DB15∕T 1648-2019 蒙桑组织培养育苗技术规程(内蒙古自治区).pdf

ICS 65.020.20 B 05 DB15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 16482019 蒙桑组织培养育苗技术规程 Tissue culture technical regulation of Morus mongolica 2019-05-20 发布 2019-08-20 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 16482019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 环境及器具灭菌 . 1 5 培养基配制 . 2 6 外植体选取及灭菌 . 3 7 初代培养 . 4 8 继代培养 . 4 9 生根培养 . 4 10 炼苗与培养 . 5 11 病虫害防治 . 6 附录 A（资料性附录） MS 培养基母液配制表 . 7 DB15/T 16482019 II 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本标准起草单位：内蒙古和盛生态科技研究院有限公司、内蒙古农业大学、内蒙古和盛生态育林有限公司、北京蒙树生态环境工程有限公司。 本标准主要起草人：赵泉胜、铁英、白玉娥、彭鹏、刘洋、田菊。 DB15/T 16482019 1 蒙桑组织培养育苗技术规程 1 范围 本标准规定了蒙桑（Morus mongolica）组织培养育苗的术语和定义、环境及器具灭菌、培养基配制、外植体选取及灭菌、初代培养、继代培养、生根培养、炼苗与培养、病虫害防治等基本内容及技术要求。 本标准适用于利用蒙桑组织培养技术生产苗木。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 LY/T 1882-2010 林木组织培养育苗技术规程 3 术语和定义 LY/T 1882-2010界定的术语和定义适用于本文件。 4 环境及器具灭菌 4.1 准备室消毒灭菌 经常用消毒液消毒，保持室内清洁。 4.2 接种室消毒灭菌 保持室内清洁。接种前用紫外灯照射30 min40 min，关闭紫外灯20 min后方可进入。 4.3 培养室消毒灭菌 经常用消毒液对地面、组培架等设施进行消毒。 4.4 超净工作台消毒灭菌 接种前应用紫外灯照射30 min40 min，打开无菌风吹40 min以上；然后用70%酒精棉擦拭台面。定期清洗超净工作台的过滤膜，具体方法：摘下滤膜，使用流水冲洗干净，晾干，安装，紫外灯照射灭菌。 4.5 器具消毒灭菌 DB15/T 16482019 2 4.5.1 接种器具消毒灭菌 接种前，将接种工具用滤纸包好，置于高压灭菌锅灭菌，要求温度121 、时间30 min。使用前用酒精灯外焰灼烧20 s以上，或用接种工具灭菌器直接灭菌。 4.5.2 污染瓶消毒灭菌 用高压灭菌锅消毒，然后再用自来水清洗培养瓶。 5 培养基配制 5.1 基本培养基选择 选择MS培养基为基本培养基。 5.2 母液配制和保存 5.2.1 母液的配制 MS培养基母液配制成几种化合物的混合母液，A液配制成20倍母液，B、C液配制成100倍母液，D液配制成200倍母液，E液配制成50倍母液，具体参数参见附录A。 植物生长调节物质配制浓度为1.0 mg/mL。 5.2.2 母液的保存 母液配制好后，贴上标签，注明溶液名称、配制时间、配制者，置于4 冰箱存放。每瓶试剂使用前应目测无结晶、无异色才能使用。 5.3 培养基制备 5.3.1 准备 根据培养基成分准备好蒸馏水、蔗糖、琼脂和各类母液等试剂药品，烧杯、容量瓶、移液枪、量筒、天平、药匙、磁力搅拌器、pH计等器具。 5.3.2 琼脂融化 先加蒸馏水700 mL/L左右，再加入5.5 g/L6.0 g/L琼脂，加热搅拌使琼脂融化。 5.3.3 糖溶解 琼脂融化后，初代和生根培养基加蔗糖20 g/L，继代培养基加30 g/L蔗糖，搅拌使糖溶解。 5.3.4 加母液 配制初代和继代培养基时， 用量筒取A液母液、 B液母液、 C液母液、 D液母液、 E液母液分别为50 ml/L、10 ml/L、5 ml/L、5 ml/L、10 ml/L，混合均匀备用。 配制生根培养基时，A液母液、B液母液、C液母液、D液母液、E液母液分别为25 ml/L、10 ml/L、5 ml/L、5 ml/L、10 ml/L，混合均匀备用。 初代培养基母液混合液中添加 IBA 0.5 mg /L和 6-BA 1.0 mg /L。 增殖继代培养基母液混合液中添加 IBA 0.5 mg /L和 GA3 0.5 mg /L。 生根培养基母液混合液中添加 IBA 0.3 mg /L。 DB15/T 16482019 3 5.3.5 定容 搅拌均匀后，加蒸馏水定容。 5.3.6 pH 值测定和调节 充分搅拌后，用pH计测定pH值，用1 mol/L的HCl溶液或1 mol/L的NaOH溶液调节至pH 5.86.0。 5.3.7 分装 使用240 ml规格的培养瓶定量分装，每瓶分装约50 ml；生根使用350 ml规格的培养瓶，每瓶分装约65 ml。 5.3.8 封口 盖紧瓶盖，或用封口膜封口。 5.3.9 灭菌 用高压灭菌锅灭菌，温度121 ，保持20 min30 min。 5.3.10 冷却 灭菌后的培养基放在室内冷却，待完全凝固后使用。 5.3.11 贮存 灭菌后的培养基应注明编号。在4 无菌条件下贮藏备用，贮存时间不应超过一个月。 6 外植体选取及灭菌 6.1 外植体采集 在树龄不超过20年的树冠上，选择无病虫害、生长健壮的中上部枝条，7月至次年3月，采集半木质化枝条或一年生枝作外植体。 6.2 外植体灭菌 6.2.1 表面清洗 将采集的外植体去掉叶片，用洗洁精或洗衣粉水全面刷洗表面，剪刀剪成带24个芽的小段，放入带口容器中，用一层纱布包裹容器口，自来水流水冲洗30 min，倒掉容器中自来水，在容器表面快速喷少量75%酒精，放在超净工作台中备用。 6.2.2 酒精和升汞灭菌 处理好的茎段用75%酒精浸泡40 s，无菌水冲洗3次，再用1%升汞浸泡15 min，用无菌水漂洗至少5次，用灭菌滤纸吸干残留水分。 6.3 外植体制备 在超净工作台内，将灭菌好茎段用灭菌后的手术刀和镊子小心剥取休眠芽中约0.3 cm0.5 cm的芽尖。 DB15/T 16482019 4 7 初代培养 7.1 初代培养基 初代培养选用MS + IBA 0.5 mg /L +6-BA 1.0 mg /L。 7.2 初代接种 在超净工作台内， 在酒精灯前打开瓶盖， 用枪形镊子夹取剥好的芽尖接种于预先准备好的初代培养基上，每瓶培养基均匀接种3个外植体，芽尖基部插入培养基内约1 mm左右，芽露出，接种后将瓶口迅速置于酒精灯火焰上灼烧2 s，盖紧瓶盖；注明编号。 7.3 培养方法 将接种完毕进行初代培养的培养瓶送到培养室，摆放在指定的组培架上。 7.4 培养环境 培养室温度在25 2 ，相对湿度70 80 ，光照强度1500 lx2000 lx，光照时间12 h/d。 7.5 培养期 初代培养期为20 d，此时芽尖长到3 cm5 cm。 8 继代培养 8.1 继代培养基 增殖继代培养选用1/2 MS + IBA 0.5 mg /L +GA3 0.5 mg /L。 8.2 继代转接 在超净工作台内，将初代培养萌发的芽尖切去老叶、基部愈伤等组织，留下2 cm3 cm的芽苗，接种于继代培养基中，使茎段下部插入培养基内，芽露出，接种后将瓶口迅速置于酒精灯火焰上灼烧2 s，拧紧瓶盖。每瓶培养基均接种3个芽苗。注明编号。 8.3 培养方法 将接种完毕进行继代培养的培养瓶送到培养室，摆放在指定的组培架上。 8.4 培养环境 培养室温度25 2 ，相对湿度7080，光照强度2000 lx3000 lx，光照时间16 h/d。 8.5 培养期 继代培养期为30 d。 9 生根培养 DB15/T 16482019 5 9.1 生根培养基 生根培养基选用1/2MS + IBA 0.3 mg /L。 9.2 生根转接 当继代增殖培养不定芽高达2.0 cm3.0 cm 时，从中剪取生长健壮、叶片舒展、叶色正常、大小相近的不定芽接种在生根培养基上进行生根培养，每个培养瓶均匀接种810株不定芽。不定芽在培养基中的插入深度为3.0 mm5.0 mm，芽露出，保持直立，盖紧瓶盖，注明编号。 9.3 培养方法 将接种完毕进行生根培养的培养瓶送到培养室，置于组培架上。 9.4 培养环境 培养室温度25 2 ；相对湿度7080；光照强度1500 lx2000 lx；光照时间为14 h/d。 9.5 培养期 生根培养期为20 d40 d。 10 炼苗与培养 10.1 瓶苗炼苗 不定芽生根培养后，选择有35片正常绿叶、苗高5 cm6 cm的组培瓶苗，于出瓶前2周左右置于环境温度25 2 ，光照强度1500 lx2000 lx的温室苗床上进行过渡锻炼。出瓶前1周，将瓶口盖子逐步打开进行开瓶锻炼，即首先松盖1 d2 d，然后部分开盖1 d2 d，最后完全揭去盖，让瓶苗逐步适应外界的光照和湿度。 10.2 温室穴盘炼苗 10.2.1 基质 采用体积比为草炭蛭石珍珠岩=321的混合基质。用多菌灵800倍液浸湿基质，用薄膜覆盖灭菌24 h后使用。 10.2.2 穴盘栽植 选用孔径8 cm、深度8 cm塑料穴盘进行移栽。用灭菌后的基质填充穴盘容器到饱满位置后，用刮板刮去多余基质，喷淋清水保湿待用。将培养瓶中的幼苗连同培养基一起从培养瓶中取出，用常温清水洗去残留培养基，勿损坏幼苗根部，切忌用力过重造成伤口而损伤幼苗。将清洗完毕的幼苗植入穴盘盘孔基质居中位置， 保持幼苗根系舒展， 扶正茎叶， 轻压幼苗周边基质。 将植满幼苗的穴盘置于温室苗床上，常温清水饱和喷淋一次。 10.2.3 温湿度管理 每天喷雾，使环境湿度保持在8090之间，昼夜温度在20 25 之间。用薄膜覆盖保持湿度，用6针遮阴网遮阴1周后，去掉遮阴网，逐步揭开薄膜，适度通风，逐渐降低湿度。 10.3 容器培育 DB15/T 16482019 6 10.3.1 容器移栽 经过1月左右的炼苗，当苗木表现为叶色深绿、叶片增大、有新叶长出，且形成根团时，将穴盘中的幼苗连同基质一起移栽到相同基质的直径18 cm、深度20 cm的无纺布容器袋中，置于温室苗床继续培养。 10.3.2 水肥管理 移栽后先在遮阴且通风良好的条件下培养4 d5 d，每天向叶面喷水12次，1周后逐渐撤掉遮阴。每隔20 d向苗木喷施0.2 %0.3 %的尿素1次，用量为3 g/m25 g/m2。 10.4 大田培育 春季将容器苗放置在室外遮阴棚内过渡12周，遮阴棚使用透光率为80%的遮阴网。然后移入大田培养。 11 病虫害防治 11.1 炼苗期 移栽后每隔 5 d7 d喷施1次800倍液多菌灵或代森锰锌或甲基托布津等灭菌剂。对于温室，使用前要进行1次彻底的消毒灭菌，用百菌清烟雾剂熏蒸34次。 11.2 容器培育期 危害蒙桑苗木的害虫为根结线虫，苗木种植前采用呋喃丹30倍液浸根30 min。大田采用每30天喷施3%克线磷按照6 g/m29 g/m2预防，或2%阿维菌素40006000倍液沿着苗木基部灌根。若苗木感染根结线虫，及时拔除有虫株。 褐斑病和白粉病，用50%的多菌灵可湿性粉剂800倍液喷施，每半月喷施1次，连续23次；桑疫病用15%农用链霉素500倍液每7 d喷一次，连续23次。 DB15/T 16482019 7 A A 附 录 A （资料性附录） MS 培养基母液配制表 表A.1 MS 培养基母液配制表 母液名称 编号 化试名称 浓度 mg/L 扩大倍数 扩大后称量 mg 母液定容体积mL 配制培养基吸取量 mL/L 大量元素 A NH4NO3 1650 20 33000 1000 50 KNO3 1900 20 38000 CaCl22H2O 440 20 8800 MgSO47H2O 370 20 7400 KH2PO4 170 20 3400 铁盐 B FeSO47H2O 27.8 100 2780 1000 10 Na2EDTA2H2O 37.3 100 3730 微量元素 C MnSO44H2O 22.3 100 2230 500 5 ZnSO47H2O 8.6 100 860 H3BO3 6.2 100 620 KI 0.83 100 83 Na2MoO42H2O 0.25 100 25 CuSO45H2O 0.025 100 2.5 CoCl26H2O 0.025 100 2.5 有机成分 D 甘氨酸 2 200 400 1000 5 盐酸硫胺素 B1 0.1 200 20 盐酸吡哆酸 B6 0.5 200 100 烟酸 0.5 200 100 E 肌醇 100 50 5000 500 10 _