硅胶柱层析技术.pptx

硅胶柱层析技术 常说得过柱子应该叫柱层析分常说得过柱子应该叫柱层析分离离,也叫柱色谱。我们常用得就是也叫柱色谱。我们常用得就是以硅胶或氧化铝作固定相得吸附柱。以硅胶或氧化铝作固定相得吸附柱。其实硅胶柱层析技术也可以称其实硅胶柱层析技术也可以称作硅胶吸附柱色谱技术作硅胶吸附柱色谱技术色谱法色谱法,又称层析法。就是一种以分配平衡为机理又称层析法。就是一种以分配平衡为机理得分配方法。色谱体系包含两个相得分配方法。色谱体系包含两个相,一个就是固定一个就是固定相相,一个就是流动相。当两相相对运动时一个就是流动相。当两相相对运动时,反复多反复多次得利用混合物中所含各组分分配平衡性质得差次得利用混合物中所含各组分分配平衡性质得差异异,最后达到彼此分离得目得。最后达到彼此分离得目得。色谱法按固定相得状态可分为柱色谱、平板色谱色谱法按固定相得状态可分为柱色谱、平板色谱和棒色谱三种和棒色谱三种,而实验室中最常用得就是柱层析和而实验室中最常用得就是柱层析和薄层层析薄层层析,以及她们之间得配合应用。以及她们之间得配合应用。柱层析1、吸附色谱得原理、吸附色谱得原理 在一定条件下在一定条件下,硅胶与被分离物质之间产生作用硅胶与被分离物质之间产生作用,这种作用主要就是物这种作用主要就是物理和化学作用两种。物理作用来自于硅胶表表面与溶质分子之间得范理和化学作用两种。物理作用来自于硅胶表表面与溶质分子之间得范德华力德华力;化学作用主要就是硅胶表面得硅羟基与待分离物质之间得氢化学作用主要就是硅胶表面得硅羟基与待分离物质之间得氢键作用。键作用。2、操作步骤、操作步骤2、1 硅胶准备硅胶准备 硅胶一般选用硅胶一般选用250-400目目(即即40-63m直径得硅胶颗粒直径得硅胶颗粒),根据根据Rf选用选用硅胶得用量。硅胶得用量。2、2 实验仪器准备实验仪器准备 一支玻璃色谱柱一支玻璃色谱柱,一个铁架台一个铁架台,烧杯烧杯,锥形瓶锥形瓶,径口直径较大得玻璃漏斗径口直径较大得玻璃漏斗,一支玻璃棒一支玻璃棒,等。等。2、3 装柱装柱2、3、1 吸附剂得加入吸附剂得加入干法干法:将吸附剂一次加入色谱管将吸附剂一次加入色谱管,振动管壁使其均匀下沉振动管壁使其均匀下沉,然后沿管壁然后沿管壁缓缓加入开始层析时使用得流动相缓缓加入开始层析时使用得流动相,或将色谱管下端出口加活塞或将色谱管下端出口加活塞,加入加入适量得流动相适量得流动相,旋开活塞使流动相缓缓滴出旋开活塞使流动相缓缓滴出,然后自管顶缓缓加入吸附然后自管顶缓缓加入吸附剂剂,使其均匀地润湿下沉使其均匀地润湿下沉,在管内形成松紧适度得吸附层。操作过程中在管内形成松紧适度得吸附层。操作过程中应保持有充分得流动相留在吸附层得上面。应保持有充分得流动相留在吸附层得上面。湿法湿法:将吸附剂与流动相混合将吸附剂与流动相混合,搅拌以除去空气泡搅拌以除去空气泡,徐徐倾入色谱管中徐徐倾入色谱管中,然后再加入流动相然后再加入流动相,将附着于管壁得吸附剂洗下将附着于管壁得吸附剂洗下,使色谱柱表面平整。使色谱柱表面平整。俟填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下俟填装吸附剂所用流动相从色谱柱自然流下,液面将与柱表面相平时液面将与柱表面相平时,即加试样溶液。即加试样溶液。2、3、2试样得加入试样得加入 将试样溶于层析时使用得流动相中将试样溶于层析时使用得流动相中,再沿色谱管壁缓缓加入。注意勿再沿色谱管壁缓缓加入。注意勿使吸附剂翻起。使吸附剂翻起。或将试样溶于适当得溶剂中或将试样溶于适当得溶剂中,与少量吸附剂混匀与少量吸附剂混匀,再使溶剂挥发去尽后再使溶剂挥发去尽后使呈松散状使呈松散状;将混有试样得吸附剂加在已制备好得色谱柱上面。如试将混有试样得吸附剂加在已制备好得色谱柱上面。如试样在常用溶剂中不溶解样在常用溶剂中不溶解,可将试样与适量得吸附剂在乳钵中研磨混匀可将试样与适量得吸附剂在乳钵中研磨混匀后加入。后加入。2、4洗脱洗脱 除另有规定外除另有规定外,通常按流动相洗脱能力大小通常按流动相洗脱能力大小,递增变换流动相得品种和递增变换流动相得品种和比例比例,分别分部收集流出液分别分部收集流出液,至流出液中所含成分显著减少或不再含有至流出液中所含成分显著减少或不再含有时时,再改变流动相得品种和比例。操作过程中应保持有充分得流动相再改变流动相得品种和比例。操作过程中应保持有充分得流动相留在吸附层得上面。留在吸附层得上面。2、5 检测检测2、5、1 初步检测初步检测 当冲洗溶剂流出一定量后当冲洗溶剂流出一定量后,可对流出液进行初步检测可对流出液进行初步检测,并且将锥形瓶更并且将锥形瓶更换成小试管进行收集。一般只进行初步得快捷检测换成小试管进行收集。一般只进行初步得快捷检测,因此通常就是取因此通常就是取一小薄层板一小薄层板,用铅笔和直尺将硅胶板分划成多个小方块用铅笔和直尺将硅胶板分划成多个小方块,并按一定得次并按一定得次序编号。取一根内径为序编号。取一根内径为0、3mm左右得玻璃毛细管蘸取少量流出液左右得玻璃毛细管蘸取少量流出液,点于薄层板得一个小格内点于薄层板得一个小格内,待半点干后待半点干后,然后用物理得或化学得方法检然后用物理得或化学得方法检测。测。2、5、2 正式检测正式检测点样点样:取分部收集得冲洗溶液进行分别直接点样取分部收集得冲洗溶液进行分别直接点样,如果冲洗溶液太稀如果冲洗溶液太稀,浓浓度太小度太小,可先浓缩可先浓缩、点样得容器一般用玻璃毛细管点样得容器一般用玻璃毛细管,点样斑点得直径一点样斑点得直径一般为般为3-5mm、展开展开:在普通得展开槽中进行在普通得展开槽中进行,展开方式常选用上行展开展开方式常选用上行展开、展开剂展开剂:使用冲洗溶液使用冲洗溶液、显色显色:一般常用物理检测法和化学检测法一般常用物理检测法和化学检测法、物理检测法中首先有紫外光物理检测法中首先有紫外光法法,紫外光常用两种波长紫外光常用两种波长(254nm与与365nm)、其次就是碘蒸气显色法其次就是碘蒸气显色法、化学检出法通常惊醒显色剂直接喷雾化学检出法通常惊醒显色剂直接喷雾、显色剂有通用显色剂和专用显显色剂有通用显色剂和专用显色剂色剂、通用显色剂最常见得就是硫酸通用显色剂最常见得就是硫酸-乙醇或甲醇乙醇或甲醇(1:1)溶液溶液,喷雾后喷雾后,有有得化合物立即反应得化合物立即反应,但多数化合物需加热后经历数分钟才显色但多数化合物需加热后经历数分钟才显色,不同化不同化合物得反应不同合物得反应不同,所以颜色也往往不同所以颜色也往往不同、专用显色剂就是指对某个或某专用显色剂就是指对某个或某一类化合物显色得试剂一类化合物显色得试剂,利用化合物本身得特有性质利用化合物本身得特有性质,或利用其所含得或利用其所含得某些官能团得特殊反应某些官能团得特殊反应、展开后根据斑点得展开后根据斑点得,可以粗略得估计待分离物可以粗略得估计待分离物得含量得大小得含量得大小、2、6 合并合并 根据上面薄层检测得结果根据上面薄层检测得结果,我们可以将具有相同我们可以将具有相同Rf值得部分进行合并值得部分进行合并,然后利用旋转蒸发器对合并部分进行旋转蒸发然后利用旋转蒸发器对合并部分进行旋转蒸发,最后得到我们需要得目最后得到我们需要得目标产物标产物、2、7色谱柱得洗涤色谱柱得洗涤 在绝大多数情况下在绝大多数情况下,硅胶分离柱中得硅胶就是一次性使用硅胶分离柱中得硅胶就是一次性使用,但在使用后但在使用后得色谱柱中由于还含有冲洗溶剂得色谱柱中由于还含有冲洗溶剂,所以要将里面得硅胶到出就是比较困所以要将里面得硅胶到出就是比较困难得难得、取出硅胶得一种方法就是将该柱放置一段时间取出硅胶得一种方法就是将该柱放置一段时间,让溶剂自然挥发让溶剂自然挥发完后完后,倒出硅胶倒出硅胶、但这种方法既费时又污染环境但这种方法既费时又污染环境、第二种方法可以用一第二种方法可以用一根比色谱柱稍长得木杆或塑料杆将含有溶剂得硅胶一段一段地掏出根比色谱柱稍长得木杆或塑料杆将含有溶剂得硅胶一段一段地掏出,但但这种办法也比较麻烦这种办法也比较麻烦、第三种方法时利用一个一般地真空泵第三种方法时利用一个一般地真空泵,将柱中将柱中剩余得溶剂进行减压抽出剩余得溶剂进行减压抽出,在色谱柱和真空泵之间加一个冷阱在色谱柱和真空泵之间加一个冷阱,这样抽这样抽出地溶剂既进行了有效地收集而不污染环境出地溶剂既进行了有效地收集而不污染环境,而色谱柱中地硅胶又能较而色谱柱中地硅胶又能较快得到干燥快得到干燥,使硅胶能够方便地倒出使硅胶能够方便地倒出、3、色谱柱得选择、色谱柱得选择 柱子可以分为柱子可以分为:加压加压,常压常压,减压。减压。压力可以增加淋洗剂得流动速度压力可以增加淋洗剂得流动速度,减少产品收集得时间减少产品收集得时间,但就是会减低但就是会减低柱子得塔板数。所以其她条件相同得时候柱子得塔板数。所以其她条件相同得时候,常压柱就是效率最高得常压柱就是效率最高得,但但就是时间也最长就是时间也最长,比如天然化合物得分离比如天然化合物得分离,一个柱子几个月也就是有得。一个柱子几个月也就是有得。减压柱能够减少硅胶得使用量减压柱能够减少硅胶得使用量,感觉能够节省一半甚至更多感觉能够节省一半甚至更多,但就是由但就是由于大量得空气通过硅胶会使溶剂挥发于大量得空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解得东西可能得不到以及有些比较易分解得东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽而且还必须同时使用水泵抽气气(很大得噪音很大得噪音,而且时间长而且时间长)。加压柱就是一种比较好得方法加压柱就是一种比较好得方法,与常压柱类似与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗只不过外加压力使淋洗剂走得快些。压力得提供可以就是压缩空气剂走得快些。压力得提供可以就是压缩空气,双连球或者小气泵双连球或者小气泵(给鱼给鱼缸供气得就行缸供气得就行)。特别就是在容易分解得样品得分离中适用。压力不。特别就是在容易分解得样品得分离中适用。压力不可过大可过大,不然溶剂走得太快就会减低分离效果。不然溶剂走得太快就会减低分离效果。常压柱色谱常压柱色谱,又称柱层析又称柱层析,就是色谱法中最常见得一种。她得突出优点就是色谱法中最常见得一种。她得突出优点就是就是,分离效率比经典得化学分离方法高得多分离效率比经典得化学分离方法高得多,与其她色谱法相比与其她色谱法相比,不不需要昂贵得仪器设备需要昂贵得仪器设备,更换流动相和吸附剂方便更换流动相和吸附剂方便,消耗材料少消耗材料少,成本低成本低,适合分离取样量从克到微克级范围很宽得各种样品适合分离取样量从克到微克级范围很宽得各种样品,因此在化学实验因此在化学实验室中至今仍被广泛应用。室中至今仍被广泛应用。大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静继续保持安静4 溶剂得选择溶剂得选择 溶剂得选择也许就是整个柱色谱分离操作中最困难之处溶剂得选择也许就是整个柱色谱分离操作中最困难之处,也就是实验成也就是实验成功得最关键之处功得最关键之处、溶剂通常先利用简便得硅胶薄层色谱进行筛选溶剂通常先利用简便得硅胶薄层色谱进行筛选、4、1 薄层色谱点样薄层色谱点样 把样品溶解在一种低沸点得有机溶剂中把样品溶解在一种低沸点得有机溶剂中(如氯仿如氯仿,丙酮丙酮、甲醇甲醇、乙醇等乙醇等)然后用毛细管或微量点样管将试液点到薄层板上然后用毛细管或微量点样管将试液点到薄层板上、点样量要适当点样量要适当,一般一般点样量少些点样量少些,则分离叫清晰则分离叫清晰、但要注意到检测灵敏度但要注意到检测灵敏度、4、2 展开展开4、2、1展开剂选择展开剂选择 选择展开剂时选择展开剂时,可采用微量圆环法和小型色谱法进行选择可采用微量圆环法和小型色谱法进行选择、微量圆环法微量圆环法:将欲分离得物质将欲分离得物质,按常规方法点在薄板按常规方法点在薄板,两点相距两点相距2-3cm,再再用毛细管吸取所实验得溶剂系统用毛细管吸取所实验得溶剂系统,垂直放于样点中心垂直放于样点中心,让溶剂自毛细管让溶剂自毛细管中依中立流出进行展开中依中立流出进行展开,干燥后显色干燥后显色、观察斑点得分离情况观察斑点得分离情况、背试物质背试物质为未知化和物时为未知化和物时,常先用低极性溶剂展开常先用低极性溶剂展开,如式样留在圆点不动如式样留在圆点不动,则需增则需增加溶剂得极性或增大洗脱液得量加溶剂得极性或增大洗脱液得量,如移动过快如移动过快,则必须用较低极性得溶则必须用较低极性得溶剂来调整剂来调整、小型色谱法小型色谱法、用普通得载薄片制成薄板用普通得载薄片制成薄板,把欲分离得物质点载薄板上把欲分离得物质点载薄板上,放于小型玻璃缸或广口瓶中展开放于小型玻璃缸或广口瓶中展开,干燥后显色干燥后显色,观察斑点分离情况观察斑点分离情况、4、2、2 展开展开薄层色谱得展开方法有上行法薄层色谱得展开方法有上行法,下行法下行法,双向展开法双向展开法,径向展开法等。径向展开法等。上行法上行法:使展开剂由下向上爬使展开剂由下向上爬、下行法下行法:使展开剂由上向下使展开剂由上向下、该法可使用极性较弱得展开剂该法可使用极性较弱得展开剂、双向展开法双向展开法:取方形薄板像纸色谱一样进行双向展开取方形薄板像纸色谱一样进行双向展开、径向展开法径向展开法:可将吸附剂涂成圆形或扇形可将吸附剂涂成圆形或扇形,在圆心部分加如展开在圆心部分加如展开剂剂,使薄层径向展开使薄层径向展开、多次展开多次展开:用展开剂对薄层展开一次用展开剂对薄层展开一次、称为单次展开称为单次展开、一次展一次展开后开后,取出薄板取出薄板,挥发出去展开剂后再行展开挥发出去展开剂后再行展开、梯度展开梯度展开:该法所用得展开剂在连续不断得改变组成该法所用得展开剂在连续不断得改变组成、一般可一般可把一个装有强极性展开剂得滴定管深入密闭得含弱极性得展开剂得层把一个装有强极性展开剂得滴定管深入密闭得含弱极性得展开剂得层析槽中析槽中,槽中用电磁搅拌器把滴下得强极性展开剂混匀槽中用电磁搅拌器把滴下得强极性展开剂混匀,此时此时,展开剂得展开剂得极性逐渐由弱变强极性逐渐由弱变强,使极性差别较大得多种组分混合物得以很好得分离使极性差别较大得多种组分混合物得以很好得分离、4、3 显色显色 展开后展开后,如物质有色如物质有色,可明显得在薄层上观察到她们得位置可明显得在薄层上观察到她们得位置、如无色如无色,则则要通过一定得方法显色要通过一定得方法显色,定位定位,一边确定斑点得位置及大小一边确定斑点得位置及大小、4、4 常用溶剂得极性常用溶剂得极性 常用溶剂得极性顺序常用溶剂得极性顺序:石油醚石油醚环己烷环己烷/己烷己烷苯苯乙醚乙醚氯仿氯仿乙酸乙酸乙酯乙酯正丁醇正丁醇丙酮丙酮乙醇乙醇甲醇甲醇水。水。在薄层色谱中在薄层色谱中,当溶剂得极性太大时当溶剂得极性太大时、会使待分离物全部接近溶剂会使待分离物全部接近溶剂前沿前沿,当溶剂得极性太小时当溶剂得极性太小时,又会使待分离物几乎全部保留在圆点又会使待分离物几乎全部保留在圆点,这两这两种情况都就是待分离物得不到分离种情况都就是待分离物得不到分离、使用单一溶剂使用单一溶剂,往往不能达到很好得分离效果往往不能达到很好得分离效果,往往使用混合溶剂往往使用混合溶剂通常使用一个高极性和低极性溶剂组成得混合溶剂通常使用一个高极性和低极性溶剂组成得混合溶剂,高极性得溶剂还高极性得溶剂还有增加区分度得作用有增加区分度得作用,常用得溶剂组合有常用得溶剂组合有:Petroleum ether/Ethyl acetate,Petroleum ether/Acetone,Petroleum ether/Ether,Petroleum ether/CH2Cl2,CH2Cl2/ethyl acetate,ethyl acetate/MeOH,CHCl3/ethyl acetate柱层析极性小得用乙酸乙酯极性小得用乙酸乙酯:石油醚系统石油醚系统极性较大得用甲醇极性较大得用甲醇:氯仿系统氯仿系统极性大得用甲醇极性大得用甲醇:水水:正丁醇正丁醇:醋酸系统醋酸系统拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸1、称量 200-300目硅胶,称30-70倍于上样量;如果极难分,也可以用100倍量得硅胶H。干硅胶得视密度在0、4左右,所以要称40g硅胶,用烧杯量100ml也可以。2、搅成匀浆 加入干硅胶体积一倍得溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂就是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系,就用石油醚拌;如果洗脱剂就是氯仿/醇体系,就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆,说明溶剂中含水量太大,尤其就是乙酸乙酯/丙酮,如果不与水配伍走分配色谱得话,必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥,以除去1%得醇。如果样品对酸敏感,不能用氯仿体系过柱。匀浆法3、装柱 将柱底用棉花塞紧,不必用海沙,加入约1/3体积石油醚(氯仿),装上蓄液球,打开柱下活塞,将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降,会有一些硅胶沾在蓄液球内,用石油醚(氯仿)将其冲入柱中。4、压实 沉降完成后,加入更多得石油醚(氯仿),用双联球或气泵加压,直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱,都应进行这一步,可使分离度提高很多,且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。5、上样 干法湿法都可以。海沙就是没必要得。上样后,加入一些洗脱剂,再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂,而不会冲坏硅胶表面。6、过柱和收集 柱层析实际上就是在扩散和分离之间得权衡。太低得洗脱强度并不好,推荐用梯度洗脱。收集得例子:10mg上样量,1g硅胶H,0、5ml收一馏分;1-2g上样量,50g硅胶(200-300目),20-50ml收一馏分。7、检测 要更多地使用专用喷显剂,如果仅用紫外灯,会损失较多产品,紫外得灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。8、送谱 收集得产品旋干,在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体,可过一小凝胶柱,作为送谱前得最后纯化手段。可除去氢谱1、5ppm左右所谓得“硅胶”峰。TIPS:1、先根据先根据TLC方法筛选好洗脱剂方法筛选好洗脱剂,使两相邻物质使两相邻物质Rf值之差最大化值之差最大化2、将柱子必须装平整、均匀将柱子必须装平整、均匀3、考虑有限柱填料得吸附量考虑有限柱填料得吸附量4、可考虑用梯度法分开并洗脱可考虑用梯度法分开并洗脱柱子可以分为:加压,常压,减压。压力可以增加淋洗剂得流动速度压力可以增加淋洗剂得流动速度,减少产品收集得时间减少产品收集得时间,但就是会减低但就是会减低柱子得塔板数。所以其她条件相同得时候柱子得塔板数。所以其她条件相同得时候,常压柱就是效率最高得常压柱就是效率最高得,但但就是时间也最长就是时间也最长,比如天然化合物得分离比如天然化合物得分离,一个柱子几个月也就是有得。一个柱子几个月也就是有得。减压柱能够减少硅胶得使用量减压柱能够减少硅胶得使用量,感觉能够节省一半甚至更多感觉能够节省一半甚至更多,但就是由但就是由于大量得空气通过硅胶会使溶剂挥发于大量得空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结有时在柱子外面有水汽凝结),以及有些比较易分解得东西可能得不到以及有些比较易分解得东西可能得不到,而且还必须同时使用水泵抽而且还必须同时使用水泵抽气气(很大得噪音很大得噪音,而且时间长而且时间长)。加压柱就是一种比较好得方法加压柱就是一种比较好得方法,与常压柱类似与常压柱类似,只不过外加压力使淋洗只不过外加压力使淋洗剂走得快些。压力得提供可以就是压缩空气剂走得快些。压力得提供可以就是压缩空气,双连球或者小气泵双连球或者小气泵(给鱼给鱼缸供气得就行缸供气得就行)。特别就是在容易分解得样品得分离中适用。压力不。特别就是在容易分解得样品得分离中适用。压力不可过大可过大,不然溶剂走得太快就会减低分离效果。不然溶剂走得太快就会减低分离效果。关于无水无氧柱关于无水无氧柱,适用于对氧适用于对氧,水敏感水敏感,易分解得产品。易分解得产品。关于柱子得尺寸柱子长了柱子长了,相应得塔板数就高。柱子粗了相应得塔板数就高。柱子粗了,上样后样品得原点就小上样后样品得原点就小(反反映在柱子上就就是样品层比较薄映在柱子上就就是样品层比较薄),这样相对得减小了分离得难度。试这样相对得减小了分离得难度。试想如果柱子十厘米想如果柱子十厘米,而样品就有二厘米而样品就有二厘米,那么分离得难度可想而知那么分离得难度可想而知,恐恐怕要用很低极性得溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有怕要用很低极性得溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0、5厘米厘米,那么那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大得柱子要牺牲比较各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大得柱子要牺牲比较多得硅胶和溶剂了多得硅胶和溶剂了,不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保得说有些不环保得说,不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。现在见到得柱子径高比一般在现在见到得柱子径高比一般在1:510,书中写硅胶量就是样品量得书中写硅胶量就是样品量得3040倍倍,具体得选择要具体分析。如果所需组分和杂质分得比较开具体得选择要具体分析。如果所需组分和杂质分得比较开(就就是指在所需组分是指在所需组分rf在在0、20、4,杂质相差杂质相差0、1以上以上),就可以少用硅胶就可以少用硅胶,用小柱子用小柱子(例如例如200毫克得样品毫克得样品,用用2cm20cm得柱子得柱子);如果相差不到如果相差不到0、1,就要加大柱子就要加大柱子,我觉得可以增加柱子得直径我觉得可以增加柱子得直径,比如用比如用3cm得得,也可也可以减小淋洗剂得极性等等。以减小淋洗剂得极性等等。关于湿法、干法上样湿法上样湿法上样,一般用淋洗剂溶解样品一般用淋洗剂溶解样品,也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等,但溶剂越少越好但溶剂越少越好,不然溶剂就成了淋洗剂了。很多样品在上柱前就是不然溶剂就成了淋洗剂了。很多样品在上柱前就是粘乎乎得粘乎乎得,一般没关系。可就是有得上样后在硅胶上又会析出一般没关系。可就是有得上样后在硅胶上又会析出,这一般这一般都就是比较大量得样品才会出现都就是比较大量得样品才会出现,就是因为硅胶对样品得吸附饱和就是因为硅胶对样品得吸附饱和,而而样品本身又就是比较好得固体才会发生样品本身又就是比较好得固体才会发生,这就应该先重结晶这就应该先重结晶,得到大部得到大部分得产品后再柱分分得产品后再柱分,如果不能重结晶那就不管她了如果不能重结晶那就不管她了,直接过就就是了直接过就就是了,样品随着淋洗剂流动会溶解得。样品随着淋洗剂流动会溶解得。干法上样干法上样,一般用于固体或粘度大得液体样品。样品用低沸点易溶溶一般用于固体或粘度大得液体样品。样品用低沸点易溶溶剂溶解剂溶解,加入加入1-3倍得粗硅胶倍得粗硅胶,晾干或旋干晾干或旋干,干燥得标准就是硅胶成细粉干燥得标准就是硅胶成细粉而不粘在瓶壁上。装好得柱子上留一段溶剂而不粘在瓶壁上。装好得柱子上留一段溶剂,把吸附了样品得硅胶慢把吸附了样品得硅胶慢慢到进去慢到进去,震动柱子或再加一些溶剂震动柱子或再加一些溶剂,把粘在柱壁上得硅胶洗下。把粘在柱壁上得硅胶洗下。溶剂得选择当然就是最便宜当然就是最便宜,最安全最安全,最环保得了。所以大多选用石油醚最环保得了。所以大多选用石油醚,乙酸乙乙酸乙酯。文献中有写用正己烷得酯。文献中有写用正己烷得,太贵了太贵了,除非特别需要不要用不然银子哗除非特别需要不要用不然银子哗哗得哗得,流得比淋洗剂还快流得比淋洗剂还快,不过因为极性很小不过因为极性很小,有时还就是非她不可。有时还就是非她不可。乙醚也可以用乙醚也可以用,但就是就就是容易睡觉但就是就就是容易睡觉,注意保持清醒别让溶剂流干了注意保持清醒别让溶剂流干了,那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用得那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用得,但就是要知道但就是要知道,她和硅胶得她和硅胶得吸附就是一个放热过程吸附就是一个放热过程,所以夏天得时候经常会在柱子里产生气泡所以夏天得时候经常会在柱子里产生气泡,天天气冷得时候会好一些。甲醇气冷得时候会好一些。甲醇,据说能溶解部分得硅胶据说能溶解部分得硅胶,所以产品如果想所以产品如果想过元素分析得话要留神过元素分析得话要留神,应该经过后继处理应该经过后继处理,比如说重结晶等。其她得比如说重结晶等。其她得溶剂用得相对较少溶剂用得相对较少,要依个人得不同需要选择了。要依个人得不同需要选择了。由于某些原因由于某些原因,用到得淋洗剂多就是大包装得用到得淋洗剂多就是大包装得(便宜嘛便宜嘛),我们这里就是我们这里就是用用10升或升或25升得塑料桶装得升得塑料桶装得,就要注意这些工业品得纯度就是较低得。就要注意这些工业品得纯度就是较低得。经常能够从送来得大桶底部看见有色得杂质经常能够从送来得大桶底部看见有色得杂质,其她得杂质就可想而知其她得杂质就可想而知了了,所以在比较严格得柱分时就要对溶剂重蒸。当然过原料时就可以所以在比较严格得柱分时就要对溶剂重蒸。当然过原料时就可以免去这一步了免去这一步了,反正下面还有提纯得方法。另外溶剂在过柱子后最好反正下面还有提纯得方法。另外溶剂在过柱子后最好也回收使用也回收使用,一方面环保一方面环保,另一方面也能节省部分经费另一方面也能节省部分经费,缺点就是要消缺点就是要消耗一定得人工。这里要注意得就是耗一定得人工。这里要注意得就是,一般在过柱同时进行得就是减压一般在过柱同时进行得就是减压旋蒸旋蒸,石油醚和乙酸乙酯得比例由于挥发度得不同会导致极性得变化石油醚和乙酸乙酯得比例由于挥发度得不同会导致极性得变化,一般会使得极性变大一般会使得极性变大,在梯度淋洗时比较合适在梯度淋洗时比较合适,正好极性越来越大了。正好极性越来越大了。在过完柱子后在过完柱子后,溶剂最后回收要采用常压溶剂最后回收要采用常压,因为在减压旋蒸时会有部分因为在减压旋蒸时会有部分低沸点得杂质一起出来低沸点得杂质一起出来,常压时就会减少这种现象常压时就会减少这种现象,如果杂质和您下面如果杂质和您下面要过得样品有反应那就惨了。要过得样品有反应那就惨了。关于操作问题1 装柱装柱 柱子下面得活塞一定不要涂润滑剂柱子下面得活塞一定不要涂润滑剂,会被淋洗剂带到产品中得会被淋洗剂带到产品中得,可以采可以采用四氟节门用四氟节门(T型四氟节门三通接头型四氟节门三通接头)得。干法和湿法装柱觉得没什么得。干法和湿法装柱觉得没什么区别区别,只要能把柱子装实就行。装完得柱子应该要适度得紧密只要能把柱子装实就行。装完得柱子应该要适度得紧密(太密了太密了淋洗剂走得太慢淋洗剂走得太慢),一定要均匀一定要均匀(不然样品就会从一侧斜着下来不然样品就会从一侧斜着下来)。书中。书中写得都就是不能见到气泡写得都就是不能见到气泡,我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大得影响得影响,一加压气泡就全下来了。当然如果您装得柱子总就是有气泡一加压气泡就全下来了。当然如果您装得柱子总就是有气泡就说明需要多练习了。但就是柱子更忌讳得就是开裂就说明需要多练习了。但就是柱子更忌讳得就是开裂,甭管竖得还就甭管竖得还就是横得是横得,都会影响分离效果都会影响分离效果,甚至作废！甚至作废！2 加样加样 用少量得溶剂溶样品加样用少量得溶剂溶样品加样,加完后将下面得活塞打开加完后将下面得活塞打开,待溶剂层下降至待溶剂层下降至石英砂面时石英砂面时,再加少量得低极性溶剂再加少量得低极性溶剂,然后再打开活塞然后再打开活塞,如此两三次如此两三次,一一般石英砂就基本就是白色得了。加入淋洗剂般石英砂就基本就是白色得了。加入淋洗剂,一开始不要加压一开始不要加压,等溶样等溶样品得溶剂和样品层有一段距离品得溶剂和样品层有一段距离(24cm就够了就够了),再加压再加压,这样避免了这样避免了溶剂溶剂(如二氯甲烷等如二氯甲烷等)夹带样品快速下行。夹带样品快速下行。3 淋洗剂得选择淋洗剂得选择 感觉上要使所需点在感觉上要使所需点在rf0、20、3左右得比较好。不要认为在板上爬左右得比较好。不要认为在板上爬高了分得比较开高了分得比较开,过柱子就用那种极性过柱子就用那种极性,如果如果rf在在0、6,即使相差即使相差0、2也也不容易在柱子上分开不容易在柱子上分开,因为柱子就是一个多次爬板得状态因为柱子就是一个多次爬板得状态,可以通过公可以通过公式得比较式得比较:0、6/0、8一次得分离度一次得分离度,肯定不如肯定不如(0、2/0、3)得三次方或得三次方或四次方大。四次方大。4 样品得收集样品得收集 用硅胶作固定相过柱子得原理就是一个吸附与解吸得平衡。所以如果用硅胶作固定相过柱子得原理就是一个吸附与解吸得平衡。所以如果样品与硅胶得吸附比较强得话样品与硅胶得吸附比较强得话,就不容易流出。这样就会发生就不容易流出。这样就会发生,后面得后面得点先出点先出,而前面得点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。另外而前面得点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。另外,收集收集得试管大小要以样品量而定得试管大小要以样品量而定,特别就是小量样品特别就是小量样品,如果用大试管如果用大试管,可能可能一根就收到了三个样品。如果都用小试管那工作量又太大。一根就收到了三个样品。如果都用小试管那工作量又太大。