T∕CVMA 96-2022 猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.220B 41团体标准T/CVMA 962022猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光RT-PCR 检测方法Duplex real time RT-PCR detection method for classical swine fever virusand African swine virus2022 - 08 - 12 发布2022 - 08 - 12 实施中国兽医协会发 布T/CVMA 962022I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14缩略语.15仪器和设备.26试剂和材料.27病料采集和处理.28病毒总核酸的提取.29荧光 RT-PCR 反应.210生物安全要求.4附录 A （资料性） 病原基因参考序列.5附录 B （资料性） 引物和探针序列.6附录 C （资料性） 病毒核酸提取步骤.7T/CVMA 962022II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由中国海关科学技术研究中心提出。本文件由中国兽医协会归口。本文件起草单位：中国海关科学技术研究中心、禾旭（郑州）生物技术有限公司、聊城市畜牧兽医事业发展中心、沈阳海关技术中心。本文件主要起草人：史喜菊、赖平安、杜思乐、刘艳华、李秀梅、陈金海、刘近、任彤、赵相鹏、张伟、耿庆华、刘全国、蒲静、高志强、任雪建、吕园园、杨转。T/CVMA 9620221猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光 RT-PCR 检测方法1范围本文件规定了猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒双重荧光RT-PCR检测操作规程。本文件适用于猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒鉴别诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求NY/T 541动物疫病实验室检验采样方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1双重荧光 RT-PCRDuplex real time RT-PCR双重荧光反转录-聚合酶链式反应。3.2Ct 值 Cycle threshold每个反应孔内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数。4缩略语下列缩略语适用于本文件。CSFV：猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus）ASFV：非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus）6-FAM：6-羧基荧光素(6-Carboxyfluorescein)Cy5：荧光发光基团BHQ：荧光淬灭基团T/CVMA 96202225仪器和设备多通道荧光PCR仪、生物安全柜、冰箱（2 6 和-20 ） 、台式冷冻离心机、组织匀浆机、漩涡震荡器、微量可调移液器（10 L、200 L和1000 L） 。6试剂和材料6.1病毒总核酸提取试剂 TIANamp Virus DNA/RNA Kit 或其他等效核酸提取试剂。6.2Multiplex one-step RT-PCR kit 或其他等效多重荧光 RT-PCR 试剂。6.3无水乙醇（分析纯）和 75%乙醇（用新开启的分析纯无水乙醇和 DEPC 处理水配制）及实验用水按照 GB/T 6682 规定使用，-20 预冷。6.4阳性对照猪瘟病毒5UTR基因体外转录的非感染型RNA片段、非洲猪瘟病毒VP72基因重组质粒、片段序列见附录A。6.5 阴性对照猪瘟病毒阴性样品、非洲猪瘟病毒阴性样品。6.6 引物和探针序列引物和探针序列见附录B。7病料采集和处理病料采集和处理，请遵照NY/T541动物疫病实验室检验采样方法有关规定进行操作。8病毒总核酸的提取见附录C。9荧光 RT-PCR 反应9.1双重荧光 RT-PCR 反应体系双重荧光RT-PCR反应体系的配制见表1。表 1双重荧光 RT-PCR 反应体系（20uL）混合液组份体积uL终浓度nM2Multiplex RT-PCR 缓冲液101T/CVMA 9620223表 1 双重荧光 RT-PCR 反应体系（20uL）（续）混合液组份体积uL终浓度nMMultiplex 酶混合液11引物混合物1.6400CSFV 探针（Cy5 标记）0.4200ASFV 探针（FAM 标记）0.4200病毒总核酸5DEPC 水补齐至总体积20注：1. 引物混合物指的是2种病原的所有引物。 2. 此反应体积以Path-IDTM Multiplex one-step RT-PCR kit为例，如果使用其他等效试剂，请遵照试剂说明书配制。将混合液充分混合后，最后加入模板，简短离心，按照下列反应程序进行荧光RT-PCR反应。9.2荧光 RT-PCR 反应程序荧光 RT-PCR 反应程序见表 2。表 2荧光 RT-PCR 反应程序4810 min9510 min9515 sec44 个循环6045 sec9.3结果描述及判定9.3.1质控标准所有阳性对照（FAM和Cy5）均有S形扩增曲线，阴性对照（FAM和Cy5）均无扩增曲线且Ct40或者无值。满足此条件，视为此次实验有效。9.3.2结果判断和鉴别有扩增曲线，且Ct35，判定为核酸检测阳性；有扩增曲线，35Ct40，属于疑似区间，需要重新确认，建议使用单荧光RT-PCR方法确认；如果Ct值仍然40，则判定为核酸检测阳性，如果Ct值40或者无Ct值，判定为核酸检测阴性。T/CVMA 9620224没有扩增曲线，或者Ct40，判定核酸检测阴性。FAM阳性荧光信号表示ASFV核酸检测阳性， Cy5阳性荧光信号表示CSFV核酸检测阳性， 两种阳性荧光信号表示ASFV和CSFV核酸检测双阳性。10生物安全要求样品处理和核酸提取以及废弃物处理按照GB 19489实验室生物安全通用要求规定，在相应等级的生物安全实验室或者生物安全柜中进行，并做好个人防护。T/CVMA 9620225AA附录A（资料性）病原基因参考序列A.1 ASFV-VP72 基因片段参考序列tccgggtgcgatgatgattacctttgctttgaagccacgggaggaataccaacccagtggtcatattaacgtatccagag caagagaatt ttatattagt tgggacacgg attacgtggg gtctatcact acggctgatc ttgtggtatcggcatctgct attaactttc ttcttcttca gaacggttca gctgtgctgc gttacagtacA.2 CSFV-5UTR 基因片段参考序列gagcagaagcccacctcgagatgctatgtggacgagggcatgcccaagacacaccttaaccctagcgggggtcgctaggg tgaaatcaca ccacgtgatg ggagtacgac ctgatagggt gctgcagagg cccactatta ggctagtataaaaatctctg ctgtacatgg cacatggagt tgaatcattt tgaacttttaT/CVMA 9620226附录B（资料性）引物和探针序列引物和探针序列见表B.1。表B.1 引物和探针序列病原靶基因引物名称序列猪瘟病毒 （CSFV） 5UTR基因FP15 AGCCCACCTCGAGATGCTA 3FP25 AGCCCACCTCGATATGCTATG 3FP35 AGCTCACCTCGAGATGCTATG 3RP15 CTATCAGGTCGTACTCCCATCAC 3RP25 TATCAGGTCGTACCCCCATCA 3Probe15Cy5-ACGAGGGCAWGCCCAAGAC -BHQ1 3Probe25Cy5-ACGAGGGCACGCCCAAG -BHQ1 3非洲猪瘟病毒（ASFV）VP72基因FP15 GCGATGATGATTACCTTTGCTTTG 3FP25 CGATGATGATTACCTTCGCTTTGA 3RP15 CGATACCACAAGATCAGCCGT 3RP25 CTGATACCACAAGATCAGCCGT 3RP35 GATACCACAAGATCGGCCGT 3Probe15 FAM-CACGGGAGGAATACCAACCCAG-BHQ1 3T/CVMA 9620227附录C（资料性）病毒核酸提取步骤C.1 Carrier RNA 溶液的配制C.1.1 Carrier RNA储存液配制向装有310 g Carrier RNA冻干粉的管子中加入310 L RNase-Free ddH2O，将Carrier RNA彻底溶解，得到终浓度为1 g/L的溶液，并分装，置于-20 储存。C.1.2 Carrier RNA工作液配制根据样品数量计算所需缓冲液GB和Carrier RNA溶液的体积 （计算公式如下1和2），将缓冲液GB与Carrier RNA溶液颠倒混匀，即得到Carrier RNA工作液；为避免溶液出现起泡现象，请勿使用涡旋振荡。.(1)公式（1）中：y为需要加入缓冲液GB的体积（mL） ；n为同时提取的样品个数；m=0.22 mL。.(2)公式（2）中：z为需要加入Carrier RNA溶液的体积（L）；y为需要加入缓冲液GB的体积（mL） ；x=28 L/mL。C.2操作步骤C.2.1用移液器将 20 L Proteinase K 加入一个干净的 1.5 mL 离心管中。C.2.2向离心管中加入 200 L 血浆/血清/病毒培养液或 25 mg 组织匀浆（样品需平衡至室温），如果样本体积小于 200 L，可加入 0.9%NaCl 溶液补充。C.2.3加入 200 L Carrier RNA 工作液，盖上管盖，涡旋振荡 15 sec 混匀。C.2.456孵育 15 min，简短离心，收集附着在管壁及管盖的液体。C.2.5加入 250 L 无水乙醇，涡旋振荡 15 sec，彻底混匀，在室温（15-25）放置 5 min。C.2.6简短离心，收集附着在管壁及管盖的液体。C.2.7将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至 RNase-Free 吸附柱 CR2（吸附柱放在收集管中），盖上管盖， 6000g 离心 1 min，弃收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。C.2.8小心打开吸附柱盖子，加入 500 L 溶液 GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），盖上管盖，6000g 离心 1 min，弃收集管中的废液，将吸附柱放回收集管。C.2.9小心打开吸附柱盖子，加入 600 L 溶液 PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），盖上管盖，静置 2 min， 6000g 离心 1 min，弃收集管中的废液，将吸附柱放回收集管。C.2.10重复步骤 2.9。C.2.11小心打开吸附柱盖子，加入 500 L 无水乙醇，盖上管盖， 6000g 离心 1 min，弃收集管中的废液。C.2.12将吸附柱放回收集管中，13400g 离心 3 min，使吸附膜完全变干，弃收集管中的废液。T/CVMA 9620228C.2.13将吸附柱放入一个新的 RNase-Free 离心管（1.5 mL）中，小心打开吸附柱的盖子，室温放置3 min，使吸附膜完全变干。向吸附膜的中间部位悬空滴加 20-150 L RNase-Free ddH2O，盖上盖子，室温放置 5 min。C.2.1413400g 离心 1 min，收集到的即为病毒总核酸（DNA 或 RNA）。注：上述提取步骤以TIANamp Virus DNA/RNA Kit为例，如果使用其他等效核酸提取试剂，请遵照试剂盒使用说明书操作。B_