分子生物学：蛋白质组学的研究方法和进展.ppt

萧萧 小小 鹃鹃jocelyn_分子生物学研究中心第九章第九章 蛋白质组学的研究方法和进展蛋白质组学的研究方法和进展分子生物学分子生物学MedicalMolecularBiology One Genome different ProteomesLife is based on proteins and their interactions从基因组学到蛋白质组学从基因组学到蛋白质组学2020世纪生命科学的辉煌成就世纪生命科学的辉煌成就l19531953年年,Watson&Crick提出提出DNADNA双螺旋结构双螺旋结构l19571957年，年，“中心法则中心法则”的问世的问世l2020世纪世纪9090年代，人类基因组计划（年代，人类基因组计划（HGP）基因组计划的局限基因组计划的局限无法解决无法解决“基因精细调基因精细调控控”问题问题大规模基因表达检大规模基因表达检测技术如：微阵列法、测技术如：微阵列法、DNA芯片及芯片及SAGE“mRNA”无法反映蛋白无法反映蛋白质的质与量。质的质与量。以往人类对于蛋白质的研究只是针对生命以往人类对于蛋白质的研究只是针对生命活动中某一种或某几种蛋白质，难以形成一种活动中某一种或某几种蛋白质，难以形成一种整体观，难以系统透彻地阐释生命活动的基本整体观，难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制。机制。基因是遗传信息的源头基因是遗传信息的源头功能性蛋白是基因功能的执行体功能性蛋白是基因功能的执行体大规模、全方位的蛋白质研究势在必行大规模、全方位的蛋白质研究势在必行后基因组时代后基因组时代功能基因组学成为研究重心功能基因组学成为研究重心蛋白质组学是其蛋白质组学是其“中流砥柱中流砥柱”，成为，成为战略制高点战略制高点 第一节第一节 蛋白质组学的概念及其发展史蛋白质组学的概念及其发展史什么是蛋白质组？什么是蛋白质组？蛋白质组蛋白质组 “proteomeproteome”一词源于一词源于“PROTEPROTEinin”与与“gengenOMEOME”的杂合。的杂合。F同一基因组在不同细胞、不同组织中的表同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同达情况各不相同 F在空间和时间上动态变化在空间和时间上动态变化 指由一个细胞或一个组织的基因指由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质。组所表达的全部蛋白质。蛋白质组学蛋白质组学(proteomics)应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学。应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学。从从整整体体的的角角度度分分析析细细胞胞内内动动态态变变化化的的蛋蛋白白质质组组成成、表表达达水水平平与与修修饰饰状状态态，了了解解蛋蛋白白质质之之间间的的相相互互作作用用与与联联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。主要研究内容主要研究内容 v了解某种特定的细胞、组织或器了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；官制造的蛋白质种类；v明确各种蛋白质分子是如何形成类明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络；似于电路的网络；v 描绘蛋白质的精确三维结构，揭示描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。并且决定其活性的部位。什么是功能蛋白质组学？什么是功能蛋白质组学？(functionalproteomics)功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。一生理现象相关的所有蛋白质。介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。组学之间。蛋白质组学应用举例蛋白质组学应用举例研究细胞结构功能和分子组成研究细胞结构功能和分子组成发现新的药物靶位点发现新的药物靶位点发现新型生物学活性的分子和药物发现新型生物学活性的分子和药物差异蛋白质组学差异蛋白质组学发现细菌、病毒感染和疾病监测的分子标志物发现细菌、病毒感染和疾病监测的分子标志物修饰蛋白质组学修饰蛋白质组学遗传或药理学扰动的分子解剖遗传或药理学扰动的分子解剖病理生理学研究病理生理学研究植物蛋白质组学植物蛋白质组学相互作用蛋白质组学相互作用蛋白质组学研究药物作用方式和毒性机理研究药物作用方式和毒性机理进进展（国际）展（国际）|19961996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（组研究中心（APAFAPAF）|美国美国NCINCI肺、直肠、乳腺和卵巢等肿瘤的蛋肺、直肠、乳腺和卵巢等肿瘤的蛋白质组数据库白质组数据库|NCINCI与与FDAFDA有关癌症不同发病阶段和治疗阶有关癌症不同发病阶段和治疗阶段的蛋白质组数据库段的蛋白质组数据库|英国、法国、德国、日本等国也分别投入巨资英国、法国、德国、日本等国也分别投入巨资进行蛋白质组学的研究进行蛋白质组学的研究 此外，此外，CeleraCelera公司、日内瓦蛋白质组公司与公司、日内瓦蛋白质组公司与布鲁克质谱仪制造公司也开始参与研究布鲁克质谱仪制造公司也开始参与研究The HUPO WorldThe HUPO WorldCanadaUSAChinaJapanKoreaAsia OceaniaSwedenRussiaUnited KingdomItalyGermanyFranceLatin AmericaAustraliaTheHumanProteomeOrganisation1.Human Liver Proteome Project(HLPP)2.Human Brain Proteome Project(HBPP)3.Proteomic Standards Initiative(PSI)4.Human Antibody Initiative(HAI)5.Human Plasma proteome Project(HPPP)6.Mouse Models Human Disease(MMHD)7.Human Disease Glycomics/Proteome Initiative(HGPI)8.HUPO Cardiovascular Initiative(HUPO CVI)进进展（国内）展（国内）|国家自然科学基金委于国家自然科学基金委于19971997年设立了重大项年设立了重大项目目“蛋白质组学技术体系的建立蛋白质组学技术体系的建立”|19981998年启动了蛋白质组学研究年启动了蛋白质组学研究|中国科学院生物化学研究所、军事医学科学中国科学院生物化学研究所、军事医学科学院与湖南师范大学已启动蛋白质组研究院与湖南师范大学已启动蛋白质组研究|中国科学院上海生命科学研究院、军事医学中国科学院上海生命科学研究院、军事医学科学院与复旦大学相继成立了专门的蛋白质科学院与复旦大学相继成立了专门的蛋白质组学研究中心组学研究中心|科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973973”计划项目和计划项目和“863863”计划项目计划项目；国国家自然科学基金委员会也将家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研蛋白质组研究究”列为重点项目。列为重点项目。|我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展白质组研究方面取得了较大的进展 第二节第二节 蛋白质组学研究方法概述蛋白质组学研究方法概述一、蛋白质组表达模式研究方法一、蛋白质组表达模式研究方法l研究蛋白质组的组成成分研究蛋白质组的组成成分 l主要技术有双向凝胶电泳、以质谱为代表主要技术有双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学技术。的蛋白质鉴定技术及生物信息学技术。Proteomics TechnologiesProteomics Technologies Biochemical techniquesMass spectrometry AnalysisBioinformatics Protein Identification（一）蛋白质组研究中的样品制备 采采用用细细胞胞或或组组织织的的全全蛋蛋白白质质组组分分进进行行蛋蛋白质组分析。白质组分析。进进行行样样品品预预分分级级，将将细细胞胞或或组组织织中中的的全全体体蛋蛋白白质质分分成成不不同同部部分分，分分别别进进行行研研究究，可可提提高高低低丰丰度度蛋蛋白白质质的的上上样样量量和和检检测测灵灵敏度敏度。样品预分级的主要依据样品预分级的主要依据蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等绿体等组织水平蛋白质组样品制备组织水平蛋白质组样品制备 原原因因：临临床床样样本本都都是是各各种种细细胞胞或或组组织织混混杂杂，而而且且状状态态不不一一，如如肿肿瘤瘤组组织织中中癌癌变变的的上上皮皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。激光捕获显微切割激光捕获显微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)可直接在可直接在显微镜下从组显微镜下从组织切片中精确织切片中精确分离特定的细分离特定的细胞或细胞群。胞或细胞群。LCM纯化肺腺癌细胞纯化肺腺癌细胞A：LCM切割前的肺腺癌组织；切割前的肺腺癌组织；B：LCM切割后肺腺癌组织；切割后肺腺癌组织；C：收集的肺腺癌细胞：收集的肺腺癌细胞肺腺癌转移相关蛋白质的筛选肺腺癌转移相关蛋白质的筛选ABC（二）蛋白质组研究中的样品分离关键技术：关键技术：双向凝胶电泳双向凝胶电泳（two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)利用蛋白质等电点和分子量差异，结合利用蛋白质等电点和分子量差异，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。工作原理：工作原理：T根据蛋白质等电点的不同进行第一向等电根据蛋白质等电点的不同进行第一向等电聚焦电泳分离聚焦电泳分离T转移到二向转移到二向SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根聚丙烯酰胺凝胶上，再根据相对分子量大小不同进行分离据相对分子量大小不同进行分离等等电电聚聚焦焦电电泳泳进进行行过过程程中中等等电电聚聚焦焦电电泳泳结结束束后后（）（）（）（）（）（）（）（）低低pH低低pH高高pH高高pH等电聚焦电泳（等电聚焦电泳（isoelectrophoresisfocusing,IEFIEF）聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝用下沿电场方向在凝胶内制造一个胶内制造一个pHpH梯度。梯度。每种蛋白质都将迁移每种蛋白质都将迁移至与它的至与它的pIpI 相一致相一致的的pHpH处。处。第一向第一向IEF电泳电泳固相固相pHpH梯度等电聚焦的优点梯度等电聚焦的优点克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。可以随意精确设定可以随意精确设定pHpH梯度。梯度。尤尤其其可可在在较较窄窄的的pHpH范范围围内内进进行行第第二二轮轮分分析，大大提高了分辨率及重复性。析，大大提高了分辨率及重复性。双向凝胶垂直双向凝胶垂直电泳电泳 双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图：二维分布图：水平方向反映出蛋白在水平方向反映出蛋白在pIpI上的差异，上的差异，垂直方向反映出它们在分子量上的差别垂直方向反映出它们在分子量上的差别。第二向第二向SDS-PAGE电泳电泳双向电泳方法的主要步骤双向电泳方法的主要步骤：1.样品准备样品准备2.第一向：固相第一向：固相pH梯度等电聚焦梯度等电聚焦3.第二向：第二向：SDS-PAGE电泳电泳4.染色：染色：考马氏亮兰或银染考马氏亮兰或银染5.图像分析：肉眼或自动扫描图像分析：肉眼或自动扫描Isoelectric Focusing(IEF)with IPG strips3-4 mm70-240 mmgelPlastic backing固相固相pH梯度等电聚焦电泳（第一向）示意图梯度等电聚焦电泳（第一向）示意图IEFSDS-PAGESecond Dimension:SDS-PAGESDS-PAGE电泳（第二向）示意图电泳（第二向）示意图Gel staining1st dimension IEF2nd dimension SDS-PAGEImaging and data evaluationSpot excision and mass spectrometrySamplepreparationExpression Proteomics with 2D Gel ElectrophoresisDysfunctions,CancerDysfunctions,CancerDrugsDrugsSimultaneousproteinprofilingtounderstandtheSimultaneousproteinprofilingtounderstandthefunctionandregulationofthousandsofproteinsfunctionandregulationofthousandsofproteins TemperatureTemperatureMetabolicstateMetabolicstateStressStressCultureconditionsCultureconditionsExpression Proteomics with 2D Gel ElectrophoresisDifferentialExpression ABE.Coli grown at 30 CE.Coli grown at 42 CDifferential AnalysisProteins fromcultured human cellsA=Derivative of B Protein samples courtesy of Dr.Steven Seeholzer,Fox Chase Cancer CenterABData evaluationControl sampleTreated sample3-4 replicate gels have to be run for each sampleMatchingStandard MapData evaluationData evaluation2D Gel DatabasesBiobaseBiobase 角质形成细胞角质形成细胞,膀胱癌等膀胱癌等 (丹麦丹麦Center for Genome Research)Center for Genome Research)http:/biobase.dk/cgi-bin/celishttp:/biobase.dk/cgi-bin/celisECO2DBASE ECO2DBASE 大肠杆菌大肠杆菌 (在在NCBINCBI库中库中)ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/respository/ECO2DBASEftp:/ncbi.nlm.nih.gov/respository/ECO2DBASEHeart-2DPAGE Heart-2DPAGE 人心肌人心肌 (德国柏林德国柏林)http:/www.chemie.fu-berlin.de/user/pleisshttp:/www.chemie.fu-berlin.de/user/pleissHSC-2DPAGE HSC-2DPAGE 人类心脏人类心脏 (英国英国HarefieldHarefield,Heart Science Center),Heart Science Center)http:/http:/www.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein/index.htmlwww.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein/index.htmlLSB LSB 人类人类,小鼠和大鼠肝脏等小鼠和大鼠肝脏等 (美国美国Large Scale Biology)Large Scale Biology)http:/.2dmaps/patterns.htmlhttp:/.2dmaps/patterns.htmlQUESTRef52 QUESTRef52 细胞细胞,大鼠胚胎大鼠胚胎,酵母酵母 (美国美国Cold Spring Harbor Lab)Cold Spring Harbor Lab)http:/http:/siva.cshl.orgsiva.cshl.org/SWISS-2DPAGE SWISS-2DPAGE 十个人类图谱十个人类图谱,包括包括:肝肝,浆细胞浆细胞,红细胞红细胞,血小板血小板,以以及酵母及酵母,大肠杆菌大肠杆菌 (瑞士日内瓦瑞士日内瓦,University Hospital)2-DE,University Hospital)2-DE数据库数据库hthttp:/expasy.hcuge.ch/ch2d/ch2d-top.htmltp:/expasy.hcuge.ch/ch2d/ch2d-top.htmlYeast Yeast S.S.cerevisiaecerevisiae,S.,S.pombepombe等等 (瑞典瑞典Goteborg University)Goteborg University)http:/yeast-2dpage.gmm.gu.se/http:/yeast-2dpage.gmm.gu.se/Yeast Yeast S.S.cerevisiaecerevisiae(美国美国Proteome Inc.)Proteome Inc.)http:/http:/ 极极酸酸、极极碱碱性性蛋蛋白白质质，疏疏水水性性蛋蛋白白质质，极极大大蛋蛋白白质质、极极小小蛋蛋白白质质以以及及低低丰丰度度蛋蛋白质用此种技术难于有效分离。白质用此种技术难于有效分离。胶胶内内酶酶解解过过程程费费时时、费费力力，难难于于与与质质谱谱联用实现自动化。联用实现自动化。新型非凝胶技术新型非凝胶技术 v液相色谱法液相色谱法liquidchromatography，LCo分配色谱法分配色谱法o吸附色谱法吸附色谱法o离子交换色谱法离子交换色谱法o排阻色谱法排阻色谱法v毛细管电泳毛细管电泳capillaryelectrophoresis，CELabAlliance Model 2000二元高压半制备梯度系统二元高压半制备梯度系统（三）蛋白质组研究的样品鉴定（三）蛋白质组研究的样品鉴定质谱（质谱（MSMS）法）法基本原理：基本原理：样品分子离子化后，样品分子离子化后，根据离子间质荷比根据离子间质荷比（m/zm/z）的差异来分的差异来分离并确定样品的分离并确定样品的分子量。子量。SpotidentificationSpot PickingDigestionMS Analysis and Database searchSpot cutterSpots of interest样品导入系统样品导入系统 离子源离子源质量分析器质量分析器检测器检测器 真空泵真空泵记录放大器记录放大器 质谱仪质谱仪结构示意结构示意 “软电离软电离”的特点的特点分分子子电电离离时时保保留留整整个个分分子子的的完完整整性性，不不会会形形成碎片离子。成碎片离子。灵灵敏敏度度高高、快快速速、能能同同时时提提供供样样品品的的精精确确分分子子量量和和结结构构信信息息、既既可可定定性性又又可可定定量量、并并能能有效地与各种色谱联用来分析复杂体系。有效地与各种色谱联用来分析复杂体系。基质辅助激光解吸基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱电离飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS）电喷雾质谱（电喷雾质谱（electrosprayionizationmassspectrometry，ESI-MS）主要质谱类型主要质谱类型Mass SpectrometryTime-of-Flight MSampcompL+M+H+20 kV+22 kV0 kV0 kV0 kV0 kV1)Ions enter source region,accelerated toward reflectron.2)Ions separate in space based on their relative mass-to-charge(m/z).3)Ions reverse path in reflectron.4)Ions impact detector.Flight timeSignal电离飞行时间质谱电离飞行时间质谱Electrospray Ionization2002NobelPrizeinChemistryawardedtoJohnFenn+Peptide ions in dropletsHydrated Peptide ionsGas-Phase Peptide ions+2.5 kV0 kV鉴定和注释蛋白质的路线鉴定和注释蛋白质的路线 通通过过肽肽质质谱谱指指纹纹图图（peptidemassfinger-printing，PMF）和数据库搜寻匹配和数据库搜寻匹配 通通过过测测出出样样品品中中部部分分肽肽段段二二级级质质谱谱信信息息或或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配 SampleMSSpectrum典型二级质谱图肽质谱指纹图在数据库中匹配肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功的可能原因不成功的可能原因样品量太少，样品量太少，PMFPMF图信噪比太低图信噪比太低2-DE2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质角蛋白或其他蛋白质的污染角蛋白或其他蛋白质的污染蛋白质发生较多的翻译后修饰，数据库中未有记载蛋白质发生较多的翻译后修饰，数据库中未有记载所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多 未知的新蛋白质未知的新蛋白质 数据库规模太小数据库规模太小 组织切片或印片原位质谱分析技术组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）傅里叶转换回旋共振质谱（傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS）表面增强激光解吸表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）联合技术精确鉴定蛋白质联合技术精确鉴定蛋白质 液质联用技术（液质联用技术（LC-MS/MSLC-MS/MS）蛋白质混合物直接通过蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替液相色谱分离以代替2-DE的的分离，然后进入分离，然后进入MS系统获得系统获得肽段分子量，再通过串联肽段分子量，再通过串联MS技术，得到部分序列信息技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。鉴定蛋白质。根根据据蛋蛋白白质质带带电电性性及及疏疏水水性性不不同同，用用MS分离多肽复合物。分离多肽复合物。多维多维色谱技术（色谱技术（LC/LC-MS/MS）多维蛋白质鉴定技术多维蛋白质鉴定技术(multidimensionalproteinidentificationtechnology)（四）蛋白质组学研究的生物信息学（四）蛋白质组学研究的生物信息学 生生物物信信息息学学是是蛋蛋白白质质组组学学研研究究的的一一个个不可缺少的部分。不可缺少的部分。构建和分析双向凝胶电泳图谱构建和分析双向凝胶电泳图谱 数据库的搜索与构建数据库的搜索与构建应应 用用 蛋白质组学数据库：蛋白质组学数据库：SWISS-PROT:/http:/www.expasy.ch/sprot/目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库。目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库。NRDB和和dbEST:目前应用最普遍数据库。目前应用最普遍数据库。NCBI:http:/www.ncbi.nih.gov/Genomes/EMBL:http:/www.embl.org/Prosite:/http:/www.expasy.org/prosite/PDB：http:/www.rcsb.org/pdb/概概念念：把把一一个个基基因因组组表表达达的的全全部部蛋蛋白白质质或或一一个个复复杂杂体体系系中中所所有有的的蛋蛋白白质质进进行精确的定量和鉴定。行精确的定量和鉴定。（五）定量蛋白质组学研究（五）定量蛋白质组学研究低丰度蛋白质检测困难低丰度蛋白质检测困难蛋蛋白白质质表表达达量量差差异异很很小小，如如在在50%以以下时，精确定量成为瓶颈下时，精确定量成为瓶颈 蛋白质表达的瞬时变化蛋白质表达的瞬时变化蛋白质定量的难点蛋白质定量的难点1 1基于双向凝胶电泳的定量基于双向凝胶电泳的定量 蛋白质组研究策略蛋白质组研究策略 双双向向凝凝胶胶电电泳泳(2-DE)是是目目前前唯唯一一能能分分离离展展示示大大量量蛋蛋白白质质并并进进行行蛋蛋白白质质定定量量分分析析的的一一种种方方法。法。荧光差异显示双向电泳（荧光差异显示双向电泳（F-2D-DIGE）。与与2-DE2-DE的区别：的区别：采用了荧光试剂来标记蛋白质并通过荧光成像以获取电泳图像优点：优点：可以在同一块凝胶上比较两种不同来源或不同处理样本的蛋白质表达谱二、蛋白质组功能模式的二、蛋白质组功能模式的研究方法研究方法揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深入了解蛋白质的结构与功调的关系，并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。构功能的关系。主要研究目标（一）蛋白质翻译后修饰的研究（一）蛋白质翻译后修饰的研究翻译后修饰翻译后修饰糖糖基基化化乙乙酰酰化化甲甲基基化化羧羧基基化化磷磷酸酸化化修饰肽的检测需要高灵敏度方法修饰肽的检测需要高灵敏度方法蛋白质翻译后修饰要求进行定量分析蛋白质翻译后修饰要求进行定量分析修饰状态下进行处理和电离的条件难找修饰状态下进行处理和电离的条件难找测定工作量巨大测定工作量巨大研究面临的困难：研究面临的困难：（二）蛋白质相互作用研究技术（二）蛋白质相互作用研究技术生命的基本过程是不同功能蛋生命的基本过程是不同功能蛋白质在时空上有序和协同作用白质在时空上有序和协同作用 新陈代谢以蛋白质复合体或多新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网络协同作用实现蛋白质网络协同作用实现 细胞信号转导及病原体感染和细胞信号转导及病原体感染和免疫反应免疫反应1989年年Field和和Song等人在酵母细胞中设计的分等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。析蛋白质相互作用的方法。以真核细胞转录激活因子以真核细胞转录激活因子(GAL4)的结构和活性的结构和活性特点为基础的。特点为基础的。N端含细胞核定位序列（端含细胞核定位序列（NLS）和与酵母）和与酵母GAL1基因启基因启动子上游激活序列动子上游激活序列(UASG)结合的结构域。结合的结构域。C端含端含GAL1转录激活结构域转录激活结构域1.1.酵母双杂交系统酵母双杂交系统（yeasttwo-hybridsystem）系系 统统 构构 建建分别构建含分别构建含GAL4BD和和AD 的两个酵的两个酵母融合蛋白表达载体；母融合蛋白表达载体；建立含特殊基因型、适用于双杂交体分建立含特殊基因型、适用于双杂交体分析的酵母菌株析的酵母菌株（酵母双杂交（酵母双杂交 YeastTwo-Hybrid）主要特点和优势主要特点和优势使蛋白质表现型和基因型相联系使蛋白质表现型和基因型相联系筛选筛选cDNAcDNA文库文库真实反应细胞内蛋白质间相互作用情况真实反应细胞内蛋白质间相互作用情况不需分离靶蛋白不需分离靶蛋白敏感性高敏感性高 1.1.假阳性结果假阳性结果 2.2.假假阴阴性结果性结果 3.3.限于核内表达的蛋白质的相互作用限于核内表达的蛋白质的相互作用 缺缺 点点融合蛋白PIII基因型表达型2噬菌体表面显示技术噬菌体表面显示技术(phagedisplay)三个基本因素：三个基本因素：v在噬菌体在噬菌体pp衣壳蛋白衣壳蛋白N N端插入外源待筛基因端插入外源待筛基因;形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面；形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面；同时其保持的外源蛋白天然构象能被相应的同时其保持的外源蛋白天然构象能被相应的抗体或受体识别。抗体或受体识别。v利用固相支持物上的抗体或受体，采用亲和利用固相支持物上的抗体或受体，采用亲和筛选法（筛选法（panning），），从噬菌体文库中筛选从噬菌体文库中筛选出能结合筛选分子的目的噬菌体。出能结合筛选分子的目的噬菌体。v外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，其外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，其编码基因可通过分泌型噬菌体的单链编码基因可通过分泌型噬菌体的单链DNA测测序推导出来。序推导出来。Solid phase selection with immunotubes BBBBBBvvImmunotubecoated withantibodycoated withsteptavidin and biotinylated antibodyBbiotin antigenSolution phase selection with biotinylated antigen Bind to Streptavidincoated microtitre wellsWash to remove unbound phage particles.Elute bound phageAmplify eluted phageRepeat selectionAnalyzea)ELISAb)Specificityc)Sequencingd)Affinitye)ActivityE.coli感染和扩增主主要要应应用用筛选与特异抗体或受体相互作用的蛋白质筛选与特异抗体或受体相互作用的蛋白质研究抗体或受体的结合位点研究抗体或受体的结合位点构建随机肽库、抗体库和蛋白文库构建随机肽库、抗体库和蛋白文库改造和提高蛋白质的生物学和免疫学特性改造和提高蛋白质的生物学和免疫学特性研究新型多肽药物、疫苗和抗体研究新型多肽药物、疫苗和抗体研究涉及到蛋白质与核酸相互作用的生物学研究涉及到蛋白质与核酸相互作用的生物学过程和新型的基因治疗导向系统过程和新型的基因治疗导向系统主要优点主要优点在细菌外完成在细菌外完成高度的选择性高度的选择性亲和纯化反应高效性亲和纯化反应高效性不需要了解筛选分子结构不需要了解筛选分子结构缺缺 点点限制肽段大小限制肽段大小外源蛋白质无法正确折叠或修饰外源蛋白质无法正确折叠或修饰融合蛋白可能会影响到蛋白质本身活性融合蛋白可能会影响到蛋白质本身活性3基于质谱的蛋白质相互作用基于质谱的蛋白质相互作用研究方法研究方法已知蛋白制备已知蛋白制备 蛋白质复合体的纯化蛋白质复合体的纯化 蛋白质蛋白质复合体复合体的质谱鉴定的质谱鉴定基本步骤：基本步骤：（1）亲和层析耦联质谱技术）亲和层析耦联质谱技术 基本原理：基本原理：将某种将某种蛋白质以共价键固定在基蛋白质以共价键固定在基质上质上含有与之相互含有与之相互作用的蛋白质的细胞裂解作用的蛋白质的细胞裂解液过柱液过柱先用低盐溶先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质液洗脱下未结合的蛋白质然后用高盐溶液或然后用高盐溶液或SDS溶溶液洗脱液洗脱多维液相色谱耦联质谱技多维液相色谱耦联质谱技术（术（MDLC-ESI-MS/MS）鉴定靶蛋白的鉴定靶蛋白的结合蛋白。结合蛋白。先决条件先决条件得到足够多的保持生物活性的重组得到足够多的保持生物活性的重组已知蛋白作为诱饵（已知蛋白作为诱饵（bait）获得足够量、纯度高的与诱饵相互获得足够量、纯度高的与诱饵相互作用的蛋白质作用的蛋白质利用含靶蛋白的融合蛋白获得利用含靶蛋白的融合蛋白获得纯度高的相互作用蛋白质纯度高的相互作用蛋白质谷胱甘肽谷胱甘肽S转移酶（转移酶（glutathioneS-transferase，GST）融合蛋白融合蛋白蛋白蛋白A融合蛋白融合蛋白主要优点主要优点 灵敏度高：高浓度已知蛋白灵敏度高：高浓度已知蛋白候选蛋白质与已知的结合机会均等候选蛋白质与已知的结合机会均等 检测多亚基蛋白质之间的相互作用检测多亚基蛋白质之间的相互作用（2）免疫共沉淀耦联质谱技术）免疫共沉淀耦联质谱技术 原理：原理：当细胞在非变性条件当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质下来。如果用蛋白质X X的的抗体免疫沉淀抗体免疫沉淀X X，那么与那么与X X在体内结合的蛋白质在体内结合的蛋白质Y Y也也能沉淀下来。能沉淀下来。缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用的蛋白质蛋白质相互作用研究鼻咽癌细胞系中的研究鼻咽癌细胞系中的p53相互作用蛋白相互作用蛋白抗抗p53抗体与抗体与HNE1和和HNE2总蛋白进行总蛋白进行免疫共沉淀免疫共沉淀SDS-PAGE分离免疫沉淀复合物分离免疫沉淀复合物切取切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，分析，得到相应的肽序列标签得到相应的肽序列标签搜索数据库搜索数据库特特点点 生理条件下蛋白质之间的相互作用生理条件下蛋白质之间的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用所有蛋白质与靶蛋白的相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用 局局 限限 性性A.灵敏性不高灵敏性不高B.假阳性假阳性C.受免疫球蛋白的干扰较大受免疫球蛋白的干扰较大lBiacore基于基于表面等离子共振表面等离子共振（SPR）进行生物进行生物大分子相互作用分析大分子相互作用分析(BIA)l质谱质谱（MALDI-TOF-MS或或LC-ESI-MS/MS）鉴鉴定定Biacore芯片上配体所捕获的生物分子芯片上配体所捕获的生物分子(3)(3)生物传感器耦联质谱技术生物传感器耦联质谱技术 动力学动力学亲和力亲和力结合的速度结合的速度有多快？有多快？一个单抗与另一个单抗相比较一个单抗与另一个单抗相比较哪一个的结合能力更强哪一个的结合能力更强?浓度浓度 结合的量有多少？结合的量有多少？有生物活性的蛋白有生物活性的蛋白质浓度是多少质浓度是多少?特异性特异性有没有结合？有没有结合？抗体与抗原能结合抗体与抗原能结合吗吗?结合的能力结合的能力有多强？有多强？Biacore技术提供的数据技术提供的数据 Biacore应用领域包含癌症研究、信号传应用领域包含癌症研究、信号传递、多分子复合物的结构和组装、分子识别、递、多分子复合物的结构和组装、分子识别、免疫调节、免疫测定、药物开发、疫苗开发、免疫调节、免疫测定、药物开发、疫苗开发、瞬时结合检测，药物免疫原性检测。瞬时结合检测，药物免疫原性检测。（三）蛋白质芯片（三）蛋白质芯片l构建蛋白质表达谱；构建蛋白质表达谱；l抗原抗原-抗体筛选；抗体筛选；l药物靶点筛选；药物靶点筛选；l蛋白质蛋白质-蛋白质交互作用筛选。蛋白质交互作用筛选。l疾病诊断和预警疾病诊断和预警蛋白质芯片的类型蛋白质芯片的类型Antibody Array Antigen Array Ligand Array