DB37∕T 3316-2018 鸡J-亚群白血病实验室诊断技术(山东省).pdf

ICS 65.020.30 B45 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 33162018 鸡 J-亚群白血病实验室诊断技术 Laboratary Diagnostic Technique of Chicken Leukosis Virus Subgroup J (ALV-J) 2018 - 06 - 12 发布 2018 - 07 - 12 实施 山东省质量技术监督局 发 布 DB37/T 33162018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由山东省畜牧兽医局提出。 本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会提出并归口。 本标准主要起草单位：山东农业大学。 本标准主要起草人：成子强。 DB37/T 33162018 1 鸡 J-亚群白血病实验室诊断技术 1 范围 本标准规定了我省针对ALV-J的检测诊断方法。 本标准适用于判断鸡群是否患J亚群白血病。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 禽白血病病毒J亚群 Avian Leukosis Virus Subgroup J . ALV-J ALV-J属反转录病毒科甲型反转录病毒属，是单股正链RNA病毒。ALV-J主要特点是引起多种禽类免疫抑制和髓细胞性白血病发生，对养鸡业威胁巨大。 2.2 抗原/抗体检测 通过标准的酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测ALV-J的抗原/抗体。应用指定的商品化ALV-J抗原/抗体检测试剂盒，用血清检测ALV-J抗体，用棉拭子检测ALV-J群特异性抗原（p27）具体实验步骤参照GB/T 26436。抗体及p27均呈阳性，或二者之一呈阳性，可怀疑ALV-J感染。 2.3 PCR 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)。 2.4 RT-PCR 反转录-聚合酶链反应（reverse transcription PCR，RT-PCR）。 3 材料与试剂 3.1 常规使用的 ELISA 抗原/抗体检测试剂盒 (IDEXX)。 3.2 常规使用的商品化的 RNA 提取试剂盒。 3.3 常规使用的商品化的 RNA 反转录试剂盒。 3.4 各检测方法所需的试剂。 3.4.1 PBS 缓冲液见附录 A 中 A.1。 3.4.2 灭菌水。 DB37/T 33162018 2 3.4.3 蒸馏水。 3.4.4 细胞生长培养基见附录 A 中 A.2。 3.4.5 细胞维持培养基见附录 A 中 A.3。 除另有规定外，所有化学试剂均为分析纯。 4 仪器与设备 4.1 全自动高温高压灭菌锅 (温度范围：105-134；额定压力：0.23Mpa)。 4.2 低速离心机。 4.3 PCR 仪。 4.4 二氧化碳恒温细胞培养箱。 4.5 液氮储存罐。 4.6 研磨器。 4.7 手术剪。 4.8 各量程移液枪。 4.9 超低温冰箱。 4.10 酶标仪。 4.11 分光光度计 5 抽样 5.1 样品采集 5.1.1 组织样品的采集 按1 %的比例，随机选取疑似J亚群禽白血病病鸡，用无菌手术剪分离肾脏、肝脏、脾脏等所需脏器100 mg 分装于1 mL 储存管内，并及时冻存于-80 冰箱或液氮罐内备用。 5.1.2 血液样品的采集 用2.5 mL无菌注射器于翅下静脉或颈静脉抽取1 mL左右的静脉血，放入编号离心管内，倾斜静置，待血液分离出血清后吸取血清于编号的离心管内，储存于-20 冰箱备用。 5.1.3 泄殖腔棉拭子的采集 用无菌棉签插入泄殖腔内，擦拭后将棉签放入装有1 mL PBS缓冲液的离心管内，储存于-20 冰箱备用。 5.2 样品运输与存放 采集的样品应放入冻存管并放入冰盒内运输 ，然后上述要求及时放入液氮罐或-80 冰箱或-20 冰箱储存。 6 操作方法 6.1 方法 DB37/T 33162018 3 6.1.1 抗原/抗体检测 抗原/抗体检测是采用美国IDEXX 公司的ELISA检测试剂盒检测。 6.1.1.1 样品处理 检测样品前，棉拭子应反复冻融2 次3 次，4 ，1006.2g （3000转）离心2 min3 min，吸取上清。血清样品于室温融化， 500 倍稀释，用于检测。 6.1.1.2 操作步骤 按照试剂盒提供的检测步骤操作。 6.1.1.3 结果判定 只要p27抗原和ALV-J抗体其中之一为阳性，需要进行下一步检测。 6.1.2 RT-PCR 检测 通过对疑似病例组织RNA提取，反转录为cDNA作为模板进行特异性PCR检测。 6.1.2.1 RNA 及 cDNA 提取 将冻存于液氮罐内的组织用商品化试剂盒提取RNA，用分光光度计测浓度后用商品化试剂盒反转录成cDNA。RNA储存于-80 冰箱，cDNA储存于-20 冰箱。 6.1.2.2 操作步骤 先完成RNA提取， 具体操作按照试剂盒提供的步骤即可， 测定浓度， 然后将RNA反转录成cDNA， 以cDNA为模板，利用ALV-J gp85片段的特异性扩增进行PCR扩增，扩增产物于120 V电压，1 %琼脂糖凝胶电泳检测。剩余的RNA保存于-80 冰箱，cDNA保存于-20 冰箱。具体反应条件见附录B。 6.1.2.3 结果判定 琼脂糖凝胶电泳中出现特异的545 bp的片段条带时，进行下一步检测。 6.1.3 病毒分离 6.1.3.1 DF-1 细胞传代培养 取生长状态良好的DF-1细胞传代并用生长培养基培养至少4 小时，待细胞密度达到60 %70 %后用于病毒分离。 6.1.3.2 组织研磨液制备 采用鸡肝脏/肾脏/脾与DMEM培养液充分混合、研磨后，作为病毒研磨液，并用超声波破碎90 循环，每个循环工作时间3 秒、间隔时间2 秒，重复两次，1006.2g离心3 min后，上清用0.22 m的微孔滤器过滤除菌。 6.1.3.3 病毒液感作 DF-1 细胞 在二氧化碳培养箱培养了至少4 h的DF-1细胞倒掉生长培养基，将1mL组织滤液注入培养瓶/培养板内，作用于DF-1细胞，将细胞放在二氧化碳培养箱内作用1h后更换细胞维持培养基，培养至少7 天。 DB37/T 33162018 4 6.1.3.4 p27 抗原检测 采用美国IDEXX 公司的ELISA检测试剂盒检测 6.1.3.5 结果判定 p27抗原阳性，可判定为ALV-J感染。 6.1.4 结果诊断 RT-PCR及病毒分离时DF-1细胞上清p27检测结果均为阳性时，可诊断为ALV-J感染。 DB37/T 33162018 5 A A 附 录 A （规范性附录） 材料与试剂配制方法 A.1 PBS缓冲液 NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.42 g（Na2HPO412H2O 3.58 g），KH204 0.27 g溶于蒸馏水，定容于1000 mL，过滤后高压灭菌备用。 A.2 细胞生长培养基 达尔伯克必需基本培养基（Dulbeccos Minimum Essential Medium，DMEM）粉剂1 包，NaHCO3 3.7 g，青链霉素双抗10 mL，胎牛血清100 mL，溶于蒸馏水，定容为1000 mL，无菌高压滤器过滤，储存于4 冰箱备用。 A.3 细胞维持培养基 达尔伯克必需基本培养基（Dulbeccos Minimum Essential Medium，DMEM）粉剂1包，NaHCO3 3.7 g，青链霉素双抗10 mL，胎牛血清10 mL，溶于蒸馏水，定容为1000 mL，无菌高压滤器过滤，储存于4 冰箱备用。 DB37/T 33162018 6 B B 附 录 B （规范性附录） RT-PCR 引物信息 禽白血病病毒J亚群（ALV-J）RT-PCR检测所需引物序列。 引物浓度均为10 pmol。 引物名称 序列 长度 扩增目的 用途 上游引物 5-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3 545bp 禽白血病病毒J亚群（ALV-J）gp-85基因片段 扩增出的gp-85特异性片段进行琼脂糖凝胶电泳检测 下游引物 5-CGAACCAAAGGTAACACACG-3 DB37/T 33162018 7 C C 附 录 C （规范性附录） RT-PCR 反应条件 C.1 反转录体系为： 采用 20 L体系，在PCR管中依次加入 5X Prime Script Master Mix 4 L,模板RNA x L（x=1000/RNA浓度） ，用RNase Free dH2O补足 20 L。 C.2 反转录条件为：37 15 min，85 5 s。 C.3 PCR反应体系为：反应总体系为 25 L，在PCR管中依次加入,2Tap PCR MasterMix12.5 L，10 pmol/ L的上下游引物各 0.5 L，模板cDNA1 L，其余用灭菌水补至 25 L。 C.4 循环条件：95 预变性 5 min，94 变性 30 s，53 退火 30 s，72 延伸 45 s，进行 30 个循环，最后于 72 延伸 10 min。4 保存。反应后，PCR产物取 7 L8 L，在 2 %琼脂糖凝胶电泳检测。 图C.1 PCR 扩增电泳结果（N 为阴性对照） _