细胞自噬与神经疾退行性疾病.ppt

细胞自噬及其在神经退行性疾病中的作用 目 录神经退行性疾病发生过程调控特点检测基本概念细胞自噬ADPDHD Autophagy 一词来源于希腊语，auto指自身、phagy是吃的意思，autophagy意为自体吞噬，简称自噬。溶酶体溶酶体基本概念自噬自噬 自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新，在细胞发育、细胞免疫、组织重塑及对环境适应等方面有着十分重要的作用。基本概念自噬自噬 自噬在进化过程中高度保守，从酵母、果蝇到脊椎动物和人都可以找到参与自噬的同源基因。目前至少已经鉴定出33种参与酵母自噬的特异性基因。其命名从最初称为APG，AUT和CVT，现已被统一命名为酵母自噬相关基因ATG(autophagy-related gene，ATG)。哺乳动物自噬基因的命名和酵母相似，但也有个别差异，如酵母的ATG8在哺乳动物称为LC3，酵母晦ATG6在哺乳动物则称为Beclin 1。基本概念自噬相关基因自噬相关基因主要自噬相关蛋白（主要自噬相关蛋白（Atg）基本概念自噬相关蛋白自噬相关蛋白分类根据其降解底物的特异性分类非选择性自噬：随机选择性自噬：专一线粒体自噬(Mitophagy)内质网自噬(ER-phagy)过氧化物酶体自噬(Pexophagy)细胞核自噬(Nucleophagy)基本概念根据自噬的过程分类大自噬(Macroautophagy)主要小自噬(Microautophagy):指溶酶体膜直接内陷包裹底物并降解的过程。分子伴侣介导的自噬(Chaperone-mediated autophagy，CMA):热休克蛋白70(Hsp70)与溶酶体相关膜蛋白2A(AMP2A)基本概念分类分子伴侣介导的自噬小自噬大自噬基本概念分类自噬流 自噬体自噬体自噬前体自噬前体溶酶体溶酶体自噬溶酶体自噬溶酶体起始起始 延伸延伸闭合闭合成熟成熟降解降解 发生过程12345 调 控模式图自噬上游调控自噬过程调节 调 控 生理条件下,细胞自噬受到严格的调控。现在了解得比较多的细胞自噬调控通路主要有两条:mTOR通路和型PI3K通路。很多其他细胞自噬调控信号直接或间接的通过这两条通路发挥作用。上游调控mTOR营养丰富mTOR被激活磷酸化Atg13与Atg1的结合能力降低Atg1的活性低与Atg17作用弱自噬水平低饥饿或雷帕霉素刺激mTOR被抑制反之.自噬水平高在在mTOR通路中，通路中，mTOR复合体通过与复合体通过与Atg13的作用，间接的作用，间接地影响了地影响了Atg1-Atg13-Atg17蛋白复合体的形成，进而影响了蛋白复合体的形成，进而影响了自噬水平的高低，自噬水平的高低，Atg13在蛋白复合体中起到了介导作用。在蛋白复合体中起到了介导作用。调 控mTOR通路 mTOR 对细胞自噬起到负调控作用。在正常生长条件下,mTOR处于激活状态,细胞自噬受到抑制;当细胞处于饥饿或受到雷帕霉素刺激时,mTOR被抑制,细胞自噬被诱导增强。调 控mTOR通路 丝裂原刺激信号 能量感受信号 胰岛素信号 氨基酸信号 p53通路 调 控PI3K 通路 型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)是一个正调控蛋白，它能够磷酸化磷脂酰肌醇(PI),生成3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)，而后PI3P利用胞质中的蛋白质形成自噬体膜。PI3K 也能与Beclin-1形成复合体，该复合物在自噬体形成的起始阶段起重要作用。自噬过程调节 起始:Atg1复合体 膜的扩增与底物识别选择:Atg12-Atg5和 Atg8分别泛素化修饰 自噬体成熟与降解 自噬过程中的其他重要成员:分泌与内吞途径和细胞骨架 调 控 调 控自噬的调控泛素化修饰 调 控双重性：细胞存活&细胞死亡半衰期短：自噬体只能维持8min，与溶酶体融合，2h后自噬溶酶体基本降解消失保守性：自噬相关基因可诱发性：饥饿、微生物感染、缺氧、生长因子缺乏、放疗、化疗等条件都可以诱导自噬的活化批量降解：清除受损细胞器、错误折叠蛋白、冗余的蛋白以及代谢产物 特 点1电镜技术普通透射电镜技术 免疫电镜技术2化学和免疫化学染色法基于自噬标记蛋白的检测方法标记自噬溶酶体结构的检测技术 检 测电镜技术普通透射电镜技术在超薄切片上可清晰地观察到自噬结构的形态和构造，实验指标包括细胞自噬水平和自噬结构的变化，前者是指发生自噬的细胞出现率，后者以自噬细胞内自噬结构数目或自噬结构与细胞质的断面面积之比衡量免疫电镜技术可标记位于自噬前体和自噬体内外膜上的LC3，该方法可用于鉴别自噬前体，自噬体和自噬溶酶体 检 测 检 测普通透射电镜技术吞噬泡：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势自噬体：由包裹未吞噬降解的胞浆物质、细胞器的双层膜结构组成。自噬溶酶体：由单层膜结构组成，其中包裹着处于不同降解阶段的胞浆成分。检 测普通透射电镜技术 检 测普通透射电镜技术 检 测普通透射电镜技术化学和免疫化学染色法1基于自噬标记蛋白的检测方法自噬体数量检测免疫荧光/组织化学技术蛋白表达量检测Western-blot2标记自噬溶酶体结构的检测技术单丹磺酸戊二胺（MDC）染色吖啶橙（AO）染色 检 测自噬类别相关环节标志物大自噬自噬体的形成LC3(Atg8)Beclin 1(Atg6)Atg5-Atg12Atg 16LAtg9Atg14DRAM1ZFYVE1/DFCP1溶酶体LAMP-1LAMP-2自噬底物p62分子伴侣自噬LAMP2AHSC70线粒体自噬Atg32BNIP3自噬标记蛋白 检 测 检 测GFP-LC3指示技术阴性对照雷帕霉素处理NDV感染荧光显微镜下采用荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪融合蛋白来示踪HeLa cells自噬的形成自噬的形成 检 测GFP-LC3指示技术 检 测免疫荧光染色-LC3B对照组对照组氯奎处理组氯奎处理组 检 测Western Blot 标记自噬溶酶体结构是以往应用较为广泛的活体检测技术。MDC 和AO 是常用的嗜酸性染料，用于标记酸性细胞器。当溶酶体内容物为酸性时，可获得阳性染色信号。检 测染色技术 检 测MDC染色 自噬标志物的检测在自噬研究中发挥了巨大的作用，使得人们可以简便、动态、实时并定量地检测细胞内自噬水平。然而单独检测每一种自噬标志物都有一定的局限性和影响因素，在研究自噬时必须慎重考虑研究条件，适当设置阴性与阳性对照，使用多种自噬抑制剂或者基因沉默等技术，多方面、多层次进行实验以确认细胞的自噬水平。检 测在该疾病的早期阶段自噬起保护性作用，激活自噬可加速变性蛋白的清除来阻止疾病的进一步发展。然而，随着疾病的进展，蛋白质聚积物越来越多，对溶酶体蛋白酶降解的敏感性下降，自噬的持续性激活最终引发自噬性细胞死亡，这样自噬又促进了神经元的死亡。阿尔茨海默氏病（Alzheimers）、亨廷顿氏病（Huntingtons）和帕金森氏病（Parkinsons）等神经变性性疾病两个最主要的特征是：胞浆中蛋白聚集物的存在和大的蛋白裂解体系活性的改变。神经神经退行性退行性疾病疾病细胞自噬自噬的基本概念自噬的发生过程自噬的调控自噬的特点自噬的检测自噬与神经退行性疾病ADPDHD自噬与AD细胞自噬自噬的基本概念自噬的发生过程自噬的调控自噬的特点自噬的检测自噬与神经退行性疾病ADPDHD自噬与PD细胞自噬自噬的基本概念自噬的发生过程自噬的调控自噬的特点自噬的检测自噬与神经退行性疾病ADPDHD自噬与HD谢谢!