分子生物学与临床.ppt

分子生物学与临床天津市第三中心医院刘树业随着分子生物学技术的发展，聚合酶链反应（随着分子生物学技术的发展，聚合酶链反应（PCRPCR）技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等方技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等方面的诊断。面的诊断。1.1.检测临床标本中病原体核酸序列。检测临床标本中病原体核酸序列。2.2.肿瘤基因突变情况。肿瘤基因突变情况。3.3.遗传性疾病的基因序列。遗传性疾病的基因序列。4.4.人类白细胞表面抗原（人类白细胞表面抗原（HLAHLA）配型。）配型。5.5.法医学方面的鉴定工作。法医学方面的鉴定工作。PCR技术在临床实验室应用的价值技术在临床实验室应用的价值优点：优点：1.1.灵敏度高，理论上，只要标本中含有一个分子的灵敏度高，理论上，只要标本中含有一个分子的DNADNA或或RNARNA就可就可以作出诊断。以作出诊断。2.2.特异性强，对于一个特异性强，对于一个1919核苷酸的引物来说，非特异性配对的概核苷酸的引物来说，非特异性配对的概率为率为4 419 19=2.75*10=2.75*101111这表示要与这这表示要与这1919个碱基的排列顺序完全相同个碱基的排列顺序完全相同时需要的基因组时需要的基因组DNADNA片段的最小长度，而人的基因组长度为片段的最小长度，而人的基因组长度为3*103*109 9碱基对，以克服血清学诊断有交叉反应的缺陷。碱基对，以克服血清学诊断有交叉反应的缺陷。3.3.可以早期诊断，如在可以早期诊断，如在HCVHCV的感染中，第一周内就可以检测出的感染中，第一周内就可以检测出HCV HCV RNARNA，而抗体的产生一般在第二周以后，而抗体的产生一般在第二周以后。PCR在诊断病原体感染时的优缺点在诊断病原体感染时的优缺点4.4.对于体液免疫力低下或使用免疫抑制剂而无对于体液免疫力低下或使用免疫抑制剂而无抗体产生者，抗体产生者，PCRPCR却可以作出明确诊断。却可以作出明确诊断。5.5.可以对病原体作定量分析，反映病原体在机可以对病原体作定量分析，反映病原体在机体的复制及动力学变化情况。体的复制及动力学变化情况。6.6.可对病原体进行基因分型。指导临床治疗。可对病原体进行基因分型。指导临床治疗。不足之处不足之处:1.1.操作复杂，技术不易被熟练掌握。操作复杂，技术不易被熟练掌握。2.2.价格昂贵。价格昂贵。3.3.出于敏感性太高，操作步骤多而复杂，即使有极少出于敏感性太高，操作步骤多而复杂，即使有极少量的污染也会造成假阳性。量的污染也会造成假阳性。4.4.由于操作复杂，对试剂及实验条件要求严格，稍有由于操作复杂，对试剂及实验条件要求严格，稍有差错就会出现假阴性。差错就会出现假阴性。几点认识几点认识一一.今后仪器和试剂的发展方向：封管、定量及自今后仪器和试剂的发展方向：封管、定量及自 动化；动化；二二.样品采集方式对样品采集方式对PCRPCR很重要，比操作更重要。很重要，比操作更重要。三三.内标作用：操作过程的监控、控制假阴性。内标作用：操作过程的监控、控制假阴性。四四.从核酸提取、扩增到检测，对照与待测标本从核酸提取、扩增到检测，对照与待测标本 同步进行；同步进行；五五.禁用产物的电泳分析技术。禁用产物的电泳分析技术。六六.探针杂交技术和防污染技术的采用是一大探针杂交技术和防污染技术的采用是一大 进步。进步。一.标本的采集常用于基因扩增检测的临床标本包括常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。当使用非密闭采本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。当使用非密闭采样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采样，必须注意防止来自采样样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采样，必须注意防止来自采样者皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性手套。者皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性手套。玻璃器皿在使用前应高压处理，因为玻璃器皿常含有不易失活的玻璃器皿在使用前应高压处理，因为玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是热灭菌，酶。最好是热灭菌，250烘烤烘烤4 4小时以上可使小时以上可使RNARNA酶永久性酶永久性失活。失活。全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。EDTA和枸橼酸盐是首选的和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因为肝素是抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因为肝素是Taq酶的强抑制剂，而酶的强抑制剂，而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。且在其后的核酸提取步骤中很难去除。临床用于临床用于RNA（如（如HCVRNA）扩增检测的血标本建议进行抗凝）扩增检测的血标本建议进行抗凝处理，并尽快（处理，并尽快（3小时以内）分离血浆，以避免小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。如的降解。如未作抗凝处理，则抽血后，必须在未作抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。小时内分离血清。二.标本的稳定化处理用于DNA扩增检测的标本，采集后一般不需特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验室。由于RNA易受RNA酶的降解，因此用于RNA测定的标本有时必须进行稳定化处理，如流行病学调查的现场采样。异硫氰酸胍盐（Guanidinethiocyanate,GITC）可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按14的比例加至含有5mol/LGITC的试管内中，从而使血清（浆）中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可邮寄。对于特定的检测项目，上述稳定化处理方法的效果究竟如何，要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。三.标本的运送标本采集后必须尽快送至实验室。经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经GITC稳定化处理的标本，通常在运送时，应采用不易破碎的容器装载标本。用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。四.标本的贮存临床体液标本如血清/血浆等可于-70下长时间贮存。用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10 mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA缓冲液（pH 7.5-8.0）中4保存，用于 RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20即可。用 GITC处理的RNA标本在室温可保存7天。五.标本的处理（核酸提取）标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤，在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板前，应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。通常，核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能来源于标本本身（如血红素及其前体或降解产物）或核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等），这些物质对其后的Taq酶扩增反应步骤具有强烈的抑制作用，从而影响靶核酸的扩增测定。当标本为痰时，则必须先进行液化处理，再提取核酸。需注意的是，液化时不能加热，液化时间不能过长。此外，当靶核酸为RNA时，逆转录PCR测定失败的常见原因是标本在运送前未经充分的稳定化处理(血清或血浆按14的比例加至含有5mol/LGITC的试管内中，从而使血清（浆）中的RNA酶不可逆失活)及核酸提取试剂的RNA酶的污染。对于前者，要核查测定分析前的步骤，如果发现有RNA降解的证据，实验室则应拒绝接受标本，要求重新采取标本，并对运送者给以详细的指导。对于后者，建议使用高质量的商品核酸提取试剂。一一.内源性物质内源性物质(影响因子）影响因子）1.类风湿因子2.补体3.嗜异性抗体4.嗜靶抗原的自身抗体5.医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体6.交叉反应物质7.标本中其它成分的影响二二.外源性物质外源性物质1.标本溶血2.标本受细菌污染3.标本保存不当4.标本凝集不全5.标本管中添加物质的影响PCRPCR测定的临床应用及测定的临床应用及测定结果的临床意义测定结果的临床意义结核分支杆菌结核分支杆菌病原学：病原学：结核分支杆菌复合群（结核分支杆菌复合群（MTBC）：人型）：人型结核分支杆菌、牛型结核分支杆菌、非洲型结核结核分支杆菌、牛型结核分支杆菌、非洲型结核分支杆菌和田鼠型结核分支杆菌，后者无致病性。分支杆菌和田鼠型结核分支杆菌，后者无致病性。对人有致病性的主要是人型结核分支杆菌，牛型对人有致病性的主要是人型结核分支杆菌，牛型引起人类发病已很少见。此外分支杆菌报道有引起人类发病已很少见。此外分支杆菌报道有100余种，余种，1994年国际公认有年国际公认有56种，常用非结核分支种，常用非结核分支杆菌（杆菌（NTM）或其他分支杆菌（）或其他分支杆菌（MOTT）的名称。）的名称。培养培养：15-20小时一代，小时一代，2-4周周看到看到培养基上的菌培养基上的菌落。抗菌治疗后需落。抗菌治疗后需4-8周或周或20周才出现菌落。周才出现菌落。引物设计引物设计：结核分支杆菌共有的靶序列：结核分支杆菌共有的靶序列：65KD人型结核分支杆菌特异的靶序列人型结核分支杆菌特异的靶序列mpt40MTBC特有的靶序列，如特有的靶序列，如IS6110插入序列插入序列rRNA序列，以序列，以16S-rRNA为模板为模板cDNA扩增，高度扩增，高度保守，保守，TB有高达有高达1000-10000拷贝数，具很高的灵敏度拷贝数，具很高的灵敏度和特异性。和特异性。注意问题：注意问题：标本处理标本处理痰、胸腹水：液化剂，痰、胸腹水：液化剂，红细胞裂解液红细胞裂解液临床应用评价临床应用评价：1.Tb与其他分支杆菌区别：与其他分支杆菌区别：AIDS鸟分支杆菌，龟分支鸟分支杆菌，龟分支杆菌杆菌2.TB耐药基因耐药基因3.含菌量较低标本分离含菌量较低标本分离TB敏感性：远高于直接涂片和培养敏感性：远高于直接涂片和培养涂片镜检：涂片镜检：10000-100000菌菌/ml，培养：培养：10-100个活菌个活菌PCR：1-20个结核杆菌，但不能鉴别死菌和活菌，不能个结核杆菌，但不能鉴别死菌和活菌，不能反映抗结核治疗的效果；还可见临床无结核病证据涂片反映抗结核治疗的效果；还可见临床无结核病证据涂片和培养均阴性而和培养均阴性而PCR阳性的情况，这在理论上可诊断结阳性的情况，这在理论上可诊断结核，但临床上很难被医师认同，这涉及所谓金标准的问核，但临床上很难被医师认同，这涉及所谓金标准的问题，目前还远不能就此情况下题，目前还远不能就此情况下PCR阳性的生物学意义和阳性的生物学意义和价值作出评价。价值作出评价。沙眼衣原体Chlamydea trachomatis Ct病原学：三个生物变种：沙眼生物变种A-K12个血清型性病淋巴肉牙肿变种LGV3个血清型，人是天然宿主鼠生物变种鼠是天然宿主，不侵犯人，与鼠肺炎有关病原学检验：涂片、抗原抗体检测、核酸检测四种衣原体的性状比较四种衣原体的性状比较PCR：16SrRNA16SrRNA基因高度保守基因高度保守衣原体属特异引物衣原体属特异引物7.5kD 7.5kD 质粒及质粒及MOMP(MOMP(主要外膜蛋白主要外膜蛋白)基因适于构建种或型基因适于构建种或型特异性引物特异性引物根据沙眼衣原体内源性质粒序列设计合成的一根据沙眼衣原体内源性质粒序列设计合成的一对引物对引物:1:GGACAAATCGTATCTCGG;2:GAAACCAACTCTACGCTG.1:GGACAAATCGTATCTCGG;2:GAAACCAACTCTACGCTG.扩增片段扩增片段517,517,可扩增可扩增1515个已知血清型的沙眼衣原体个已知血清型的沙眼衣原体.实验实验证明证明,此引物不扩增其他眼部常见微生物和正常人核酸此引物不扩增其他眼部常见微生物和正常人核酸,而对临床而对临床4949例诊断为沙眼的标本阳性率为例诊断为沙眼的标本阳性率为63%,63%,敏感性和敏感性和特异性均超过细胞培养法和免疫荧光法与酶免疫法等常特异性均超过细胞培养法和免疫荧光法与酶免疫法等常规方法规方法,灵敏度达到能检出灵敏度达到能检出1 1个衣原体个衣原体DNADNA分子分子.特别要注意的问题:取材:一定要取到细胞临床评价：金标准培养免疫学：荧光主观判定 EIA金葡、链球菌、淋球菌-交叉 反应 PCR：假阴阳性人类组织相容性抗原(HLA)组织相容性组织相容性（主要组织相容性复合体（主要组织相容性复合体MHC）系统的概念系统的概念：有有I、II、III类类I类：类：HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-E，HLA-F，HLA-G，HLA-HL等等II类类:HLA-DR，HLA-DQ，HLA-DP，HLA-DO，HLA-DN，HLA-M,等位点等位点III类类:为补体系统为补体系统C2，C4，Bf等。等。HLA抗原的分类抗原的分类:I类和类和II类抗原类抗原多态性、共显性遗传：已发现的多态性、共显性遗传：已发现的HLA基因位基因位点点(等位基因数等位基因数)约约400左右左右HLA分型的基本方法血清学方法:基本原理活的淋巴细胞表面有大量的HLA-A,HLA-B,HLA-C HLA-DR抗原,在与特异性的同型抗体结合后,有补体存在时会被杀死,经过染色，根据淋巴细胞被杀死的百分率,可以决定待测淋巴细胞是否具有某一特异性的抗原.细胞学方法:基本原理检测的抗原属于HLA-DP，HLA-DQ两个位点，如果两种淋巴细胞表面抗原不同,在一起培养，不同抗原互相刺激，淋巴细胞增殖并向母细胞转化；否则，这两种细胞会保持不变。HLA分型的基本方法常用X射线处理已知HLA-DP，HLA-DQ特异淋巴细胞，失去增殖能力保持刺激能力，与待测淋巴细胞混合培养，若不发生增殖和母细胞化即认为与已知特异性细胞同型，否则为不同型别淋巴细胞.HLA-DR基因分型:(例)序列特异性引物PCR法合成19对引物,21管加公共引物DR型别.HLA抗原：抗原：一.HLAABC抗原:与疾病相关HLAA,B与器官移植的关联没有与器官移植的关联没有D的配型意的配型意义显著义显著,C无意义无意义.二.HLAD抗原:与器官移植配型相关DR座位上的等位基因数比座位上的等位基因数比AB座位上的少座位上的少,在随在随机人群中挑选到机人群中挑选到DR抗原配合的供体要比选择抗原配合的供体要比选择AB抗原配合的供体容易抗原配合的供体容易,所以目前器官移植主所以目前器官移植主要做要做DR配型配型.遗传病检测遗传病是由基因在性细胞的突变引起的遗传病是由基因在性细胞的突变引起的一。一。PCRPCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针法结合等位基因特异性寡核苷酸探针法对已知突变热点基因检测：对已知突变热点基因检测：PCR-PCR-目的基因目的基因-膜膜 杂交杂交 发现突变位点发现突变位点 合成正常及突变寡核苷酸探针合成正常及突变寡核苷酸探针一个等位基因有一种一个等位基因有一种ASOASO探针探针,要证明待测标本是否属于这一要证明待测标本是否属于这一等位基因等位基因,要进行一次杂交显示信号的操作要进行一次杂交显示信号的操作,这对于致病基因这对于致病基因有多个突变可能性的诊断有多个突变可能性的诊断(地中海贫血在中国有地中海贫血在中国有1818种突变类种突变类型型,全球有全球有100100多种多种),),操作繁杂甚至不可能操作繁杂甚至不可能.二。二。PCRPCR扩增特异等位基因扩增特异等位基因在在33末端设计突变位点末端设计突变位点,根据特异性根据特异性PCRPCR产物出现与否判断产物出现与否判断突变的存在突变的存在.三.限制性片段长度多态性分析突变位点与酶切位点相关突变位点与酶切位点相关 出现新的电泳图谱出现新的电泳图谱四.单链构象多态性分析(SSCP)PCRPCR扩增靶扩增靶DNA;DNA;将特异的将特异的PCRPCR扩增扩增 产物变性，而后产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNADNA分子分子;将适量的单链将适量的单链DNADNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果结果.若发现单链若发现单链DNADNA带迁移率与正常对照的相比发生带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNADNA片段中有碱基突变片段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏，不需要该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要特殊的仪器，适合临床实验的需要.不不足足之之处处.例例如如，只只能能作作为为一一种种突突变变检检测测方方法法，要要最最后后确确定定突突变变的的位位置置和和类类型型，还还需需进进一一步步测测序序;电电泳泳条条件件要要求求较较严严格格;另另外外，由由于于SSCPSSCP是是依依据据点点突突变变引引起起单单链链DNADNA分分子子立立体体构构象象的的改改变变来来实实现现电电泳泳分分离离的的，这这样样就就可可能能会会出出现现当当某某些些位位置置的的点点突突变变对对单单链链DNADNA分分子子立立体体构构象象的的改改变变不不起起作作用用或或作作用用很很小小时时，再再加加上上其其他他条条件件的的影影响响，使使聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳无无法法分分辨辨造造成成漏漏检检.尽尽管管如如此此该该方方法法和和其其他他方方法法相相比比仍仍有有较较高高的的检检测测率率.首首先先，它它可可以以发发现现靶靶DNADNA片片段段中中未未知知位位置置的的碱碱基基突突变变.Takao.Takao，经经实实验验证证明明小小于于300bp300bp的的DNADNA片片段段中中的的单单碱碱基基突突变变，90%90%可可被被SSCPSSCP发发现现，他他认认为为现现在在知知道道的的所所有有单单碱碱基基改改变变绝绝大大多多数数可可用用该该方方法法检检测测出出来来.另另外外，SSCPSSCP方方法法可可通通过过聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳将将不不同同迁迁移移率率的的突突变变单单链链DNADNA分分离离，并并且且还还可可以以进进一一步步提提纯纯.用用这这种种方方法法可可以以最最终终从从DNADNA序序列列水水平平上上鉴鉴别别突突变变DNADNA片段片段.UNGUNG酶酶/dUTPdUTP防污染系统防污染系统本试剂盒中加入了本试剂盒中加入了dUTP以保证以保证PCR只选择性地扩增临只选择性地扩增临床中的靶床中的靶DNA。UNG酶（尿嘧啶糖基化酶）能识别并酶（尿嘧啶糖基化酶）能识别并催化酶解含有催化酶解含有dUTP的的DNA结构，但不会对含有结构，但不会对含有dTTP的的DNA的结构识别并催化酶解。的结构识别并催化酶解。dUTP不存在于自然不存在于自然的的DNA中，只有运用中，只有运用dUTP替代替代dTTP的的PCR反应之中反应之中产生的扩增子中存在。这种产生的扩增子中存在。这种dU化的化的PCR产物与产物与UNG酶酶一起孵育后使其失去再被扩增的能力，因一起孵育后使其失去再被扩增的能力，因UNG可裂解可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖苷键，可去除糖苷键，可去除dU，使无使无dU的位点阻止的位点阻止TaqDNA聚合酶的延伸。聚合酶的延伸。UNG酶可酶可从单链或双链从单链或双链DNA中消除中消除尿嘧啶，而对尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无作用。啶和单一尿嘧啶分子则无作用。UNG酶在正常酶在正常PCR循循环变性一步就可被灭活，所以对含环变性一步就可被灭活，所以对含dU的新的的新的PCR产物产物没有影响。没有影响。肿瘤研究中的分子生物学肿瘤分为:癌,肉瘤,白血病/淋巴瘤癌:90%的人类肿瘤,起源内胚层及外胚层上皮细胞肉瘤,白血病/淋巴瘤起源中胚层细胞,包括肌肉,骨骼,血管,成纤维细胞以及血液和淋巴系统中的循环细胞肿瘤发展的多步性.病毒癌基因:肿瘤病毒:有致癌能力的有致癌能力的DNA病毒病毒:(6个病毒家族个病毒家族)乙肝病毒乙肝病毒,猴病毒猴病毒40,多瘤病毒多瘤病毒,乳头瘤病毒乳头瘤病毒,疱疱疹病毒疹病毒,痘病毒痘病毒只有一类只有一类RNA病毒致癌病毒致癌反转录病毒反转录病毒肿瘤抑癌基因的发现:Hanis19601960年年,正常细胞与肿瘤细胞融合正常细胞与肿瘤细胞融合杂合体细杂合体细胞不致瘤胞不致瘤正常细胞中具有肿瘤抑制基因正常细胞中具有肿瘤抑制基因产产生肿瘤表型的负调节物生肿瘤表型的负调节物当杂合体细胞某段染当杂合体细胞某段染色体丢失后色体丢失后细胞变为肿瘤表型细胞变为肿瘤表型-这段染色这段染色体上有重要的肿瘤抑制基因体上有重要的肿瘤抑制基因抑癌基因:P53多种肿瘤.早期发现肿瘤中早期发现肿瘤中P53表达增加表达增加,认为是癌基因认为是癌基因.正常正常P53基因抑制肿瘤形成基因抑制肿瘤形成,肿瘤肿瘤中过量表达的是中过量表达的是P53基因突变体基因突变体作为显性抑作为显性抑制物影响制物影响P53功能功能致癌致癌P16,PTP多种抑癌基因多种抑癌基因WT1肾母细胞癌DCC结肠癌APC家族性腺瘤息肉癌变广义的讲广义的讲,许多在细胞繁殖中起正常作用的基因许多在细胞繁殖中起正常作用的基因,如如DNA修复基因，其突变也会导致肿瘤的发生修复基因，其突变也会导致肿瘤的发生,它们的存在间接地起到抑制肿瘤的作用它们的存在间接地起到抑制肿瘤的作用临床评价1、假阳性与假阴性2、阳性率与“金标准”3、临床实践是最重要的依据遗传病诊断地中海贫血地中海贫血：珠蛋白序列中的的十几种点突变；3-碱基特异的PCR或ASO.地中海贫血地中海贫血:16号染色体珠蛋白序列中基因簇的三种大片段缺失；每条染色体上各有两个紧密连锁的基因，故一对16号染色体上共有四个珠蛋白基因（/）缺失1个基因-+珠蛋白合成障碍性贫血缺失2个基因-0珠蛋白合成障碍性贫血缺失3个基因-HbH病缺失4个基因（全部缺失）-Hb Barts胎儿水肿综合症非缺失型珠蛋白合成障碍性贫血不终止HB constant spring遗传病诊断甲型血友病：X-连锁隐性遗传病，（长距离PCR技术）唐氏综合症（21三体）：三体形成配子期；智力低下，1/800全基因组分析法:多个具有多态性的位点进行连锁分析。生物芯片：PCR技术在HLA-DRB1基因配型中的应用：序列特异性引物PCR（SSP-PCR）：基基因因诊诊断断是是指指检检测测感感染染者者体体内内病病毒毒核核酸酸的的有有无无,或或含量多少来进行病原学诊断的一类方法。含量多少来进行病原学诊断的一类方法。病病毒毒性性肝肝炎炎基基因因诊诊断断包包括括病病毒毒基基因因种种类类及及含含量量、基因分型、亚型和变异及准种等的诊断。基因分型、亚型和变异及准种等的诊断。甲甲型型肝肝炎炎和和戊戊型型肝肝炎炎无无慢慢性性化化,且且有有较较好好的的血血清清学学诊断指标诊断指标,故一般不需进行基因诊断。故一般不需进行基因诊断。HGVHGV和和TTVTTV病毒性肝炎的基因诊断病毒性肝炎的基因诊断定定性性和和定定量量PCR：定定性性检检测测主主要要是是用用于于未未知知感感染染者者的的诊诊断断,确确定定患患者者是是否否感感染染了了肝肝炎炎病病毒毒,结结果果分别报告为分别报告为阳性阳性或或阴性阴性。定量测定：己知感染者的抗病毒治疗时动态观察定量测定：己知感染者的抗病毒治疗时动态观察疗效疗效,结果报告需以量来表示。如高出定量范围结果报告需以量来表示。如高出定量范围上限，则需对标本稀释后再测上限，则需对标本稀释后再测,低于定量范围下低于定量范围下限时限时,则报告小于则报告小于copies/ml,不能以不能以阴性阴性形形式报告。式报告。病毒性肝炎的基因诊断病毒性肝炎的基因诊断肝炎病毒甲型肝炎病毒与戊型肝炎病毒由消化道传播，引起急性肝炎，不转为慢性肝炎或慢性携带者。乙型与丙型肝炎病毒主要由输血、血制品或注射器污染而传播，除引起急性肝炎外，可致慢性肝炎，并与肝硬化及肝癌相关。丁型肝炎病毒为一种缺陷病毒戊型肝炎病毒（HEV）庚型肝炎病毒（HGV）TT型肝炎病毒（TTV）SEN型肝炎病毒（HSV）甲型肝炎病毒（hepatitisAvirus，HAV）HAV的生物学性状属小RNA病毒科，直径27nm，无包膜呈20面立体对称外面为一独立外壳，内含一个单链RNA分子HAV的电镜照片Feinstone（1973）HAV的结构HAV的致病性粪口途径传播口咽部或唾液腺中早期增殖肠道与局部淋巴结中大量增殖入血并形成病毒血症肝脏为最终靶器官（病毒直接损伤或免疫病理作用）通过胆汁随粪便排出体外HAV的免疫性HAV只存在单一的抗原抗体系统，即HAVAg和抗-HAV无论显性感染还是隐性感染均能诱生出高效价抗-HAV抗-HAVIgM阳性是甲肝的确诊依据IgM型抗体在感染后仅持续存于3-6个月IgG型抗体则可存在多年TimecourseofHAVinfectionHAV的其他生物学特性培养特性培养特性 原代肝细胞或恒河猴胚肾传代株细胞对HAV敏感，生长缓慢，不引起细胞裂解抵抗力抵抗力 比肠道病毒更耐热，601h不被灭活，100oC 5分钟可灭活 对乙醚、酸处理（pH 3）均有抵抗力 氯消毒、紫外线照射、福尔马林处理均可破坏其传染性 常见症状流感样症状厌食恶心黄疸（眼部及皮肤呈黄色）尿黄腹痛乏力微生物学检查感染早期可检测血清中的抗HAVIgM流行病学调查可检测抗HAVIgG对已接种甲肝疫苗者检测中和型抗HAV抗体直接检测抗原或用分子生物学方法检测病毒RNA乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）HBV-DNA病原学：HBV属嗜肝DNA病毒科，部分双链DNA，3200碱基对，10个亚型，序列表明不同亚型的变异为10%，同一亚型的变异为2%。检测：病原体抗原、抗体核酸临床评价：HBV的基因组结构3.2Kb不完全双链环状DNA，含4个ORF可可将将微微孔孔板板包包被被有有蛋蛋白白质质（如如亲亲和和素素或或链链霉霉亲亲和和素素、抗抗Dig-Dig-抗抗体体、牛牛血血清清白白蛋蛋白白）或或已已知知序序列列的的核核苷苷酸酸，此此为为通通用用型型活活化化微微孔孔板板，任任何何探探针针末末端端只只要要含含有有相相应应配配体体或或与与已已知知序序列列互互补补的的核核苷苷酸酸都都可可与与相相应应的的活活化化微微化化板板固固相相化化。我我们们设设计计了了HBVHBV特特异异探探针针，其其-端端含含-段段与与通通用用板板已已知知序序列列互互补补的的核核苷苷酸酸，引引物物55端端修修饰饰有有生生物物素素，HBV HBV DNA DNA PCRPCR产产物物与与固固相相化化探探针针杂杂交交后后，即即可可用用酶酶标标亲亲和和素素进进行行酶酶呈呈色色测测定定，并并证证实实其其测测定定敏敏 感感 度度 至至 少少 高高 于于 普普 通通 电电 泳泳 法法 100100倍倍。HBV DNAHBV DNA定量测定的临床意义定量测定的临床意义 为临床诊断提供更全面、精确的资料为临床诊断提供更全面、精确的资料真实、全面地反映真实、全面地反映HBVHBV感染、复制及病情变化过程感染、复制及病情变化过程 抗病毒治疗的分子水平监测抗病毒治疗的分子水平监测用用HBV DNAHBV DNA的血清浓度的变化来评价抗病毒药物的疗的血清浓度的变化来评价抗病毒药物的疗效效：荧光探针1：荧光探针2：引物：PCR扩增产物：Taq酶扩增及检测原理a a：变性，双链模板裂解成两条单链：变性，双链模板裂解成两条单链b b：退火，引物、荧光探针分别结合到单链模板的相应位点，：退火，引物、荧光探针分别结合到单链模板的相应位点，探针探针3 3端激发基团和探针端激发基团和探针5 5端的发光基团紧靠在一起，端的发光基团紧靠在一起，发出发出640nm640nm的荧光的荧光c c：延伸，随聚合反应的进行，结合在模板上的：延伸，随聚合反应的进行，结合在模板上的2 2条荧光探针条荧光探针被替换下来。被替换下来。d d：一个循环结束，生成：一个循环结束，生成2 2条双链模板条双链模板阳性率（）阳性率（）上海上海瑞金医院瑞金医院上海市上海市传染病医院传染病医院浙医大附属浙医大附属第一医院第一医院合计合计“大三阳大三阳”标志标志100（42/42）100(38/38）100(28/28）100（108/108）“小三阳小三阳”标志标志43.9(18/41）78.9(30/38）46.4(13/28）57.0(61/107）其它其它HBV血清学血清学标志阳性标志阳性7.5（3/40）38.0(19/50）23.8（5/21）24.3(27/111）非乙肝肝病非乙肝肝病0（0/20）0（0/18）0（0/18）0（0/56）献血员献血员0（0/40）0（0/36）0（0/28）0（0/104）不同临床标本组中的不同临床标本组中的HBV DNAHBV DNA检出率检出率不同临床标本组中不同临床标本组中HBV DNAHBV DNA阳性的定量结果阳性的定量结果临床组平均病毒载量考核医院“大三阳”标志“小三阳”标志瑞金医院2.831078.80105上海传染病医院1.001071.85105浙一医院1.931071.70105合计1.781076.85105电镜下的HBVDane颗粒HBV的小球形颗粒HBV的管形颗粒 HBV的复制的复制HBV的抗原组成表面抗原HBsAgHBsAg核心抗原HBcAgHBcAg e抗原HBeAgHBeAg表面抗原HBsAg存在于三型颗粒中是HBV感染的主要标志分亚型（a,d/y,w/r,adr）产生抗-HBsPreS1、PreS2及抗-PreS1和抗-PreS2核心抗原HBcAg仅存在于Dane颗粒中不易在血液中检出可在感染的肝细胞表面存在刺激机体产生抗HBc（IgG、IgM）表明病毒在复制e抗原HBeAg仅存在于Dane颗粒中游离存在于血液中为病毒复制及强传染性的指标产生抗HBe，是预后良好的征象HBV的其它生物学性状培养黑猩猩动物模型、鸭动物模型用分子生物学技术的细胞培养成功抵抗力抵抗力强于HAV对低温干燥紫外线耐受不被70乙醇灭活100 10分钟可灭活HBV的致病机制免疫低下：HBsAg无症状携带者病毒变异：逃逸免疫细胞介导的免疫损伤：为主免疫复合物性的免疫损伤：肝外损伤自身免疫反应的免疫损伤：肝特异性脂蛋白抗原HBV的传染机制传染源 主要传染源是患者或无症状HBsAg携带者传播途径 密切接触 血液及体液 母婴传播 不严格集体预防接种、药物注射 针刺、文身等乙型肝炎的特点我国约有40%-60%人群曾受到过HBV的感染表现急性乙肝的仅占0.1%-1%，亚临床30%-75%，慢性乙肝1%-5%，乙肝病毒携带7%-20%)急性乙肝如治疗不彻底，10%患者可转为慢性乙肝乙肝五项及HBV DNA的临床意义HBsAg、抗HBsHBeAg、抗HBe抗HBc（HBcAg）HBVDNA乙乙型型肝肝炎炎病病毒毒抗抗原原,特特别别是是表表面面抗抗原原,在在血血液液中中的的浓度较高浓度较高,现症现症HBV感染感染明确诊断。明确诊断。仅仅抗抗HBc单单项项阳阳性性,也也可可在在血血清清中中检检测测到到 HBV DNA乙型肝炎的诊断往往不需要进行病毒核酸的检测。乙型肝炎的诊断往往不需要进行病毒核酸的检测。抗抗病病毒毒治治疗疗时时,血血清清中中的的病病毒毒核核酸酸含含量量是是反反映映病病毒毒数数量量和和复复制制活活跃跃程程度度最最可可靠靠的的直直接接指指标标、动动态态观观察察药药物物疗疗效效的的确确切切指指标标,特特别别是是对对于于HBeAg阴阴性性患者。患者。预防及免疫控制传染源，切断传播途径人工自动免疫：疫苗（血源性、基因工程)人工被动免疫：高效价人血清球蛋白（HBIg）丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus）HCV的生物学性状4060nm球形有包膜单正链RNAHCV的基因结构丙型肝炎的特点我国丙肝病毒携带者的比例在2%-5%随着年龄的增长，丙肝病毒携带率亦增高易感人群感染HCV后，慢性化的比例高达50%以上乙肝患者容易重叠HCV感染HCV的诊断及预防检查病毒RNA检测抗HCV因HCV免疫原性不强及变异，目前尚无可用疫苗HCV-RNAHCV是引起输血后肝炎主要致病因子，因为血中HCV含量仅为HBV的千分之一，加之其免疫学标志仅有抗-HCV一项，至今HCV分离尚不成功，其检测较HBV困难得多，因此分子生物学方法在此应用显得格外重要。丙型肝炎基因诊断及意义丙型肝炎基因诊断及意义 结果判断结果判断结果判断结果判断抗HCV(+)伴ALT，或已排除其他肝炎的慢性肝炎，可诊断为丙肝。抗HCV(+)，ALT N。必须检测到HCV-RNA(+)（定性）才诊断丙肝。丙型肝炎基因诊断及意义丙型肝炎基因诊断及意义 结果判断结果判断结果判断结果判断抗HCV(-)，临床怀疑丙肝。应做HCV-RNA二次定性或有一次定量(+)，可诊断为丙肝。常见于免疫功能低下或缺陷、少数儿童和老人。急性丙肝抗HCV检出率为50%-90%，应检测HCV-RNA。抗病毒药用治疗必须用定量PCR检测反映药物疗效。HCV-RNA病原学：单链正股RNA 病毒基因组长度10KB，为一个连续的ORF，包含多个结构区和非结构区的蛋白基因。HCV变异及其亚型：序列变异率在3.2-28%之间,不同国家和地区分离的毒株基因差异很大,同一患者在不同时期分离的毒株也有变异.HCV基因组分为I-IV型和若干亚型.定量检测HCVRNA:1.可用于急性丙肝的早期诊断,在HCV阳性之前2.可作为HCV感染有无传染性的指标3.作为抗病毒疗效的指标HCV的生物学性状4060nm球形有包膜单正链RNAHCV的致病性与免疫性传播途径似HBV是引起输血后慢性肝炎和肝硬化的主要原因潜伏期：4-8周无症状HCV携带者和慢性丙肝者多见诱发肝外损伤：肾小球肾炎 免疫力不牢固丙型肝炎的特点我国丙肝病毒携带者的比例在2%-5%随着年龄的增长，丙肝病毒携带率亦增高易感人群感染HCV后，慢性化的比例高达50%以上乙肝患者容易重叠HCV感染HCV的诊断及预防检查病毒RNA检测抗HCV因HCV免疫原性不强及变异，目前尚无可用疫苗HCV的诊断及预防丙型肝炎病毒：中国普通人群抗抗体的阳性率为32%全世界约17亿人感染了目前除了干扰素()或其与利巴韦林联合应用对部分患者有一定疗效疫苗研究：由于包膜糖蛋白2中和性抗原位点存在高变区1(1)进展甚微抗原表位：线性表位、空间表位。如果以特异抗原表位：线性表位、空间表位。如果以特异性抗体对化学合成的随机噬菌体多肽库进行筛性抗体对化学合成的随机噬菌体多肽库进行筛 选选,则很难筛则很难筛选到与原始的抗原序列完全一致的序列选到与原始的抗原序列完全一致的序列,而是获得大量与原而是获得大量与原始抗原序列完全不同的多肽片段。这种一级结构序列与原始始抗原序列完全不同的多肽片段。这种一级结构序列与原始抗原不同抗原不同,又保留其抗原反应性的抗原表位又保留其抗原反应性的抗原表位,称为模拟表位称为模拟表位()。从其结构而言。从其结构而言,模拟表位多数是构象模拟表位多数是构象表位表位(),即即空间表位。空间表位。噬菌体表面展示技术的建立和应用促进了抗原模拟表噬菌体表面展示技术的建立和应用促进了抗原模拟表位的研究。国外学者应用噬菌体表面展示技术筛选获得了位的研究。国外学者应用噬菌体表面展示技术筛选获得了不同的结构和非结构蛋白抗原的模拟表位。这些研究结不同的结构和非结构蛋白抗原的模拟表位。这些研究结果首先在免疫学理论上阐明了抗原果首先在免疫学理论上阐明了抗原 抗体分子之间相互对应抗体分子之间相互对应的多样性的问题的多样性的问题,同时由于模拟表位的抗原性较强同时由于模拟表位的抗原性较强,且具有广且具有广谱性谱性,因此因此,在新型诊断试剂和广谱疫苗的研究中具有重要的在新型诊断试剂和广谱疫苗的研究中具有重要的应用前景。应用前景。HCV的诊断及预防丙型肝炎病毒感染的诊断,第三代血清学检测试剂较好的敏感性和特异性,但20%患者可不出现抗体,或有的患者抗体存在时间可以很长现行感染，早期诊断因此,核酸检测在HCV感染的诊断中要比HBV感染的诊断重要得多。丁型肝炎病毒（hepatitisDvirus，HDV）HDV是一种缺