T∕CIFST 008-2022 乳中乳过氧化物酶活性的测定 比色法.pdf

ICS 67. 040CCS X 10团体标准T/CIFST 0082022乳中乳过氧化物酶活性的测定 比色法Determination of the lactoperoxidase activity in milk一 Colorimetric method2022-04-22 发布2022-04-22 实施中国食品科学技术学会 发布T/CIFST 0082022i刖 百本文件按照GB/T 1 . 12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规 定起草。本文件的某些内容可能涉及专利，发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中国食品科学技术学会提出并归口。本文件起草单位:光明乳业股份有限公司、上海市农产品质量安全中心、北京中检葆泰生物技术有 限公司、内蒙古伊利实业集团股份有限公司。本文件主要起草人:郭慧媛、张锋华、丰东升、刘龙飞、李志君、花榜清、王霞、赵婷婷、赵欣。T/CIFST 0082022乳中乳过氧化物酶活性的测定 比色法1范围本文件规定了乳中乳过氧化物酶活性测定的比色法。本文件适用于生乳、巴氏杀菌乳中乳过氧化物酶活性的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1乳过氧化物酶活性单位 unit of lactoperoxidase activity在温度20 30 ,pH 6. 57. 2条件下，每分钟催化氧化1 f/mol底物3,3,5,5-四甲基联苯胺 (TMB)所需要的乳过氧化物酶的量表述为1个乳过氧化物酶活性单位，即1 U。4原理乳中乳过氧化物酶与底物3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)发生氧化反应，生成蓝色产物,加酸终 止反应后溶液变成黄色。在450 nm下测定溶液的吸光度，乳过氧化物酶的活性与吸光度成正比，通过 标准曲线定量计算其酶活性。5试剂和材料5. 1乳过氧化物酶活性测定所用试剂。或使用Evergreen乳过氧化物酶活性试剂盒测定，试剂盒组成 见附录AL5. 1 . 1乳过氧化物酶标准溶液:来源于菌落总数小于1 . 0X1 0$ CFU/mL、体细胞数小于7. 5X1 05个/mL 的生乳，酶活性)1600 U/L。5. 1 . 2检测稀释液:含5%乙酸和100 g/L脱脂乳粉的溶液。5. 1 . 3样品处理溶液：10%30%乙酸溶液。5. 1 . 4乳过氧化物酶底物：7. 2 mg/L 3,3,5,5-四甲基联苯胺溶液。1)给出该信息是为了方便本文件使用者。如果其它产品的操作步骤有不同，需经试验评估后采用。1T/CIFST 00820225. 1 . 5终止液：O. 1 8 mol/L硫酸溶液。注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。5. 2 标准溶液制备5. 2 . 1分别取6个1 mL离心管，标记为16,分别加入150 /L检测稀释液。5. 2. 2准确吸取150 /L乳过氧化物酶标准溶液，置1号管中，混合，此管乳过氧化物酶活性为800 U/Lo 至少静置15 s后进行下一步稀释。5. 2. 3准确吸取1号管中标准溶液150 /L,置2号管中，混合，此管乳过氧化物酶活性为400 U/L。 至少静置15 s后进行下一步稀释操作。5. 2. 4按照上述5. 2. 3方法，逐级稀释4次，分别得到乳过氧化物酶活性为20。U/L. 1 00 U/L、50 U/L 和25 U/L的系列标准溶液，如表1所示。检测稀释液的乳过氧化物酶活性为0 U/L。表1系列标准溶液稀释表离心管编号标准溶液（“D检测稀释液5L）乳过氧化物酶活性（U/L）11501508002150（取自1号管）1504003150（取自2号管）1502004150（取自3号管）1501005150（取自4号管）150506150（取自5号管）150255. 3材料5. 3. 1 滤纸：直径 1 1 . 5 cm。5. 3. 2微孔板:共96个微孔（1 2X8孔/条）。6仪器和设备6. 1酶标仪:装载450 nm滤光片。6. 2 天平:感量为0. 001 g。6. 3 离心机：，3000Xg。6. 4振荡器:振荡频率100次/min。6. 5移液器及枪头：10 /L1000 2L。6. 6多道移液器：50 *L300 MLO6. 7 离心管：1 mL, 1 5mL。7样品制备与保存7. 1样品制备7. 1 . 1生乳:采集500 mL生乳,搅拌均匀后作为样品待用。7. 1 . 2巴氏杀菌乳:取500 mL巴氏杀菌乳,搅拌均匀后作为样品待用。2T/CIFST 00820227. 2样品保存样品从运输至检测前全程冷藏(06)运输储存,样品到达后于2 h内完成检测。8分析步骤8. 1样品提取吸取1 0. 00 mL样品，置于15 mL离心管中，加入0. 6 mL样品处理溶液，涡旋混匀，静置510 min, 3000 g离心10 min,用滤纸过滤，收集滤液待测。8.2测定取出所需数量的微孔板,并做好标记。吸取50 /L滤液(8. 1 )和系列标准溶液分别加至微孔中，加 入50 ML乳过氧化物酶底物溶液(TMB),吹打混匀，室温避光孵育15 min。孵育结束后，向每个微孔中 加入100 2L终止液，吹打混匀后，立即用酶标仪在450 nm下读取并记录每个微孔的吸光度(OD值)。样品中乳过氧化物酶活性可用检测稀释液稀释至标准曲线范围内，一般生乳应稀释20100倍, 巴氏杀菌乳应稀释140倍。每次测定样品和标准溶液至少做双平行。9结果计算与表述以乳过氧化物酶标准溶液的酶活性为横坐标，系列标准溶液对应的平均OD值为纵坐标，以四参 数法绘制标准曲线，参见附录A中A. 2。从标准曲线上得到相应的乳过氧化物酶活性0)后，样品中 乳过氧化物酶活性结果按式(D计算：A=yXl. 06X/ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (1)式中：A样品中乳过氧化物酶的活性，单位为U/L；y标准曲线中获得的样品中乳过氧化物酶活性,单位为U/L；f样品的稀释倍数；1 . 06-系数:总体积(10 mL+0. 6 mL)/取样体积10 mLo计算结果取整数。10精密度和检出限在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10%。当取样量为io mL时,乳过氧化物酶活性的方法检出限为25 U/L。3T/CIFST 0082022附录A（规范性）Evergreen乳过氧化物酶活性检测试剂盒A. 1试剂盒组成Evergreen乳过氧化物酶活性检测试剂盒包括：a）微孔板:共96个微孔（1 2X8孔/条）；b）乳过氧化物酶标准品:来源于菌落总数小于1 . 0X1 05 CFU/mL、体细胞数小于7. 5X 1（）5个/mL 的生鲜乳,2 mL,1 6OO U/L；c）检测稀释液:含5%乙酸和1 00g/L脱脂乳粉的溶液,50 mL；d）乳过氧化物酶底物：7. 2 mg/L 3,3,5,5-四甲基联苯胺溶液，6 mL；e）终止液：0. 18 mol/L 硫酸,12 mL；f）样品处理溶液：1 0%30%乙酸溶液,60 mL。A. 2标准曲线谱图标准曲线谱图示例见图A. 1（根据本标准提供的计算方法或者软件绘制标准曲线）。3 A. 1标准曲线谱图示例1.00.8g 0.60.40.2 n n标准曲线*标准品J活性（U/L） /0D （平均值）0. 00 0. 045（变异系数：3.1%）25. 00 0.133（变异系数：5. 3%）50. 00 0. 205（变异系数：1.7%）100. 00 0. 334（变异系数：1.1%）200. 00 0. 547（变异系数：2.1%）400. 00 0. 941（变异系数：4. 7%）6. 00 200. 00 400. 00乳过氧化物酶活性/ （U/L）相关系数：0. 9999A. 3试剂盒保存和注意事项A. 3. 1试剂盒于2 8 C避光保存,使用前恢复至室温。A. 3. 2不同批号试剂盒中组分不得混用。A. 3. 3超过有效期的试剂盒不得使用。4