【发酵工艺学总论】第二章-工业发酵菌种.ppt

本章内容本章内容2.1 发酵工业菌种发酵工业菌种 2.2 发酵发酵工业工业菌种筛选的原则与基本技术菌种筛选的原则与基本技术2.3 发酵工业菌种鉴定发酵工业菌种鉴定2.4 发酵发酵工业工业菌种改良菌种改良2.5 菌种保藏、复壮与扩培菌种保藏、复壮与扩培n本本章章重重点点：菌菌种种来来源源，筛选原原则与与方方法法，菌种衰退，分离菌种衰退，分离纯化化n难 点点：菌种保藏、复壮及：菌种保藏、复壮及扩大培养大培养n微生物在自然界中分布极为广泛，不断开发和利用微生物资源是人类社会实现可持续发展的必由之路，也是解决现代社会经济高速发展所带来的人口、资源、能源、环境、健康等问题的重要途径。n到目前为止，人类所知道的微生物种类不到总数的10%，而真正被利用的还不到1%，进一步开发利用微生物资源的潜力很大。发酵工业广泛应用于医药化工、食品轻工、农业、环保等诸多领域。n发酵工业应用的微生物种类：可培养微生物+未培养微生物n可培养微生物可分为四大类：细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌，其中酵母菌和丝状真菌为真核生物。2.1 发酵工业菌种发酵工业菌种概述概述：n特点特点：单细胞原核微生物，自然界分布最广，数量最多，与人类：单细胞原核微生物，自然界分布最广，数量最多，与人类生产和生活关系十分密切。生产和生活关系十分密切。n应用应用：n醋酸杆菌醋酸杆菌 （醋醋）n乳酸杆菌乳酸杆菌 （双歧杆菌、瑞士乳杆菌（双歧杆菌、瑞士乳杆菌酸奶酸奶）n芽孢杆菌芽孢杆菌 （枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌豆豉豆豉；纳豆芽孢杆菌；纳豆芽孢杆菌纳豆纳豆）n丙酮丁醇梭菌丙酮丁醇梭菌 （有机酸）有机酸）n大肠杆菌大肠杆菌 （构建工程菌（构建工程菌核酸与蛋白质疫苗核酸与蛋白质疫苗）n谷氨酸棒状杆菌谷氨酸棒状杆菌 （味精味精）2.1 发酵工业菌种发酵工业菌种2.1.1 细菌细菌n特点：特点：单细胞真核微生物，自然界普遍存在，主要分布于含糖较单细胞真核微生物，自然界普遍存在，主要分布于含糖较多的酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子上以及果园土多的酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子上以及果园土壤中。壤中。n酿酒酵母酿酒酵母n假丝酵母属假丝酵母属n产朊假丝酵母产朊假丝酵母n解脂假丝酵母解脂假丝酵母n热带假丝酵母热带假丝酵母n毕赤酵母属毕赤酵母属、汉逊酵母属、汉逊酵母属 （基因工程菌）（基因工程菌）应用应用：用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及生产可：用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶以及生产可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。2.1 发酵工业菌种发酵工业菌种2.1.2 酵母菌酵母菌n特点：特点：“发霉的真菌发霉的真菌”，自然界分布广泛，大量存在于土壤、空，自然界分布广泛，大量存在于土壤、空气、水和生物体中，喜欢偏酸性环境。气、水和生物体中，喜欢偏酸性环境。n曲霉属曲霉属n米曲霉米曲霉n黑曲霉黑曲霉n青霉属青霉属n青霉菌：点青霉、产黄青霉青霉菌：点青霉、产黄青霉n桔青霉桔青霉n根霉属根霉属n德氏根霉德氏根霉n米根霉、小麦曲根霉米根霉、小麦曲根霉n红曲霉属红曲霉属n紫红曲霉紫红曲霉2.1 发酵工业菌种发酵工业菌种2.1.3 霉菌霉菌应用：应用：可广泛应用于生产酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。可广泛应用于生产酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。n特点：特点：介于细菌和真菌之间的单细胞微生物；原核生物类群，自介于细菌和真菌之间的单细胞微生物；原核生物类群，自然界分布广，尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较广，大然界分布广，尤其在含有机质丰富的微碱性土壤中分布较广，大多腐生，少数寄生。多腐生，少数寄生。n链霉菌属链霉菌属n小单孢菌属小单孢菌属n地中海诺卡氏菌地中海诺卡氏菌n米苏里游动放线菌米苏里游动放线菌应用：应用：最大经济价值在于能产生多种抗生素，如链霉素、红霉素、最大经济价值在于能产生多种抗生素，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等。从微生物中发现的抗生素有金霉素、庆大霉素等。从微生物中发现的抗生素有60%以上由以上由放线菌产生。放线菌产生。2.1 发酵工业菌种发酵工业菌种2.1.4 放线菌放线菌n定义：定义：指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培指迄今所采用的微生物纯培养分离及培养方法还未获得纯培养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为养的微生物，其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99。n特点特点：广泛存在于各种自然环境中，尤其各种极端环境中，如高温、：广泛存在于各种自然环境中，尤其各种极端环境中，如高温、低温、高压、高盐度、高辐射以及较强的酸碱环境。低温、高压、高盐度、高辐射以及较强的酸碱环境。n研究方法：研究方法：模拟自然培养法模拟自然培养法:原位培养、培养条件优化、单细胞操作原位培养、培养条件优化、单细胞操作 宏基因组分析法宏基因组分析法：是直接依据基因或基因组、蛋白质序列，以及：是直接依据基因或基因组、蛋白质序列，以及 其调节表达机制构建高效表达的工程菌等途径进行开发利用其调节表达机制构建高效表达的工程菌等途径进行开发利用获得获得优良基因资源。优良基因资源。2.1 发酵工业菌种发酵工业菌种2.1.5 未培养微生物未培养微生物常见菌种及其产物列表常见菌种及其产物列表微生物类群微生物类群菌种菌种代谢产物代谢产物细菌细菌枯草杆菌、大肠杆枯草杆菌、大肠杆菌、短杆菌等菌、短杆菌等有机酸、氨基酸、核苷酸、酶、维生素、醇类、抗生素等放线菌放线菌链霉菌属等链霉菌属等抗生素、维生素、酶、甾体转化等酵母菌酵母菌酿酒酵母，酒精酵酿酒酵母，酒精酵母母单细胞蛋白、核苷酸、核黄素、细胞色素C等霉菌霉菌曲霉属，红曲霉属，曲霉属，红曲霉属，根霉属，青霉属等根霉属，青霉属等乙醇、有机酸、抗生素、酶、维生素等已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍抗生素抗生素生产有关的微生物 抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：放线菌（链霉素四环放线菌（链霉素四环素；红霉素等）素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌一些产芽孢的细菌植物或植物或动物来动物来源源已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍氨基酸氨基酸生产有关的微生物 氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单 谷氨酸发酵的菌种：棒杆菌属、短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌其它氨基酸生产菌：常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌食品酶制剂食品酶制剂生产有关的微生物 开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，美国需要得到FDA的批准，目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。目前大多数的工业微生物酶的生产都局限于使用仅有的11种真菌、8种细菌和4种酵母菌。-淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍酶发酵生产常用的微生物酶发酵生产常用的微生物微生物生产的酶类枯草芽孢杆菌-淀粉酶、蛋白酶、-葡聚糖酶、碱性磷酸酶等大肠杆菌谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等黑曲霉糖化酶、-淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纤维素酶等米曲霉糖化酶和蛋白酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等青霉葡萄糖氧化酶、果胶酶、纤维素酶、磷酸二酯酶、脂肪酶、凝乳酶、核酸酶等木霉纤维素酶等根霉糖化酶、-淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶等毛霉蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等链霉菌纤维素酶、蛋白酶等啤酒酵母转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇脱氢酶等假丝酵母脂肪酶、转化酶等问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？理论理论上来说，微生物（包括动、植物细胞）几上来说，微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到乎可以生产我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定工业化生产对于某一种特定的产品，只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。的微生物才具有大量表达的潜力。已工业化产品生产菌的介绍已工业化产品生产菌的介绍2.2 发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术2.2.1 发酵工业菌种筛选的总趋势与要求发酵工业菌种筛选的总趋势与要求2.2.2 符合发酵工业要求的菌种获得途径符合发酵工业要求的菌种获得途径2.2.3 分离筛选原理与技术分离筛选原理与技术2.2.4 应用举例应用举例（1）菌种选择的总趋势菌种选择的总趋势n野生菌野生菌变异菌变异菌n自然选育自然选育代谢控制育种代谢控制育种n诱发基因突变诱发基因突变基因重组的定向育种基因重组的定向育种2.2.1 发酵工业菌种筛选的总趋势与要求发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 2.2 发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术n能能在在廉廉价价原原料料制制成成的的培培养养基基上上迅迅速速生生长长，且且生生成成的目的产物产量高、易于回收；的目的产物产量高、易于回收；n生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；n培养条件易于控制；培养条件易于控制；n抗噬菌体及杂菌污染的能力强；抗噬菌体及杂菌污染的能力强；（2）菌种选择的要求菌种选择的要求2.2.1 发酵工业菌种筛选的总趋势与要求发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 n菌种不易变异退化；菌种不易变异退化；n对放大设备的适应性强；对放大设备的适应性强；n菌菌种种不不是是病病原原菌菌，不不产产生生任任何何有有害害的的生生物物活活性性物质和毒素。物质和毒素。（2）菌种选择的要求（续）菌种选择的要求（续）2.2.1 发酵工业菌种筛选的总趋势与要求发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 n从菌种保存机构直接购买所需菌株。中国菌种保藏管理委员会（CCCCM）、美国典型菌种保藏中心（ATCC）、英国国家典型菌种保藏所（NCTC）、日本的大阪发酵研究所（IFO）等；n从自然界中筛选；n从生产过程中已有菌种中筛选发生正突变的优良菌种。2.2.2 符合发酵工业要求的菌种获得途径符合发酵工业要求的菌种获得途径（菌种来源）（菌种来源）（1）筛选的指导思想筛选的指导思想（2）分离筛选工作在实际中应用的几个方面分离筛选工作在实际中应用的几个方面（3）新种分离筛选原理与技术新种分离筛选原理与技术2.2.3 菌种分离筛选原理与技术菌种分离筛选原理与技术（1）筛选的两种指导思想筛选的两种指导思想n先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。先分离纯化，再结合工艺要求进行筛选。n分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。分离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。结果有两种可能：结果有两种可能：获得适于工业发酵菌株获得适于工业发酵菌株只获得选育所需的出发菌株只获得选育所需的出发菌株(2)分离筛选工作在实际中应用的几个方面分离筛选工作在实际中应用的几个方面n从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌；n生产中长期使用的菌种的定期分离筛选生产中长期使用的菌种的定期分离筛选；n从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工业目的的优良菌株的的优良菌株；n从已知菌种和大自然中分离新菌株从已知菌种和大自然中分离新菌株n寻找新的发酵产品的产生菌；寻找新的发酵产品的产生菌；n寻找老产品的新的优良菌株。寻找老产品的新的优良菌株。从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处：从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处：经济性经济性指导性指导性设计筛选方案时必须考虑两个要点设计筛选方案时必须考虑两个要点选择性选择性灵敏度灵敏度（3）新种分离与筛选的步骤新种分离与筛选的步骤调查研究（包括资料查阅）调查研究（包括资料查阅）试验方案设计试验方案设计 含微生物样品的采集含微生物样品的采集 （如何使样品中含所需微（如何使样品中含所需微 生物的可能性大？）生物的可能性大？）样品预处理样品预处理 （如何在后续的操作中使这种可（如何在后续的操作中使这种可 能性实现）能性实现）菌种分离菌种分离根据目的菌株及其产物特点分根据目的菌株及其产物特点分 选择性分离方法选择性分离方法 随机分离方法随机分离方法 (定向筛选定向筛选选择压力选择压力)(用筛选方案用筛选方案-检测系统进行间接分离）检测系统进行间接分离）富集液体培养富集液体培养 固体培养基条件培养固体培养基条件培养 (初筛初筛)菌种纯化菌种纯化 复筛复筛 菌种纯化菌种纯化 初步工艺条件摸索初步工艺条件摸索 再复筛再复筛 生产性能测试生产性能测试较优菌株较优菌株1-3株株保藏及进一步做生产试验保藏及进一步做生产试验 某些必要试验和某些必要试验和 或作为育种的出发菌株或作为育种的出发菌株 毒性试验等毒性试验等含微生物样品的采集含微生物样品的采集n采样时应注意的问题采样时应注意的问题:n土壤微生物的分布土壤微生物的分布（耕地、菜园和近郊土壤细菌和放线菌；山坡上的森林土壤霉菌和酵母菌）n采土深度采土深度（5-25CM土层适宜）n土壤植被情况土壤植被情况（葡萄根部附近土壤酵母菌）n采样季节采样季节n土壤的酸碱度土壤的酸碱度（偏碱细菌和放线菌；偏酸霉菌和酵母菌）n对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：对于分离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：n土壤来源广泛土壤来源广泛n在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种种样品的预处理样品的预处理n目的：提高分离效率目的：提高分离效率n方法：方法：n物理方法：热处理物理方法：热处理（减菌）；膜过滤法；膜过滤法（浓缩）；离心法离心法（浓缩）n化学方法：化学方法：通过在培养基中添加某些化学成分来增加特定微生物的数量。几丁质放线菌；CaCO3嗜碱性放线菌n诱饵法诱饵法 石蜡、花粉、蛇皮、毛发等分离方法的选择分离方法的选择n根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法n菌种的营养特征独特菌种的营养特征独特 n生长特征独特生长特征独特 n无无选择性特征选择性特征根据产物的特征进行根据产物的特征进行随机分离随机分离选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控选择性分离的关键：生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。制，从而实现定向富集筛选。选择性分离选择性分离选择性分离原理和技术选择性分离原理和技术n生长条件的选择与控制原理生长条件的选择与控制原理n控制营养成分控制营养成分 n控制培养基酸碱度控制培养基酸碱度 n添加抑制剂添加抑制剂 n控制培养温度控制培养温度 n控制通气条件控制通气条件 n选择性分离技术选择性分离技术n富集液体培养技术富集液体培养技术n固体培养技术固体培养技术施加选择压力，进行定向筛选施加选择压力，进行定向筛选 A.富集液体培养富集液体培养n增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术n技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件n培养方式培养方式分批培养方式：以最大比生长速率分批培养方式：以最大比生长速率（max）筛选，）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题连续培养方式：以比生长速率（连续培养方式：以比生长速率（）筛选）筛选比生长速率（）与限制性基质浓度（S）有关。ABS0基质浓度对基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（两种菌的比生长速率（）的影响）的影响当当SS0时，富集什么菌株？时，富集什么菌株？连续富集培养技术分离菌株的优点连续富集培养技术分离菌株的优点n分离的菌株特别适合连续发酵生产过程分离的菌株特别适合连续发酵生产过程n有利于分离具有某种工业生产特性的菌株有利于分离具有某种工业生产特性的菌株n可以筛选出能共生的稳定混合培养物可以筛选出能共生的稳定混合培养物B.固体培养技术固体培养技术n常用于分离某些酶产生菌常用于分离某些酶产生菌 n选择压力：在选择培养基中加入所需酶选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质的基质 随机分离原理与技术随机分离原理与技术n从产物入手，通过设计从产物入手，通过设计高产培养基高产培养基和建立快速和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。选出所需的目的菌。n技术技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。筛选方法的确定。n随机分离技术举例随机分离技术举例 n抗生素产生菌的筛选抗生素产生菌的筛选n药理活性化合物产生菌的筛选药理活性化合物产生菌的筛选n生长因子产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选n多糖产生菌的筛选多糖产生菌的筛选 高产培养基设计的几个原则高产培养基设计的几个原则 n制制备备一一系系列列的的培培养养基基，其其中中有有各各种种类类型型的的养养分分成成为为生长限制因素；生长限制因素；n使用一聚合或复合形式的生长限制养分；使用一聚合或复合形式的生长限制养分；n避避免免使使用用容容易易同同化化的的碳碳源源或或氮氮源源，防防止止分分解解代代谢谢物物阻遏；阻遏；n确定含有所需的辅因子（确定含有所需的辅因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；）；n使使用用pH缓冲剂以减少缓冲剂以减少pH变化；变化；n前体、促进剂及抑制剂的采用。前体、促进剂及抑制剂的采用。抗生素产生菌的筛选抗生素产生菌的筛选n筛选模型：筛选模型：试验菌试验菌n筛选方法：筛选方法：铺菌法铺菌法影印平板法影印平板法液体培养筛选液体培养筛选 抗药性抗药性筛选筛选筛选模型：筛选模型：氨苄青霉素氨苄青霉素和和-内酰胺酶内酰胺酶产生菌（克雷白氏菌）协同产生菌（克雷白氏菌）协同 I I II II无试样时（不含棒酸时），无试样时（不含棒酸时），I I对对IIII菌作用不大菌作用不大有试样时（含棒酸时），有试样时（含棒酸时），I I对对IIII菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性固体培养筛选固体培养筛选试验菌试验菌 代表微生物类型代表微生物类型金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌209p革兰氏阳性球菌革兰氏阳性球菌枯草杆菌枯草杆菌6633革兰氏阳性杆菌革兰氏阳性杆菌大肠杆菌大肠杆菌革兰氏阴性肠道细菌革兰氏阴性肠道细菌耻垢分枝杆菌耻垢分枝杆菌607 结核杆菌结核杆菌白色念珠菌白色念珠菌 酵母状真菌酵母状真菌 青霉菌青霉菌 丝状真菌丝状真菌药理活性化合物产生菌的筛选药理活性化合物产生菌的筛选n 药药理理活活性性化化合合物物是是指指能能抑抑制制人人类类代代谢谢中中某某一一个个关关键键酶酶的的微微生生物物产产物物即即酶酶抑抑制制剂剂，从从而而达达到到治疗的目的。治疗的目的。n 筛选模型：目标酶筛选模型：目标酶生长因子产生菌的筛选生长因子产生菌的筛选n筛选模型：营养缺陷型试验菌筛选模型：营养缺陷型试验菌 n筛筛选选方方法法：利利用用被被分分离离的的微微生生物物产产物物能能否否促促进进营养缺陷型试验菌生长营养缺陷型试验菌生长氨基酸产生菌的筛选氨基酸产生菌的筛选 样品样品 预处理预处理 初筛（除真菌）初筛（除真菌）在分离平板上生长获得多个单菌落在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（复印平板（copy法）法）平板培养，其中有产生氨基酸平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸的菌落分泌氨基酸 对应到对应到copy前相应前相应u.v线杀死长好的菌落线杀死长好的菌落位置，找到目的菌落位置，找到目的菌落再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后培养后 产氨基酸菌落周围有生长圈产氨基酸菌落周围有生长圈 目的菌落进行液体培养，目的菌落进行液体培养，对产物进行定量测定对产物进行定量测定筛选产物含量高的菌株筛选产物含量高的菌株多糖产生菌的筛选多糖产生菌的筛选n取样特点：碳水化合物工业的废弃物取样特点：碳水化合物工业的废弃物n筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。筛选高产菌。细菌分离：以乳酸菌为例细菌分离：以乳酸菌为例 取未成熟的酱醪样品取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中至无菌磨口瓶中加麦芽汁至瓶口处，封塞，加麦芽汁至瓶口处，封塞，25培养培养24-48h培养基中长出绢丝状波动物，镜检培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌初步断定乳酸菌 用选择性培养基分批富集培养用选择性培养基分批富集培养2-3代代稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基的琼脂培养基 根据透明圈挑选菌落根据透明圈挑选菌落 性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定）Rf值定性值定性 （有机酸呈黄斑点）（有机酸呈黄斑点）乳酸生成量测定（滴定法）乳酸生成量测定（滴定法）放线菌的分离：放线菌的分离：以产链霉素菌种的分离为例以产链霉素菌种的分离为例（从退化菌种中筛选）（从退化菌种中筛选）取工业发酵液（含孢子）样品取工业发酵液（含孢子）样品1 1环环放入带玻璃珠的装有放入带玻璃珠的装有10ml无菌水的小三角瓶中，摇匀无菌水的小三角瓶中，摇匀采用稀释法制平板，获取单菌落采用稀释法制平板，获取单菌落 斜面保藏斜面保藏 高产菌恢复高产菌恢复根据高产菌的特点，选择目的菌落根据高产菌的特点，选择目的菌落 放大培养，发酵液性能测试放大培养，发酵液性能测试筛选模型：形态依据筛选模型：形态依据真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例 取发酵液少许以取发酵液少许以10倍稀释成倍稀释成10-1-10-7稀释分离法稀释分离法取取0.1ml加入固体培养基铺平皿（加入固体培养基铺平皿（2）在麦芽汁固体培养基上，在麦芽汁固体培养基上，25培养培养48-72h 形态筛选形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用 纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次 生生成成子子囊囊孢孢子子速速度度测测定定 发酵力测定发酵力测定 性能测定性能测定 热死温度测定热死温度测定 凝集力测定凝集力测定 双乙酰含量测定双乙酰含量测定2.3 发酵工业菌种的鉴定发酵工业菌种的鉴定（自学自学）n鉴定工作鉴定工作主要包括：测定一系列必要的鉴定指标；查找权威性鉴定手册，确定菌种类型。n鉴定微生物的技术鉴定微生物的技术（四个水平）：细胞的形态和习性水平；细胞组分水平；蛋白质水平；基因或核酸水平。n经典的分类鉴定方法经典的分类鉴定方法n现代分类鉴定方法现代分类鉴定方法菌种选育改良的具体目标：菌种选育改良的具体目标：n提高目标产物的产量提高目标产物的产量 n提高目标产物的纯度，减少副产物提高目标产物的纯度，减少副产物 n改良菌种性状，改善发酵过程改良菌种性状，改善发酵过程 n改变生物合成途径，以获得高产的新产品改变生物合成途径，以获得高产的新产品 2.4 发酵工业菌种改良发酵工业菌种改良发酵工业菌种改良方法发酵工业菌种改良方法n常规育种常规育种(诱变育种诱变育种)n细胞工程育种细胞工程育种 n基于代谢调节的育种技术基于代谢调节的育种技术 n基因工程育种基因工程育种 n蛋白质工程育种蛋白质工程育种 n代谢工程育种代谢工程育种2.4 发酵工业菌种改良发酵工业菌种改良 代谢工程的定义代谢工程的定义n利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基进行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现因调控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展构建新的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一个新的学科领域。起来的一个新的学科领域。n又称作途径工程，是多基因的基因工程。又称作途径工程，是多基因的基因工程。代谢工程育种思路代谢工程育种思路（1 1）改变代谢流改变代谢流：改变分支代谢途径的流向，改变分支代谢途径的流向，阻断有害代谢产物的合成。阻断有害代谢产物的合成。a 加速限速反应加速限速反应b 改变分支代谢途径流向：改变分支代谢途径流向：提高代谢分支点的某提高代谢分支点的某一分支代谢途径酶系的活力，在与另外的分支一分支代谢途径酶系的活力，在与另外的分支代谢途径的竞争中占有优势，可以提高目的代代谢途径的竞争中占有优势，可以提高目的代谢末端产物的产量。谢末端产物的产量。c 构建代谢旁路构建代谢旁路d 改变能量代谢途径改变能量代谢途径 代谢工程育种思路代谢工程育种思路(2)扩展代谢途径扩展代谢途径a在在引引入入外外源源基基因因后后，使使原原来来的的代代谢谢途途径径向向后延伸，产生新的末端代谢产物。后延伸，产生新的末端代谢产物。b使使原原来来的的代代谢谢途途径径向向前前延延伸伸，可可以以利利用用新新的原料生物合成代谢末端产物。的原料生物合成代谢末端产物。代谢工程育种思路代谢工程育种思路(3)转移或构建新的代谢途径转移或构建新的代谢途径1)转转移移代代谢谢途途径径:为为生生产产某某一一新新的的化化学学结结构构的的代代谢谢产产物物，将将催催化化某某一一代代谢谢途途径径的的基基因因组组克克隆隆到到另另一一不不具具备备该该种种能能力力的的微微生生物物中中，达达到到代代谢谢途途径径转转移移的目的，使之具备生产该种新化合物的能力。的目的，使之具备生产该种新化合物的能力。2)构构建建新新的的代代谢谢途途径径:利利用用基基因因工工程程手手段段，通通过过克克隆隆少少数数基基因因将将原原来来细细胞胞中中无无关关的的两两条条代代谢谢途途径径桥桥连在一起，形成新的代谢途径。连在一起，形成新的代谢途径。本章内容本章内容2.1 发酵工业菌种发酵工业菌种 2.2 发酵发酵工业工业菌种筛选的原则与基本技术菌种筛选的原则与基本技术2.3 发酵工业菌种鉴定发酵工业菌种鉴定2.4 发酵发酵工业工业菌种改良菌种改良2.5 菌种保藏、复壮与扩培菌种保藏、复壮与扩培一、菌种保藏的意义一、菌种保藏的意义菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。2.5 发酵工业菌种保藏、复壮与扩培发酵工业菌种保藏、复壮与扩培二、菌种保藏的原理二、菌种保藏的原理菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。菌种保藏的方法很多，一般有下面几种一般有下面几种：A斜面冰箱保藏法（酵母）斜面冰箱保藏法（酵母）斜斜面面保保藏藏是是一一种种短短期期、过过渡渡的的保保藏藏方方法法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4冰冰箱箱保保存存。一一般般保保存存期期为为三三个个月到六个月月到六个月。B 石蜡油封存法（酵母）石蜡油封存法（酵母）向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面高出斜面一厘米一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。保存期约一年左右。三、菌种保藏的方法三、菌种保藏的方法C 沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌）这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽孢产孢子或芽孢的微生物。它的制备方法制备方法是：首先，将沙与土洗洗净净烘烘干干过过筛筛后，按按沙沙与与土土的的比比例例为为l2 l混混合合均均匀匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘厘米米左左右右，121C间间歇歇灭灭菌菌三三次次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙沙用用80目目过过筛筛，土土用用30100目目过过筛筛。其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直直接接与与沙沙土土混混合合，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期为保存期为1年左右年左右。D真空冷冻干燥保藏法（真空冷冻干燥保藏法（细菌，防线菌）真空冷冻干燥保藏法真空冷冻干燥保藏法是目前常用的较理想的一种方法。其基本基本原理原理是在较低的温度下（15），快速她将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。因此，菌种可以保存很长时间，一般一般5年左右年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外都已较普遍地应用。这种方法的基本操作基本操作过程是先将微生物制成悬浮液制成悬浮液，再与保护与保护剂混合剂混合，然后放在特制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在低温下用真空泵抽干低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封，并低温保藏。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型型，防此细胞膜因为冻结而破坏防此细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用支持作用，使微生物疏松地固定在上面。E液氮超低温保藏法（液氮超低温保藏法（细菌，真菌）细菌，真菌）液氮超低温保臧法足近几年才发展起来的，此法国外已较普遍采用，是是适适用用范范围围最最广广的的微微生生物物保保藏藏法法。尤其是一些不不产产孢孢子子的的菌菌丝丝体体，用其它保藏方法不理想，可用液液氮氮保保藏藏法法。其保存期最长。a原理原理用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达一一196，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（一新陈代谢作用停止的温度（一130），所以此时菌种的代谢活动已停止代谢活动已停止，化学作用亦随之消失化学作用亦随之消失。b操作方法及步骤操作方法及步骤（1）安安瓿瓿管管要要求求由于液氮保存于超低温状态，所使用的安安瓿瓿管管需需能能承承受受大大的的温温差差而而不不致致于于破破裂裂，一般用95料料或或GCl7的的玻玻璃璃管管，安瓿管选好后印上标记印上标记，加棉塞后灭菌，烘干后备用加棉塞后灭菌，烘干后备用。（2）菌种准备及分装菌种准备及分装因为液氮法菌种要经受超低温的冷冻过超低温的冷冻过程程。所以也需要保护剂保护剂，常用的保护剂为保护剂为10甘油甘油。用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓶管中，一般安瓿管的装量为0.21mL。（3）冻冻结结液氮法的关关键键是先先把把微微生生物物从从常常温温过过渡渡到到低低温温。这样在细胞接接触触低温前低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。美国ATCC采用先先将将菌菌液液降降温温到到0，再以每每分分钟钟降降低低1的的速速度度，一一直直降降低低到到38，然后才把装有菌液的安瓿管放入液液氮氮罐罐的的气气相相中中。由于液氮要蒸发，这样温度就会上升，冰冰晶晶状状态态发发生生变变化化，从而导致菌种死亡。所以要常常注意液氮的残存量，定期补加常常注意液氮的残存量，定期补加。（4）重新培养）重新培养当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出，室温或室温或3540水浴中迅速解冻水浴中迅速解冻，当升温至升温至0时即可打开安瓿管时即可打开安瓿管，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。我国国内目前已有部分单位采用液氮法保存菌种部分单位采用液氮法保存菌种。四、菌种的衰退与复壮四、菌种的衰退与复壮（1）菌种衰退菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。n菌种退化的原因基因突变；变异菌株性状分离；n诱变的单菌落是由个以上孢子或细胞形成n菌落由个孢子或单个细胞形成，但它是多核细胞n单核孢子发生突变时，双链DNA上仅条链上某个位点发生变化连续传代其它因素n菌种保藏不当n生长条件不满足（培养基组成、培养条件）n防止菌种退化的措施n控制传代次数n选择合适的培养条件n选择合适的保藏方法n菌种稳定性检查n分离复壮（2）菌种复壮使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性。n复壮措施：n对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化n淘汰衰退的个体n选择合适的培养基68五、五、菌种的扩培菌种的扩培n扩培概述n定义、种子概念、必要性、质量要求n种子制备工艺n影响种子质量因素n控制措施n常见的几种菌种扩培工艺69扩培概述扩培概述 1n扩培定义：菌种的扩大培养是指将长期保藏的菌种（如沙土管、冷冻干燥管菌种），从休眠状态激活到活化斜面，再经三角瓶、种子罐等逐级扩大培养，获得一定数目和质量纯种的过程。n扩大培养所得纯种培养物称为种子70扩培概述扩培概述 2 必要、重要必要、重要n必要性：现代发酵体积庞大，而需要短时间内完成，必须要求体系中有足够的菌体的细胞（即原料到产物的小加工厂），这就必须要进行菌种的扩大培养n重要性：扩大培养质量的好坏直接影响发酵过程的结果n方 法：扩大培养过程随发酵的种类和菌种的特性而不同。71扩培概述扩培概述3 种子质量要求种子质量要求A种子中菌体细胞的生长活力要强，移种到发酵罐后能迅速生长，迟缓期短，可缩短周期。B菌种的生理状态稳定C种子中菌体的总量及浓度能满足大容量发酵罐生长的要求。D无杂菌污染或噬菌体污染E种子中菌体的生产能力稳定72（1）种子制备工艺种子制备工艺 n实验室扩培阶段n生产车间扩培阶段n注意：种子罐级数、种龄、接种量n种子质量判断73（a）实验室扩培阶段）实验室扩培阶段n生长速度n产孢性能n厌氧菌保藏斜面生产斜面大型斜面三角摇瓶培养瓶种子瓶车间种74（b）生产车间阶段）生产车间阶段种子罐营养注意点：(优缺点)n种子罐级数、种龄、接种量接种操作n压差法种子质量判断n原料参数pH、糖、ANn菌体状态形态、浓度、外观n产物参数产物、酶活等实验室菌种发芽罐繁殖罐发酵罐生长罐种子罐75(2)影响种子质量的因素影响种子质量的因素n原材料的质量产地、品种、加工方法；无机离子n培养条件生理状态T、湿度、通气量n成熟度斜面冷藏时间76(3)种子质量的控制措施种子质量的控制措施总要求：在保证菌种稳定的基础上,提供适宜的环境条件,无杂菌、噬菌体n稳定性检查：经常进行分离纯化，防止衰退n无杂菌检查：步步跟踪n种子活力检查：控制相关参数(耗氧速度等)种子分析项目：营养消耗速度、pH变化及速率、溶解氧利用、种子外观77酿酒酵母扩培酿酒酵母扩培 以啤酒为例卡氏罐汉森罐发酵罐酒母罐种子罐保藏斜面生产斜面三角瓶(种子瓶)78细菌扩培细菌扩培 以谷氨酸为例保藏斜面生产斜面大型斜面三角摇瓶种子瓶发酵罐种子罐79食用、药用真菌扩培食用、药用真菌扩培 以香菇、灵芝为例保藏斜面生产斜面(原种)大型斜面三角摇瓶种子瓶(麦粒种)栽培(发酵罐)栽培种(种子罐)80放线菌扩培放线菌扩培 以链霉素发酵为例发芽罐繁殖罐发酵罐生长罐种子罐保藏斜面生产斜面孢子斜面孢子培养瓶孢子培养液本章小结本章小结n掌握微生物分离筛选的基本概念、基本原理与掌握微生物分离筛选的基本概念、基本原理与基本技术基本技术n了解发酵工业菌种的鉴定方法了解发酵工业菌种的鉴定方法n了解菌种改良的基本技术与方法了解菌种改良的基本技术与方法n掌握发酵工业菌种的保藏、复壮与扩培掌握发酵工业菌种的保藏、复壮与扩培