卫生微生物检测方法.ppt

本章主要内容本章主要内容q第一第一节 卫生微生物生微生物检测的特点及基本原的特点及基本原则q第二第二节 卫生指示微生物生指示微生物q第三第三节 卫生微生物研究和生微生物研究和检测的方法的方法q第四第四节 卫生微生物研究和生微生物研究和检测方法方法发展前景展前景1.第一第一节卫生微生物学生微生物学检测的特点与基本原的特点与基本原则检测特点：特点：检测对象：致病、非致病、条件致病微生物象：致病、非致病、条件致病微生物标本来源：人体、本来源：人体、环境境环境中致病微生物数量少，需要特异的境中致病微生物数量少，需要特异的检测方法，并且多依靠方法，并且多依靠卫生指示微生物生指示微生物检测原原则：样品的采集原品的采集原则样品的运送原品的运送原则实验室室检验原原则2.一、一、样品的采集原品的采集原则（一）（一）样品必品必须要有代表性要有代表性:采采样量量：满足足检测要求要求采采样部位部位：均匀采：均匀采样采采样时间：便于分析微生物的：便于分析微生物的动态变化化采采样批号：尽量批号：尽量检测每个批号每个批号3.（二）避免（二）避免对样品的品的污染染器材器材灭菌、无菌操作菌、无菌操作（三）避免（三）避免对样品中微生物的品中微生物的杀灭和抑制和抑制避免有毒物避免有毒物质的残留和高温影响的残留和高温影响（四）（四）对样品品进行行详细的的标记这是基本要求是基本要求（1 1）所有盛）所有盛样容器必容器必须有和有和样品一致的品一致的标记。在。在标记上上应记明明产品品标志与号志与号码和和样品品顺序号以及其他序号以及其他需要需要说明的情况。明的情况。标记应牢固，具防水性，字迹不牢固，具防水性，字迹不会被擦掉或脱色。会被擦掉或脱色。（2 2）当）当样品需要托运或由非品需要托运或由非专职抽抽样人人员运送运送时，必必须封封识样品容器。品容器。4.二、二、样品的运送原品的运送原则尽快送尽快送检一般一般3-4h3-4h内送内送检，减少，减少细菌死亡和菌死亡和进一步繁殖一步繁殖带来的来的影响。如不能及影响。如不能及时运送，运送，应根据根据样品性品性质采取常温冷采取常温冷暗、暗、0-40-4冰箱、冰箱、-15-15以下冰箱或冷藏以下冰箱或冷藏库内保存。内保存。注意保注意保护待待检的微生物的微生物一定的温度一定的温度加保加保护剂或去除不利因素或去除不利因素运送培养基（运送培养基（运运输缓冲液）：冲液）：如病毒、如病毒、厌氧菌等氧菌等5.根据生物安全根据生物安全规定，妥善包装待运定，妥善包装待运输的的标本本进行完善的行完善的样品交接品交接必必须有有样品送品送检单，与，与实验室人室人员逐逐项核核对后交接后交接6.三、三、实验室室检验原原则 1.1.具有相具有相应的的实验室硬件室硬件设施施 WHOWHO对微生物危害性的微生物危害性的分分级 生物安全等生物安全等级（biosafety level,BSL）BSL-1（P1实验室室）：）：检验非致病微生物。非致病微生物。BSL-2（P2实验室室）：）：检验一般致病微生物。一般致病微生物。BSL-3（P3实验室室）：可）：可检验特殊危特殊危险致病微致病微生物。生物。BSL-4（P4实验室室）：可）：可检验危害性最危害性最严重的重的病原体。病原体。7.世世卫组织感染性微生物的危感染性微生物的危险度等度等级分分类危危险度等度等级一一级无或极低的个体和群体危无或极低的个体和群体危险不太可能引起人或不太可能引起人或动物致病的微生物物致病的微生物危危险度等度等级二二级个体危个体危险中等，群体危中等，群体危险低低病原体能引起人或病原体能引起人或动物的疾病，但不太可能物的疾病，但不太可能对实验室室工作人工作人员、社区、牲畜或、社区、牲畜或环境造成境造成严重危害。重危害。实验室暴露也室暴露也许会引起会引起严重感染，但是重感染，但是对感染有有效的感染有有效的预防和治防和治疗措施措施感染感染传播的危播的危险有限有限8.世世卫组织感染性微生物的危感染性微生物的危险度等度等级分分类危危险度等度等级三三级个体危个体危险高，群体危高，群体危险低低病原体通常能引起人或病原体通常能引起人或动物的物的严重疾病，但一般不会重疾病，但一般不会发生感染个体向其他个体的生感染个体向其他个体的传播播对感染有有效的感染有有效的预防和治防和治疗措施措施危危险度等度等级四四级个体和群体的危个体和群体的危险均高均高病原体通常能引起人或病原体通常能引起人或动物的物的严重疾病，并且很容易重疾病，并且很容易发生个体之生个体之间的直接或的直接或间接接传播播一般没有有效的一般没有有效的预防和治防和治疗措施措施9.BSL-1不太可能引起人不太可能引起人类疾病或疾病或兽医学意医学意义的无疾病的无疾病安全措施：参照安全措施：参照标准微生物学安全操作（准微生物学安全操作（=标准准预防措施）。防措施）。预期的安全期的安全设备：不需要，所以也不需要生物安：不需要，所以也不需要生物安全柜全柜实验室室设备要求：需要开放要求：需要开放实验台和水槽。台和水槽。10.BSL-2对群体中出群体中出现的中等危的中等危险和人和人类疾病有关系的的疾病有关系的的微生物。微生物。危危险性在于皮肤性在于皮肤损伤、摄食、黏膜暴露。食、黏膜暴露。这一防一防护级别代表的微生物代表的微生物为：金黄色葡萄球菌、：金黄色葡萄球菌、沙沙门菌、菌、轮状病毒、甲型流感病毒、麻疹病毒等。状病毒、甲型流感病毒、麻疹病毒等。11.安全措施：参照一安全措施：参照一级生物安全生物安全实验室操作，室操作，+进入受限入受限生物危害警告生物危害警告标志志“锐器器”防范措施防范措施清除清除污染生物安全手册染生物安全手册预期的安全期的安全设备：在操作在操作产生生喷溅或气溶胶的感或气溶胶的感染微生物染微生物时，使用，使用验收收过的物理防的物理防护设备，如，如I I 级或或IIII级生物安全柜生物安全柜。BSL-212.PPE PPE（个体防（个体防护装装备）：根据需要穿戴：根据需要穿戴实验室大褂、手套和面部室大褂、手套和面部保保护用具。用具。实验室室设备要求：需要求：需要开放要开放实验台、水槽台、水槽和高和高压灭菌器。菌器。BSL-213.高高压灭压灭菌器菌器洗眼器洗眼器BSL-214.对对本地或外来的呼吸本地或外来的呼吸传传播微生物（气溶胶）以及播微生物（气溶胶）以及可能引起可能引起严严重的或潜在致命感染的微生物。重的或潜在致命感染的微生物。这这一防一防护级别护级别代表的微生物代表的微生物为为：结结核核杆菌、炭疽杆菌、炭疽杆菌、霍乱弧菌、高致病性禽流感病毒、黄杆菌、霍乱弧菌、高致病性禽流感病毒、黄热病病病毒、艾滋病病毒等。病毒、艾滋病病毒等。重重视环境和境和实验室人室人员的保的保护屏障。屏障。BSL-315.安全措施：参照二安全措施：参照二级生物安全生物安全实验室操作，室操作，+进入控制入控制全部全部废弃物均清除弃物均清除污染染实验室服装在洗熨前室服装在洗熨前须清除清除污染染免疫血清基免疫血清基线预期的安全期的安全设备：对于所有开放性微生物操于所有开放性微生物操作使用作使用I I 级或或IIII级生物安全柜。生物安全柜。BSL-316.PPE PPE（个体防（个体防护装装备）：根据需要穿戴：根据需要穿戴实验室大室大褂、手套和呼吸器。褂、手套和呼吸器。实验室室设备要求：二要求：二级生物安全生物安全实验室要求室要求 +实验实验室与公共走廊通道在物理上分开室与公共走廊通道在物理上分开门门自自动动关关闭闭，双，双门门入口入口排出排出废废气不可再循气不可再循环环实验实验室内室内负压负压BSL-317.对对于危于危险险的或外来的微生物，它的或外来的微生物，它们们是危及生命的是危及生命的很高个体危很高个体危险险，通，通过过气溶胶或未知气溶胶或未知传传播播风险风险的微的微生物生物进进行行传传播，而且目前尚无疫苗或治播，而且目前尚无疫苗或治疗疗。这这一防一防护级别护级别代表的微生物代表的微生物为为：天花病毒、天花病毒、埃博埃博拉病毒。拉病毒。危危险性在于呼吸暴露接触到性在于呼吸暴露接触到传染性的气溶胶、黏染性的气溶胶、黏膜，或是暴露的膜，或是暴露的损伤皮肤接触到皮肤接触到传染唾沫。染唾沫。BSL-418.安全措施：参照三安全措施：参照三级级生物安全生物安全实验实验室操作，室操作，+进进入前更入前更换换衣服衣服出口出口处处淋浴淋浴离开离开实验实验室室时时，全部物品都要清除，全部物品都要清除污污染染预预期的安全期的安全设备设备：全部操作程序均在全部操作程序均在IIIIII级生物生物安全柜安全柜内内进行，行，或者或者穿正穿正压压供气的的供气的的连连体防体防护护服服（Hazmat Hazmat 套服）并套服）并I I级和和IIII级生物安全柜。生物安全柜。BSL-419.实验实验室室设备设备要求：三要求：三级级生物安全生物安全实验实验室要求室要求 +独立的建筑或明确划分出的隔离区域独立的建筑或明确划分出的隔离区域专专用用进进排气、真空和清除排气、真空和清除污污染系染系统统安全文件明确安全文件明确规规定的其他附加要求定的其他附加要求重点防止活性微生物重点防止活性微生物污污染染环环境境BSL-420.微生物危险度等级与生物安全水平、操作和设备的关系危危险险度度等等级级生物安全水平生物安全水平实验实验室室类类型型实验实验室操作室操作安全安全设设施施1基础 一级生物安全水平基础的教学、研究GMT不需要；开放实验台2基础 二级生物安全水平初级卫生服务；诊断、研究GMT+加防护服、生物危害标志开放实验台，此外需生物安全柜 用于防护可能生成的气溶胶GMT=微生物学操作技术规范21.微生物危险度等级与生物安全水平、操作和设备的关系危危险险度度等等级级生物安生物安全水平全水平实验实验室室类类型型实验实验室操作室操作安全安全设设施施3防护 三级生物安全水平特殊的诊断、研究在二级生物安全防护水平上增加特殊防护服、进入制度、定向气流生物安全柜和或其他所有实验室工作所需要的基本设备4最高防护 四级生物安全水平危险病原体在三级生物安全防护水平上增加气锁入口、出口淋浴、污染物品的特殊处理级生物安全柜或级生物安全柜并穿着正压防护服、双开高压灭菌器（穿过墙体）、经过滤的空气22.2.2.具有合格的人具有合格的人员和和标准准检验方法方法人人员要有要有资质，并，并经常接受培常接受培训采用国家采用国家标准方法或公准方法或公认方法（方法（WHO、EPA等）等）3.3.加加强实验室室质量控制量控制仪器、器、设备、试剂：定期：定期检定和校准定和校准注意注意记录和核和核查：如：如GLP实验室室报告告规范：数据范：数据规范，完整范，完整签名盖章名盖章三、三、实验室室检验原原则23.4.4.实验室室应有有应急措施急措施应对突突发事件能力事件能力需做多种需做多种检验时，微生物，微生物优先先恰当的恰当的样品品处理与理与检验三、三、实验室室检验原原则24.第二第二节卫生生检验中的指示微生物中的指示微生物v指示微生物（指示微生物（indicator microorganism）定定义：v在常在常规卫生生监测中，用以指示中，用以指示检品品卫生状况及生状况及安全性的（非致病）微生物（或安全性的（非致病）微生物（或细菌）。菌）。v设定指示微生物的原因定指示微生物的原因v微生物（包括致病和非致病的）种微生物（包括致病和非致病的）种类繁多，不繁多，不可能一一可能一一检测v环境中致病微生物往往数量少，境中致病微生物往往数量少，检测困困难，需，需要用相要用相对易于易于检测的微生物来的微生物来间接反映。接反映。25.一、指示微生物的一、指示微生物的选择q选择原原则q数量大、易于数量大、易于检出，方法出，方法简单，有代表性。，有代表性。q指示微生物的种指示微生物的种类：反映微生物反映微生物综合合污染染：细菌、霉菌和酵母菌落菌、霉菌和酵母菌落总数数反映微生物反映微生物污染来源染来源：粪便便污染指示菌（大染指示菌（大肠菌群、菌群、粪大大肠菌群等）；空气菌群等）；空气污染指示菌（溶血性染指示菌（溶血性链球菌等）球菌等）不得不得检出的致病微生物出的致病微生物间接反映致病微生物接反映致病微生物：如反映：如反映肠道病毒的噬菌体等道病毒的噬菌体等消毒效果指示菌：消毒效果指示菌：嗜嗜热脂肪芽脂肪芽孢杆菌（杆菌（压力蒸汽力蒸汽灭菌）菌）；短小芽；短小芽孢杆菌（杆菌（电离离辐射射灭菌）；枯草杆菌黑色菌）；枯草杆菌黑色变种芽种芽孢（环氧乙氧乙烷灭菌）菌）26.二、二、常用的指示微生物常用的指示微生物（一）（一）综合合污染指染指标菌落菌落总数数定定义：单位量的被位量的被检样品品(g、ml、cm2、m3)内，所含内，所含有的能在某种培养基上有的能在某种培养基上经一定条件、一定一定条件、一定时间培养后培养后生成的菌落数量。生成的菌落数量。表述：表述：细菌菌落菌菌落总数、霉菌和酵母菌菌落数、霉菌和酵母菌菌落总数。数。cfu/g、cfu/ml。(cfu，colony forming unit)意意义：综合判定合判定检样被微生物被微生物污染程度。染程度。方法：方法：标准平板准平板计数法、表面涂布法数法、表面涂布法27.（二）来源（二）来源污染指染指标粪便、空气便、空气污染指示菌染指示菌粪便便污染指示菌的染指示菌的选择标准准是人及温血是人及温血动物物肠道正常菌群的道正常菌群的组成部分，且数量大。成部分，且数量大。在在粪便便污染染的的样品品中中易易检出出，未未被被污染染的的样品品中中无无此此菌存在。菌存在。排排出出体体外外后后，在在外外环境境存存活活时间与与肠道道致致病病菌菌大大致致相相似或稍似或稍长。在外在外环境中不繁殖。境中不繁殖。如如作作为饮用用水水的的指指示示菌菌，对氯、臭臭氧氧等等抵抵抗抗力力应不不低低于于肠道致病菌或略道致病菌或略强。检验方法方法简便，易于便，易于检出和出和计数。数。28.常常见粪便便污染指示菌染指示菌1.1.大大肠菌群（菌群（coliform groupcoliform group）概念：概念：指一群需氧的或兼性指一群需氧的或兼性厌氧的，在氧的，在35-3724h35-3724h培养能分解乳糖培养能分解乳糖产酸酸产气的气的G G-无芽无芽孢杆菌。杆菌。种种类：大大肠埃希菌属、枸埃希菌属、枸橼酸杆菌属、酸杆菌属、肠杆菌属、杆菌属、克雷伯菌属、沙雷菌属、克雷伯菌属、沙雷菌属、变形杆菌属某些种等。形杆菌属某些种等。卫生学意生学意义评价价检样卫生生质量，推断有无量，推断有无肠道致病菌道致病菌污染。染。总大大肠菌群（菌群（total coliformtotal coliform）3737培养生培养生长的大的大肠菌群。菌群。粪大大肠菌群（菌群（fecal coliformfecal coliform）（耐）（耐热大大肠菌群）菌群）44-4544-45能能发酵乳糖的大酵乳糖的大肠菌群。菌群。方法：方法：发酵法，酵法，滤膜法，膜法，纸片法片法29.大大肠菌群作菌群作为指示菌的一些新指示菌的一些新问题大大肠菌群菌群“受受损”对细菌菌计数的影响数的影响大大肠埃希菌的致病性埃希菌的致病性大大肠菌群中某些菌群中某些细菌可以在外界繁殖菌可以在外界繁殖大大肠菌群的菌群的检测范范围有限有限水中大水中大肠菌群菌群 200 cfu/100ml 小小肠结肠炎耶炎耶尔森菌阳性率森菌阳性率 6.4%水中大水中大肠菌群菌群 200 cfu/100ml 小小肠结肠炎耶炎耶尔森菌阳性率森菌阳性率 8.9%30.2 2 大大肠埃希菌埃希菌(Escherichae coliEscherichae coli)检出意出意义最大最大鉴定方法定方法较复复杂药品行品行业使用使用较多多近年近年应用用较多多作作为粪便便污染指示菌，大染指示菌，大肠埃希菌埃希菌检出意出意义最最大，其次是耐大，其次是耐热大大肠菌群，菌群，总大大肠菌群再次菌群再次31.3.3.肠球菌球菌(EnterococcusEnterococcus)（粪链球菌球菌)人人及及动物物肠道道正正常常菌菌群群。在在人人粪数数量量仅次次于于大大肠菌菌群群细菌，菌，动物物粪便中所占比例高。便中所占比例高。对恶劣劣环境境抵抵抗抗力力较强，营养养水水体体繁繁殖殖力力低低于于大大肠菌菌群。群。单独独检查不不能能作作为粪便便污染染的的决决定定性性指指标，但但可可提提供供有价有价值的的补充材料。充材料。判断判断污染来源。染来源。方法：方法：耐耐热大大肠菌群与菌群与肠球菌之比球菌之比4.1 4.1 污染来源人染来源人 耐耐热大大肠菌群与菌群与肠球菌之比球菌之比0.7 0.7 污染来源染来源动物物 耐耐热大大肠菌群与菌群与肠球菌之比球菌之比4.14.10.7 0.7 混合来源混合来源32.4 4 产气气荚膜梭菌膜梭菌(CostirdiaCostirdia)G G+有芽有芽孢，还原原亚硫酸硫酸盐的的厌氧杆菌。氧杆菌。外界外界环境抵抗力境抵抗力较强。不不适适合合作作为主主要要指指标，但但可可提提供供有有价价值的的补充充材料。材料。特特别适适合合水水样不不能能及及时送送检，或或在在含含有有有有毒毒物物质（氯）的）的环境中境中检测是否有是否有过粪便便污染。染。产气气荚膜梭菌（）膜梭菌（）大大肠菌群（）菌群（）新近新近污染染产气气荚膜梭菌（）膜梭菌（）大大肠菌群（）菌群（）陈旧旧污染染33.常常见空气空气污染指示菌：染指示菌：口腔和鼻腔的口腔和鼻腔的链球菌球菌（无人居住的房屋空气中没（无人居住的房屋空气中没有有链球菌，房屋内住人越多，球菌，房屋内住人越多，链球菌的含量亦越球菌的含量亦越高）。高）。一般用草一般用草绿色色链球菌与溶血性球菌与溶血性链球菌合起球菌合起来来计算。算。34.（三）（三）不得不得检出的致病菌出的致病菌微生物微生物主要危害主要危害主要指示作用主要指示作用沙沙门菌菌肠道致病菌道致病菌口服口服药、食品不得、食品不得检出出志志贺菌菌菌痢菌痢食品不得食品不得检出出金葡菌金葡菌局部化局部化脓、食、食物中毒物中毒食品、化食品、化妆品、外用品、外用药不得不得检出；游泳池水指出；游泳池水指标菌菌铜绿假假单胞胞菌菌条件致病菌条件致病菌外外伤、眼科用、眼科用药、化、化妆品不品不得得检出，游泳池水指出，游泳池水指标菌菌破破伤风梭菌梭菌外外伤皮肤感染皮肤感染外用外用药不得不得检出出35.（四）（四）间接反映致病微生物存在的指示菌接反映致病微生物存在的指示菌肠道病毒指示微生物的条件：道病毒指示微生物的条件：检验方法方法简单操作安全操作安全在被人在被人肠道病毒道病毒污染的染的环境中一定存在，数量等于境中一定存在，数量等于或大于或大于肠道病毒的数目道病毒的数目对于消毒于消毒剂和外和外环境的抵抗力境的抵抗力应与与肠道病毒一致或道病毒一致或稍稍强。36.肠道病毒的指示微生物道病毒的指示微生物 指示物指示物优点点缺点缺点应用用大大肠杆菌噬杆菌噬菌体菌体f2与与肠道病毒道病毒耐受性相似；耐受性相似；存在于人存在于人粪中；中；检测较简便便粪便中数量少；可便中数量少；可能在能在环境中繁殖；境中繁殖；检测结果受大果受大肠杆杆菌菌DNA噬菌体影响噬菌体影响水中病毒消水中病毒消毒效果毒效果评价价指指标脊髓灰脊髓灰质炎炎病毒减毒疫病毒减毒疫苗株苗株操作安全操作安全非所有非所有粪便有；便有；检测困困难应用于消毒用于消毒学和水中病学和水中病毒研究毒研究37.第三第三节卫生微生物研究和生微生物研究和检测的方法的方法（一）（一）样品的品的处理理（二）（二）损伤菌的复菌的复苏（三）（三）选择性增菌与分离性增菌与分离（四）定量（四）定量计数方法数方法（五）分型（五）分型鉴定的方法定的方法（六）其他分子生物学方法（六）其他分子生物学方法38.混匀混匀样品（非常重要）品（非常重要）液体：液体：电动混匀、手混匀、手摇混匀、敲打混匀混匀、敲打混匀固体：固体：搅碎混匀、研磨混匀、匀碎混匀、研磨混匀、匀浆混匀混匀样品品浓缩沉淀法沉淀法过滤法法吸附沉淀法吸附沉淀法一、一、样品的品的处理理39.环境境样品微生物，在采品微生物，在采样送送检等等过程中，受各程中，受各种不利因素作用，可种不利因素作用，可发生生亚致死性致死性损伤。用普。用普通培养方法不容易培养。需通培养方法不容易培养。需预先先进行复行复苏（resuscitation）或修复（）或修复（repair）才能培养。）才能培养。无无选择压力的培养力的培养环境境较低的培养温度低的培养温度二、二、损伤菌的复菌的复苏40.检测的困的困难：微生物小、少、混合。微生物小、少、混合。选择方法：方法：抑制其它微生物生抑制其它微生物生长、促、促进目目标微生微生物生物生长物理方法：物理方法：厌氧条件培养氧条件培养厌氧菌、光照条件培氧菌、光照条件培养藻养藻类等等化学方法化学方法：根据微生物的：根据微生物的营养需求，加入特制养需求，加入特制的促的促进或抑制生或抑制生长的物的物质三、三、对目的菌的目的菌的选择性增菌与分离性增菌与分离41.四、微生物定量四、微生物定量计数法数法计数数 直接（直接（显微微镜直接直接计数、比数、比浊法）法）间接接（使菌繁殖）（使菌繁殖）倾注平板法注平板法表面涂布法表面涂布法MPN法法“单个菌个菌”“菌落菌落”计数数统计学方法学方法42.（一）（一）倾注平板法注平板法v10倍梯度准确稀倍梯度准确稀释待待测样品，准确将稀品，准确将稀释物定量物定量均匀地均匀地倾注到注到琼脂培养基中，培养后脂培养基中，培养后计数菌落。数菌落。（二）（二）表面涂布法表面涂布法v将将样品定量涂布在品定量涂布在琼脂培养基的表面，培养后，脂培养基的表面，培养后，计数表面生数表面生长的菌落数。的菌落数。43.（三）（三）最可能数法最可能数法MPN法（最常用于大法（最常用于大肠菌群菌群计数）数）vMPN（most probable number）计数是将待数是将待测样品作一系列稀品作一系列稀释，一直稀，一直稀释到将少量（如到将少量（如lm1）的稀）的稀释液接种到新液接种到新鲜培养基中没有或极培养基中没有或极少出少出现生生长繁殖。根据没有生繁殖。根据没有生长的最低稀的最低稀释度度与出与出现生生长的最高稀的最高稀释度，采用度，采用“最大或然数最大或然数”理理论，查表表计算出算出样品品单位体位体积中中细菌数的菌数的近似近似值。44.