPCR的基本原理的基本原理955072TaqTaqTaqTaqPCR反应条件PCR过程PCR的特点PCRPCR的基本原理的基本原理72第2轮结束PCRPCR的基本原理的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌特异性高引物的特异性。引物延伸时，碱基配对的正确性。TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性。靶基因的特异性与保守性。选择扩增特异性和保守性高的靶基因区域，扩增产物的特异性程度就更高。PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点简便、快速整个PCR的扩增在一个小小的离心管中完成，过程也只是简单的温度变化，耐高温的Taq DNA聚合酶的应用，避免了DNA聚合酶的反复加入。一次性加好反应液，24 小时完成扩增对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCRPCR反应五要素反应五要素引物（引物（primerprimer）酶酶 （Taq DNA polymeraseTaq DNA polymerase）dNTP dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTPdATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板模板 （templatetemplate）MgMg2+2+（magnesiummagnesium）引物（primer）引物是PCR特异性反应的关键PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物设计是PCR 技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带，不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。引物设计的基本原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。引物（primer）具体因素引物长度（primer length）产物长度（product length）序列Tm 值(melting temperature)引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability,用G 值反映)形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition）引物（primer）u引物的长度：一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，即Taq 酶的最适温度。引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点。引物（primer）引物设计的一般原则引物（primer）引物设计的一般原则u引物的Tm值 引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过46度.如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.经验公式：Tm=2(A+T)+4(C+G)（primer5.0）Nearest nei:最近邻位（oligo6.0）引物（primer）引物设计的一般原则u引物序列的GC含量 一般为40-60%，以45-55为宜，过高或过低都不利于引发反应。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。如果G-C比例超出，则在引物的5端增加A或T；而如果A-T比例过高，则同样在5端增加G或C。u引物3端的序列要比5端重要 引物3端的碱基一般不用A（3端碱基序列最好是G、C、CG、GC），因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR 影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。引物（primer）引物设计的一般原则u引物序列在模板内应当没有相似性较高、尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。u引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物（primer）引物设计的一般原则u可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高。错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，并且不好找其他更合适的引物，那么这对引物也是可以接受的。引物（primer）引物设计的一般原则uG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。一般情况下，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。引物的3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（能值越高越容易结合）引物（primer）引物设计的一般原则u引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR 正常反应不能进行。与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3端的连续GGG 或CCC 会导致错误引发。二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。虽然有些带有发夹环，其G为3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5末端对反应就没有多大的影响了。引物（primer）引物设计的一般原则Oligo 6（引物评价）*Primer Premier（自动搜索）*Vector NTI SuitDnasisOmigaDnastarPrimer3 （在线服务）*引物（primer）引物设计的常用软件Primer Premier 5.0 Primer Premier 5.0 的的使用简介使用简介主要功能:引物设计限制性内切酶位点分析DNA 基元(motif)查找同源性分析简并引物设计简并引物设计根据氨基酸序列来设计引物DNA引物Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）3、支原体（Mycoplasma）4、植物线粒体（Plant Mitochondrion）5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）6、一般标准（Standard）7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0使用介绍使用介绍(1)(1)PreimerPremier启动界面Load sequence基本信息基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction引物设计界面引物设计界面Sensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimerFirstyoucandesigntheprimermanually引物搜索选项设定引物搜索选项设定引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物引物信息引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏都none，But引物编辑引物编辑引物编辑引物编辑EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow用用primer5.0primer5.0对引物评价对引物评价duplex formation:这是评价引物二聚体形成的，包括自身形成二聚体和引物间二聚体，形成二聚体的能值，引物3端有无配对碱基(最好没有)。hairpin formation:是看引物自身能否形成发夹结构，主要也是看3端不要形成发夹结构。还要看形成发夹结构的能值，不超过4.5。false priming site:如果模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，需要进行错配的分析，看你的引物（尤其3端）是否与特定模板的其他位点结合。PCR：总结性的显示引物位置，产物大小，Tm值等参数，你可以横向比较一下，Oligo 6.0 Oligo 6.0 使用说明使用说明主要功能：专门的引物设计和分析软件Oligo 6.44 Oligo 6.44 启动界面启动界面Opensequencefile3 3个弹出窗口个弹出窗口MeltingtemperatureMeltingtemperatureG Internal StabilityFrq为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。用用Oligo Oligo 设计引物时的设计引物时的3 3个标准个标准Tm 值曲线以选取5到3的下降形状有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线宜选用3端Frq 值相对较低的片段。G 值在5端和中间值比较高，而在3端相对低。选中引物选中引物上游引物下游引物只是示意图引物分析引物分析首先检查引物二聚体尤其是3端二聚体形成的可能性。引物分析引物分析二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。引物分析引物分析第三项检查为GC 含量，以45-55为宜。第四False priming 检查引物分析引物分析KeyinformationofprimerHairpinDimerandcrossDimerGC%TotalPCRinformationFinal PCR informationFinal PCR informationSearch for primer using Oligo Search for primer using Oligo 6.06.0Searchprimer利用利用oligo6.0oligo6.0进行引物评价进行引物评价duplex formation:这是评价引物二聚体形成的，包括自身形成二聚体和引物间二聚体，主要是看引物3端有无配对碱基(最好没有)。形成的二聚体要看能值，能值越低越好，最好不要超过4.5hairpin formation:是看引物自身能否形成发夹结构，主要也是看3端不要形成发夹结构。还要看形成发夹结构的能值，不超过4.5。如果引物中加入酶切位点，可能会有发夹结构且能值不会太低，这就需要灵活控制退火温度了。composition and Tm:分析上下游引物的碱基组成，GC比和Tm值，原则我就不多说了。falseprimingsite:如果模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，需要进行错配的分析，看你的引物（尤其3端）是否与特定模板的其他位点结合。一般错配的引发效率以不超过100为好，但并不绝对，如果正确结合位点的引发效率为450以上，而有一个错配的引发效率是120左右的，这个引物也是可以接受地！PCR：总结性的显示引物位置，产物大小，Tm值等参数，你可以横向比较一下，尤其是给了一个optimalannealingtem还是可以参照一下地。也给了简单的评价供参考。利用利用oligo6.0oligo6.0进行引物评价进行引物评价每条引物的浓度0.1 1umol或10100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。引物（primer）引物浓度目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100 ul时）浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少酶（Taq DNA polymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系dNTP呈颗粒状，保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低模板（template）单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。浓度一般为100ng/100L，模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。n核酸的分离纯化尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。制备细胞及破碎细胞消化蛋白质,去除生物大分子去除不需要的核酸分子沉淀核酸,去除杂质基本步骤：基本原则：模板（template）u基因组DNA的提取lCTAB法lSDS法l其它n核酸的分离纯化模板（template）u非基因组DNA的提取l质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法l线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法n核酸的分离纯化模板（template）CTAB法原理CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。u基因组DNA的提取方法简介lCTAB法（植物DNA提取经典方法）组份组份 Tris-HCl （pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM 1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加）使用前加入入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 CTAB提取缓冲液的经典配方lCTAB法（植物DNA提取经典方法）组份组份 Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaCl CTAB PVP40-巯基乙醇巯基乙醇 终浓度终浓度 100 mM 20 mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。CTAB提取缓冲液的改进配方lCTAB法（植物DNA提取经典方法）植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液 CTAB法流程图lCTAB法（植物DNA提取经典方法）SDS法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH 8.0）NaCl SDS终浓度终浓度 10 mM 20 mM 0.4M 2%SDS法DNA提取缓冲液lSDS法u基因组DNA的提取方法简介动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液 SDS SDS法流程图（以动物组织为例）法流程图（以动物组织为例）lSDSSDS法法物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法生物方式：酶法根据细胞裂解方式的不同有：根据细胞裂解方式的不同有：l其它方法其它方法u基因组基因组DNADNA的提取方法简介的提取方法简介吸附材料结合法：吸附材料结合法：根据核酸分离纯化方式的不同有：根据核酸分离纯化方式的不同有：硅质材料硅质材料阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁珠磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合核酸，低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。物，从而达到分离目的。l其它方法其它方法u基因组基因组DNADNA的提取方法简介的提取方法简介浓盐法浓盐法：有机溶剂抽提法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物根据核酸分离纯化方式的不同有：根据核酸分离纯化方式的不同有：l其它方法其它方法碱裂解法原理碱裂解法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为为线状分子，而质粒线状分子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；当用碱处理当用碱处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变容易发生变性，共价闭环的质粒性，共价闭环的质粒DNADNA在回到中性在回到中性pHpH时即恢复其时即恢复其天然构象；天然构象；变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。l质粒质粒DNADNA的提取的提取u非基因组非基因组DNADNA的提取方法简介的提取方法简介对数期菌体对数期菌体溶液溶液III中和中和溶液溶液I充分重悬充分重悬溶液溶液II裂解裂解上清液上清液抽提抽提离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀干燥溶解干燥溶解沉淀沉淀质粒质粒DNA溶液溶液碱裂解法流程图碱裂解法流程图l质粒质粒DNADNA的提取的提取煮沸法原理煮沸法原理染色体染色体DNADNA比质粒比质粒DNADNA分子大得多，且染色体分子大得多，且染色体DNADNA为线为线状分子，而质粒状分子，而质粒DNADNA为共价闭合环状分子；为共价闭合环状分子；当加热处理当加热处理DNADNA溶液时，线状染色体溶液时，线状染色体DNADNA容易发生变性，容易发生变性，共价闭环的质粒共价闭环的质粒DNADNA在冷却时即恢复其天然构象；在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体变性染色体DNADNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNADNA分子则以溶解状态分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。存在液相中，从而可通过离心将两者分开。l质粒质粒DNADNA的提取的提取l 细胞器细胞器细胞器细胞器DNADNADNADNA差速离心法差速离心法差速离心法差速离心法差速离心法原理差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。处于上层，从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。u非基因组非基因组DNADNA的提取方法简介的提取方法简介I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中u基因组DNA的提取基本步骤I.I.材料准备材料准备最好使用新鲜材料，低温保最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要时，要选择有核细胞（白细胞）选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，组培细胞培养时间不能过长，否则会造成否则会造成DNA降解降解含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较含量较少，提取前先富集少，提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体拷贝或大质粒，则应加大菌体用量用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）菌株不要频繁转接（质粒丢失）材料应适量，过多会影响裂解，材料应适量，过多会影响裂解，导致导致DNA量少，纯度低量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：解预处理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取菌体量适当菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（变性的时间不要过长（5分钟），分钟），否则质粒易被打断否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有复性时间也不宜过长，否则会有基因组基因组DNA的污染的污染G菌、酵母质粒的提取，应先菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁用酶法或机械法处理，以破壁II.II.破碎细胞或包膜破碎细胞或包膜采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相时，应提供相应的缓冲体系应的缓冲体系采用有机（酚采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法去杂质的方法基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化蛋白质的去除：蛋白质的去除：酚酚/氯仿抽提氯仿抽提使用变性剂变性（使用变性剂变性（SDSSDS、异硫氰酸胍等）、异硫氰酸胍等）高盐洗涤高盐洗涤蛋白酶处理蛋白酶处理III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化多糖的去除：多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/21/2体体积的积的5M NaCl5M NaCl，高盐可溶解多糖。，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2(1/2体积体积)，氯苯可，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500L DNA500L DNA液中加入液中加入200l 20%PEG200l 20%PEG8000 8000(含含1.2 M NaCl)1.2 M NaCl)，冰浴，冰浴20min20min。III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化多酚的去除：多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇)，它，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNADNA的结合的结合盐离子的去除：盐离子的去除：7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于），有利于充分沉淀充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥），让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNasepH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解 基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取IV.IV.核酸的核酸的沉淀、溶解沉淀、溶解1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精残留，酒精抑制精残留，酒精抑制后续酶解反应后续酶解反应3.3.DNADNA中残留有金属离中残留有金属离子子1.1.重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等杂白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）质（具体方法见前）2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精，让酒精充分挥发充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数（次数（2-32-3次）次）uu DNA DNA DNA DNA提取常见问题提取常见问题提取常见问题提取常见问题l问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。原原 因因对对策策1.1.材料不新鲜或反复冻材料不新鲜或反复冻融融2.2.未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性3.3.提取过程操作过于剧提取过程操作过于剧烈，烈，DNADNA被机械打断被机械打断4.4.外源核酸酶污染外源核酸酶污染5.5.反复冻融反复冻融1.1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融免反复冻融2.2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液前加入裂解缓冲液3.3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料在提取内源核酸酶含量丰富的材料的的DNADNA时，可增加裂解液中螯合剂时，可增加裂解液中螯合剂的含量的含量4.4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌温灭菌6.6.将将DNADNA分装保存于缓冲液中，避免分装保存于缓冲液中，避免反复冻融反复冻融l问题二：问题二：DNADNA降解。降解。对对策策 原因原因uu DNA DNA DNA DNA提取常见问题提取常见问题提取常见问题提取常见问题1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料2.动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁3.高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）4.低温沉淀，延长沉淀时间5.加辅助物，促进沉淀6.洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒l问题三：DNA提取量少。对策 原因uu DNA DNA提取常见问题提取常见问题l异硫氰酸胍异硫氰酸胍/苯酚法苯酚法 原理：原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的释放出来的DNADNA和和RNARNA由于在特定由于在特定pHpH下溶解度的不同而分下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNARNA。uRNARNA的提取方法简介的提取方法简介 步骤步骤:材料准备：材料准备：尽量新鲜。尽量新鲜。裂解变性裂解变性：异硫氰酸胍：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，亚硫氢胍，巯基乙醇，N-N-月桂肌氨酸等）。月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNARNA，有效抑制核酸酶。，有效抑制核酸酶。纯化分离：纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。氯仿可抽提去除杂物。洗涤：洗涤：7070乙醇。乙醇。沉淀：沉淀：异丙醇、无水乙醇。异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（乙酸钠（pH4.0pH