蛋白提取方法.doc

1 材料与方法 1、1 材料 1、1、 组织与细胞得来源: 。1、2 仪器设备 机械组织匀浆器 低温高速离心机 (40,0 g) 超速离心机 超生细胞破碎仪 超纯水装置 1、1。3 试剂 三氯醋酸 (TC) 丙酮 二硫苏糖醇 (DT) 尿素CASPMSFEDTA 乙醇 磷酸 考马斯亮蓝30 抑肽素 亮肽素 试剂纯度均应就是分析纯或以上。1。、溶液配制 (1) PBS: NCl g,KCl 0、2 g,NaHP4 1。44 g,H2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调p至7.4,用纯水定容至1 L; (2)DTA 储存液: 18.61g Na2EDTA2O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/LNaOH调节H值至8.0(约需2 g H颗粒),定容为100 ml、可高压灭菌后分装备用;() 亮肽素储存液 (50 g/l,100)0m/ml溶于水,-75保存;使用时配成50 g/l储液,-0保存; (4) 抑肽素储存液 (7 gml,10) 1 mgl溶于甲醇,75保存;使用时配成0 g/ml储液,-2保存; (5) P储存液 ( M,100): .4mPMF,溶于ml异丙醇中,0保存。TT储存液 (1 M): 。31 DTT溶于2 l2O中,-20 保存 (DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。 (7) 裂解液: Lysis bufr ( M e,%/v AS, 1 wvDTT, .5CA andacktaiof ote inhibitrs)LyssbufferB(7 M ura, 2M hiuea,4% w/v HS, 1wv DTT,、% CA n cocktai o rotese inhbitors) Lys berC 40 Trsbase (H 9。5)i ltrape H2Oyis buffer D(8 ura, 4CHS, 4 mM Tris(as), 40 ml)Lys bufferE ( M urea,2 Mtiore, 2 SB3-10, 2CHAPS,% w/vDTT, 0、% C andcocktl proteaeinhibitors)Lysi bfe 100L SD saple solion (1% w/vSD, 0、3 M iHCl, pH8。8, 50 mM DT,5 v glyero)CA、蛋白酶抑制剂混合物与DT在临用前加入。蛋白酶抑制剂混合物3成分终浓度蛋白酶抑制剂混合物PMSF35 g/mlo 1 mMEDTA0、 mg/ml (1 M) 抑肽素0。7 g/l亮肽素0、5gl1.2 方法 1。1.1组织蛋白提取方法、.1。1三氯醋酸/丙酮沉淀法1 (1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步; (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织; ()将粉末悬浮于含DTT(0。2wv)得10三氯醋酸(w/v)得丙酮溶液中; (4)蛋白0沉淀过夜; (5)3500g(6)离心30min; 将沉淀重悬于含.2DTT得预冷丙酮中; (7)-2放置1h; 3500g(6)离心30min;(9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥得沉淀; (10)在裂解液中重新溶解沉淀(510g组织需要1ml裂解液); (11)15,40000,离心1hr; (12)用raod法2测定上清得蛋白浓度,分装后置75保存。 1、2、1。2超速离心法 (1)取材; (2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末,每g样品加入0.5ml裂解液,使用组织匀浆器匀浆0; ()组织悬液15,10离心1in; (4)上清液4,500g超速离心45min; ()小心避开上层漂浮得脂质层,吸取离心上清64,00g再次离心5min;取离心上清。Brafr法定量,分装后置5保存。 1。2、2培养细胞蛋白提取1。2.2、1循环冻融法 (1)吸出培养液弃去,0。01mol/LPBS洗一次; (2)加入PBS,用橡胶刮收集细胞于10l离心管中; (3)50g,离心5min; (4)弃上清,PBS洗三次(室温,50g,5min), ()在离心管中加入1mlPBS,重悬细胞,用1ml微量加液器移入Eppendor管中;执行Biofue存储程序8,00g5mn离心; (7)用200l微量加液器吸出PBS,弃去;吸干残留得PB,估计样品体积,加入5倍体积裂解液,巴氏滴管混匀,液氮中反复冻融三次(每次置液氮中s,室温融化),DTT在第一次冻融后加入; (9)执行Bue存储程序6,15,40000g,离心1h(ifge);(0)上清Bradfod法定量,沉淀-5保存备用。 .2.2、2超声破碎法 (1)取对数生长期得细胞,吸出培养液弃去,0。01mol/LPBS洗一次; (2)加入BS,用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中;(3)室温,50g,离心5min;()弃上清,PBS洗次(室温,500g,5min);(5)在离心管中加入1mlPS,重悬细胞,用1l微量加液器移入Eppedof管中,500g离心in; 吸干残留得PS,估计样品体积,加入5倍体积裂解液,混匀,移入1。mlEpedor管中,冰浴中以最大功率超声破碎细胞(30s);()1,00g,离心1hr(Biofug);上清Brdr法定量,沉淀-7保存备用。 结果与讨论 蛋白质提取得基本步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞、离心除去膜组分等获得溶解得蛋白质上清。 我们破碎细胞采用循环冻融法与超声波法;破碎组织采用液氮研磨法与机械匀浆法。循环冻融法操作简便,比较适合提取培养细胞得稳定蛋白,我们后期实验对培养细胞主要采取这种破碎方式。使用超声破碎必须注意得就是控制强度在一定限度,即刚好低于溶液产生泡沫得水平。因为产生泡沫会导致蛋白质变性,同时要注意散热、匀浆就是机体软组织破碎最常用得方法之一。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解得可能性较小,所以匀浆就是简便、迅速与风险小得组织破碎方法,我们实验室在破碎脑与脊髓组织时常用此法;由于神经组织比较柔软,液氮研磨法也很适合,本实验中我们使用了这一方法破碎大鼠脊髓组织,中枢神经组织由于富含脂类,沉淀法与高速离心法可以使蛋白与脂类干扰物质有效分离,但沉淀法得缺点就是再溶解时蛋白损失严重。高速离心得缺点就是需要样品量大,如BecanL7-6超速离心机得离心管容量为,不适用小量样品得制备。 在众多得裂解液配方中,我们主要采用9M尿素,4w/CHAPS,w/vDTT,0.%两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物,原因就是这一配方经长期使用很稳定,裂解效率也较高,非常适合小量细胞蛋白提取要求。针对富脂得中枢神经组织中脂类物质与蛋白相互作用,高浓度得尿素可以造成强变性条件(但如果再提高尿素浓度,尿素就容易析出,影响蛋白得溶解),过量得去污剂也可以减少脂类得污染,两性电解质可以提高蛋白得溶解度,同时有利于等待聚焦。早期我们加入Tis碱以防止蛋白得水解,但就是由于盐离子得引入,导致IEF电压过低,影响聚焦、