DB37∕T 4101-2020 苹果轮纹病菌快速检测方法.doc

ICS65.020.20B 16DB37山东省地方标准DB37/T 41012020苹果轮纹病菌快速检测方法Rapid detection of botryosphaeria dothidea2020 - 08 - 31发布2020 - 10 - 01实施山东省市场监督管理局发布前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省烟台市农业科学研究院。本标准主要起草人：王英姿、刘保友、汪少丽、王培松、石洁。苹果轮纹病菌快速检测方法1 范围本标准规定了用环介导等温扩增（LAMP）快速检测苹果轮纹病菌的测定方法。本标准适用于苹果叶片、枝条和果实中苹果轮纹病菌的快速检测。方法检出限：10-7ng/L苹果轮纹病菌DNA。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3 原理3.1 扩增原理根据苹果轮纹病菌的ITS序列中特异性序列设计特异性内、外引物及环引物各一对，特异性序列参见附录A。三对引物特异性识别靶标序列上的六个独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在ITS基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物，加入显色液即可通过颜色变化观察判定结果。3.2 显色液显色原理SYBR Green I是一种高灵敏度的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。LAMP：环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）ITS：内转录间隔区（Internal transcribed spacer）2Lamp Master Mix：等温扩增PCR混合液Bst酶：Bst DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase）5 试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水为GB/T 6682中规定的一级水。5.1 等温扩增PCR混合液（2Lamp PCR Master Mix1) 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。)） ：包含40mmol/L Tris-HCl、20mmol/L (NH4)2SO4、20mmol/L KC1（pH值为8.8）、16mmol/L MgSO4、2.0mmol/L dNTPs、0.2% Trion X-100。5.2 Bst DNA聚合酶：酶浓度8U/L。5.3 显色液：SYBR Green I荧光染料，1000。5.4 引物：根据苹果轮纹病菌ITS基因序列设计一套特异性引物，包括外引物1（F3），外引物2（B3），内引物1（FIP），内引物2（BIP），环引物1（LF）和环引物2（LB）。外引物扩增片段长度：189bp，引物序列见附录A。5.5 DNA快速提取液：DNA-EZ Reagents All-DNA-Fast-Out2) 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。)。5.6 甜菜碱：5mol/L。5.7 离心管：0.1mL、1.5mL。5.8 塑料研磨棒：长度70mm，研磨头外径6.2mm，研磨头长度9.5mm。6 仪器设备6.1 恒温箱：满足653、801要求。6.2 移液器：量程0.5L10L，量程10L100L，量程100L1000L。7 测定步骤7.1 试验设置7.1.1 阴性对照：采用不含有目标基因序列的苹果腐烂病菌（Valsa mali）基因组DNA为模板。7.1.2 阳性对照：采用含有目标基因序列的苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea）基因组DNA为模板，浓度应略高于方法检出限。7.1.3 空白对照：以水代替DNA模板。7.2 试样采集进行田间轮纹病菌快速检测时，切取约0.5cm0.5cm待检测的苹果组织（果实、叶片、枝条），放置于1.5 mL离心管中保存并标记。7.3 试样DNA提取7.3.1 将100L DNA快速提取液加入到盛有试样的1.5mL离心管中，用研磨棒研磨5min。7.3.2 801加热5min，如果是难以破裂的细胞和材料，则保温时间可以延长到10min30min。7.3.3 用手振荡混匀后取裂解物直接进行LAMP反应。7.4 LAMP反应步骤7.4.1 反应体系LAMP反应体系见表1。每个试样各做2个平行管。加样时应使试样DNA溶液完全加入反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1L显色液滴于反应管的管盖内侧，盖管盖时应尽量小心，防止显色液混合进入反应液中。这样试样扩增反应后不必开盖即可观察颜色变化。表1 LAMP反应体系组分工作液浓度加样量反应体系最终浓度外引物1（F3）10mol/L0.5L0.2mol/L外引物2（B3）10mol/L0.5L0.2mol/L内引物1（FIP）10mol/L2L0.8mol/L内引物2（BIP）10mol/L2L0.8mol/L环引物1（LF）10mol/L1L0.4mol/L环引物2（LB）10mol/L1L0.4mol/LLamp PCR Master Mix212.5L1Bst DNA聚合酶8U/L0.5L0.16U/L甜菜碱5mol/L4L0.8mmol/LDNA模板-1L-水-补足至25.0L-7.4.2 反应过程653恒温扩增60min，801持续10min使酶灭活，反应结束。7.4.3 显色反应反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在正常光照条件下于黑色背景（如黑布、黑色纸板）下进行颜色观察。阴性对照：反应管中液体呈橙色。阳性对照：反应管中液体呈绿色。空白对照：反应管中液体呈橙色。7.5 防污染措施环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T 27403中附录D规定。8 结果判定8.1 待测样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性，不携带苹果轮纹病菌。8.2 待测样品2个平行样反应管中液体至少一管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阳性，携带苹果轮纹病菌。8.3 若与上述条件不符，则本次检查结果无效，应更换试剂按本方法重新检测。AA附录A （资料性附录）苹果轮纹病菌ITS基因特异性序列A.1 苹果轮纹病菌ITS基因特异性序列（accession no.MN559436.1）1 ATTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAAGC61 TCTGCTTGGTATTGGGCACCGTCCTTTGCGGGCGCGCCTCAAAGACCTCGGCGGTGGCGT121CTTGCCTCAAGCGTAGTAGAACATACATCTCGCTTCGGAGCGCAGGGCGTCGCCCGCCGG181 ACGAACCTTCTGAACTTTTCTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC注： 下划线所示部分为引物扩增匹配区段。A.2 组成引物中碱基构成外引物1（F3，5-3）：TGCCTGTTCGAGCGTCAT外引物2（B3，5-3）：TCCGAGGTCAACCTTGAGAAF1c F2内引物1（FIP，5-3）：CACCGCCGAGGTCTTTGAGGTACAACCCTCAAGCTCTGCTB1c B2内引物2（BIP，5-3）：GCGTCTTGCCTCAAGCGTAGTGTTCAGAAGGTTCGTCCGG环引物1（LF，5-3）：GGACGGTGCCCAATACCA环引物2（LB，5-3）：AGAACATACATCTCGCTTCGGAG_