DB62∕T 4625-2022 油橄榄抗寒性与抗旱性评价规范(甘肃省).pdf

ICS 65.020. 01 CCS B 05 62 准甘肃省由巳ETA 万D862/T 4625-2022 油橄榄抗寒性与抗旱性评价规范2022一09-16发布2022 -10-20实施甘肃省市场监督管理局发布0862/T 4625-2022 目次前言. II I 范围. . . . . . . . . 1 2 规范性引用文件. . . . . . . . . . . 1 3 术语和定义. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 抗寒性评价. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 抗旱性评价. . . 2 附录A(规范性)油橄榄抗寒性与抗旱性生理生化指标测定方法.4 I 油橄榄抗寒性与抗旱性评价规范范围本文件规定了油橄榄抗寒性与抗旱性的评价指标、评价方法及排序规则。本文件适用于油橄榄适生区油橄榄树体的抗寒性与抗旱性评价。2 规范性引用文件0862/T 4625-2022 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可分的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本已包括所有的修改单)适用于本文件。DB62/T 4485 葡萄抗疼性评价规范3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 抗寒性评价4. 1 材料采集与处理4. 1. 1 材料处理。采集休眠期、露地栽培的长势良好、无有害生物的一年生枝条，长度8cmlOcm，按不同品种分别装入自封袋中，带回实验室，置于50C条件下贮藏备用。使用低温人工气候室开才枝条进行低温处理，设50C、OOC、_50C、_lOOC、-150C，共5个梯度，升温和降温幅度为5.00C!h，达到设定温度后保持l姐，之后逐步升温至50C放置8ho每个处理重复3次，每次重复随机抽取5个校段。4. 1. 2 材料采集, 摘取油橄榄植株中部且共小致的叶片，将供试叶片用蒸馆水冲洗干净，然后用滤纸将叶片上的水分吸干。每个油橄榄品种称取鲜样3份，每份。泣，将同一处理的各品种叶片用干净锡纸包好，放入自封袋中，置于超低温冰箱中，然后进行相关指标的测定。42 抗寒性评价方法油橄榄抗寒性评价宜采用隶属函数法进行。4. 3 抗寒性相关生理生化指标油橄榄抗寒性宜使用相对电导率、丙二瞪(MDA)，游离脯氨酸、可i富性糖、可i窑性蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、叶绿素等9JI)j生理生化指标进行综合评价。4.4抗寒性相关生理生化指标的测定0862/T 4625-2022 按照附录A给出的方法进行。4. 5抗寒性排序原则隶属函数计算按照DB62/T4485中给出的方法进行。按照计算的平均隶属度对不同品种油橄榄抗寒性进行排序，平均隶属度越大，表明抗寒能力越强，反之抗寒能力越弱。5 抗旱性评价5. 1 材料采集与处理5. 1. 1 材料处理设置4个处理组CK(土壤相对台水量55%)、轻度胁迫(土壤相对台水量20%25%)、中度胁迫(土壤相对台水量15%20%)、重度胁迫(土壤相对含水量1O%15%)。胁迫开始时，充分灌水，使土壤含水量达到J田间持水量水平，然后停止供水使其含水量自然下降;采用电子称称重法控制土壤含水量，予每天下午18:00称盆栽茵的质量，及时补充缺失水分使各处理达到相应的控水程度。水分胁迫处理15d后，开始测定与抗旱性相关的生理生化指标，各指标平行测定三次，取平均值。5. 1. 2 材料采集同4.1.205. 2抗旱性评价方法油橄榄抗旱性评价宜采用隶属函数法。5. 3抗旱性相关指标油橄榄抗旱性宜使用含水量指标及相对电导率、丙二自主(MDA)，游离脯氨酸、可i各l生糖、可i富性蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、叶绿素等生理生化指标进行综合评价。5.4抗旱性相关指标的测定5.4. 1 日十片含水量测定5.4. 1. 1 总含水量测定称职干旱处理并剪碎混匀的叶片Ig，迅速置于称量瓶中(提前记录称量瓶重量，标注为mO)，称量此时称量瓶的重量标注为mL，将称量瓶放进1060C的烘箱烘干20min，然后调节烘箱温度至850C烘干至称量瓶重量不再发生变化时，取出放入硅胶干燥皿中冷却至室温，然后测定称量瓶重量标注为m2，按下列方式计算水分含量(3次重复)植物总含量(0/0)二(ml-m2)/(ml-mO). (1) 5.4. 1. 2 自由水的测定称职剪碎混匀的叶片Ig，迅速置于称量瓶中(提前记录称量瓶重量，标注为mO)，记录称量瓶和样品的重量，然后在称量瓶中加入质量分数为%65%分析纯;在糖i否液3mL4mL，1在糖i吉液完全浸没2 0862/T 4625-2022 样品为准，准确称量此时称量瓶的重量。将称量瓶在室温下放置仙，期间进行这光并轻轻晃动。6h后先测定并记录原来的糖液浓度，并测定浸泡过样品后的庶糖浓度，按照下列方式计算出叶片中的自由水含量(3次重复)/ 精液原i衣度慢叶后精液的证度、自由水含量=t糖液重漫叶后的精液峨)/叶片鲜重x100% 5.4. 1. 3 束缚水含量计算按下列公式计算束缚水含量:J束缚水含量=总合:7./(量自由水含量5.4.2 抗旱性相关生理生化指标理IJ定按照附录A给出的方法进行。5.5抗旱性排序原则隶属函数计算按照DB62/T4485中绘出的方法进行。(2) (3) 按照计算的平均隶属度对不同品种油橄榄抗旱性进行排序，平均隶属度越大，表明抗旱能力越强，反之抗旱能力越弱。 3 0862/T 4625-2022 A. 1 相对电导率测定附录A(规范性)油橄榄抗寒性与抗旱性生理生化指标测定方法相对电导率测定采用浸泡法快速称取鲜叶3份，每份。19，分别置于IOmL去离子水的刻度试管中，盖上玻璃塞置于室温下浸泡处理l姐，用电导仪测定浸提液电导值(Rl)，然后沸水浴加热30min，冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导值(R2)，按公式Al计算电解质生出率(Ofo)。相对电导率二RlIR2xlOO%(Al) A. 2 丙二醒(MDA)含量测定采用硫代巴比妥酸CTBA)法测定MDA含量。取低温及干旱处理后叶片，剪碎，混匀后，每次称取0.2g，每个品种重复3次。加入处理并剪碎的叶片、19石英彤、和10%三氯乙酸(TCA)2mL在冰浴研钵中，研磨成匀浆，再加3mLlO皂角的TCA一同转入离心管中，在4川叩m下离心lOmin，取上清液2mL(对照加2mL蒸馆水)，加入2mL0.6% TBA摇匀。将试管放入沸水浴中煮沸IOmin(自试管中i否液出现小气泡开始计时)，取出试管以冷水浴迅速将试管内i百液冷却，在3000rpm下离心1Omin ，使用分光光度计分别测定上请液在450nm、532nm和Onm波长的光度值(对照为2mL0.6%TBA窑液加2mL蒸馆水)，依据公式A2计算MDA的含量(阳ol/gFW.)。LEMumokgFW1)二6.45x (A532-A600)-O.56 x A450 x VlI(V2 xFW) . (A2) 式中Vl -t!取液总体积，单位为毫升(mL)FW 样品鲜重，单位为克(g)V2 测定用提取液体积，单位为毫升(mL)0 A. 3 游离脯氨酸含量测定采用部三酣比色法测定。加入低温及干旱处理并剪碎的叶片和3%磺基水杨酸i百液5mL于具塞试管中，在j弗水浴中封口显色提取lOmin，冷却后取滤液2mL，加入2mL冰醋酸和2mL酸性部三酣显色液，水浴中煮沸显色30min，冷却后加入5mL甲苯萃取红色物质，待完全分层后，取上层红色甲苯i窑液，测定520nm波长的吸光值(以甲苯为对照)。并根据标准曲线和公式A3计算出脯氨酸含量(flg/g)。脯氨酸含量(ug/g)(CxV/ A)/FW (A3) 式中C 由标准曲线上查得的游离脯氨酸的含量，单位为微克(flg)V 提取液总体积，单位为毫升(mL)A 测定时加样量，单位为毫升(mL)FW 样品重，单位为克(g)。A.4 可溶性糖含量测定A. 4. 1 l!f.糖标准曲线制作取6支试管，编号，按表l配制每管含量为。阳100陆的庶糖标准液。加入表中试剂后，向各管沿管壁迅速加入惠酣试剂65mL，并立即摇动使混合均匀，置试管架上室温下显色，冷却后倒入比色杯，以4 0862/T 4625-2022 。号管作空白对照，在620nm波长处，以多点校准总量法，制作标准曲线。庶糖标准液的配制应符合表Al的规定。表A.1 l!f.糖标准液的配制管号试剂。l 2 3 4 5 糖标准母液ImL。0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸t自水ImL2.5 2.3 2.1 1.9 1.7 1.5 每管糖含量lf1g。20 40 60 80 100 A.4.2 可溶性糖含量测定采用惠酣比色法口入低温及干旱处理并剪碎的叶片和蒸馆水IOr直L于具塞试管中，封口后沸水浴30min，取出冷却，过滤转入100mL容量瓶中，用蒸馆水多次冲洗残渣后定容至刻度，再取lmL稀释至5mL。在另一试管中加入待测液lmL和惠酣试剂4mL，弗水浴中显色lOmin，取出冷却，并测定620mn波长的吸光度C4mL惠酣试剂加lmL蒸恼水作对照)。依据标准曲线和公式A升计算可熔性糖含量(川。可溶性糖含量(%)二(CxVl)/WxlO)xlOO%(A4) 式中C 白标准曲线上查得的可i在性糖含量，单位为微克(町，Vl 提取液总体积，单位为毫升CmL)FW 样品重，单位为毫克Cmg)。A.5 可溶性蛋白含量测定称取油橄榄叶片0.5g，剪碎，放入预冷的研钵，加入液氮迅速研磨后，转入离心管中，加入5mLTris-HCl, 5Or min-1下离心15min，取上清液005mL，加入蒸馆水0.45mL.考马斯亮蓝25mL，重复3次，反应2min后，在595mn处测定吸光值，按公式A5计算蛋白质含量:可溶性蛋白含量(mgxg-1)二(CxVt)/(lOOO x Vs xFW) (A5) 式中C 从标准曲线查的可i在性蛋白含量，单位为微克Cflg);Vt 样品提取液的总体积，单位为毫升CmL);Vs 测定时样晶体积，单位为毫升C!nU。A.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定取准备好的油橄榄碎叶片0.5g子预冷的研钵中，加lmL预冷的磷酸缓冲液，冰浴下研磨至匀浆，加缓冲液使最终体积定容为5mLo取2mL否液于10rpm转速下离心20min，上清液即为SOD粗提液。使用氮蓝囚略CNBT)法进行显色反应，至反应结束后，以不照光的对照做空白，子波长560mn处分别测定各样品的吸光度，按公式A6求出SOD活性。SOD总活性二(AOx AS) x Vt/(O.5AO x W x Vl) (A6) 式中SOD 总活性为l个酶活性单位每克(U/g);AO 为照光对照管的光吸收值;5 0862/T 4625-2022 AS 为样品管的光吸收值，Vt 为样液总体积，单位为毫升(mL)V1 为测定时的样品用量，单位为毫升(mL)W 为样品重量，单位为克(g)。A. 7 过氧化氢酶(CAT)活性的测定使用2.8mLCAT反应液加上。1mL酶提取液，在240nm波长下比色，以240nm每分钟光吸收值减少。01，为一个酶活性单位。CAT反应液:。如此30%的H202，1.0mL的水，1.5mL的0.2mo1!L且pH为7日的磷酸缓冲液。按公式A7计算CAT活性。CAT活性叫g.min)FW二(L1A240 x Vt)/(W x V) (A7) 式中L.A240 反应时间内吸光度数值的变化;V 测定时的酶液体积，单位为毫升(mL)Vt 酶液总体积，单位为毫升(mL)W 叶片鲜重，单位为克(g)。A. 8 过氧化物酶OD)活性的测定称职O.3g洗净并剪碎的油橄榄叶片，冰浴条件下加入磷酸缓冲液研磨至匀浆，在5000rpm转速下离心1Omin ，将上清液移入10mL容量瓶中，将残渣用5mL磷酸缓冲液再提取一次，上清液为粗酶液，放入容量瓶定容存放于低温下备用。在光径1cm比色杯中加入反应混合液3mL和磷酸缓冲液lmL，作为对照，另l只中加入反应混合液3mL和上述酶液1mL，立即开启秒表记录时间，子分光光度计上测量波长470nm下吸光度值，每隔lmin读数一次，根据吸光度来计算酶活性，计算公式见A80POD活性u/(g.min)二(M470 xVt)/(WxVs xO.Ol xt) (A8) 式中L.A470 反应时间内吸光度数值的变化;Vs 测定时所用酶液体积，单位为毫升(mL)t 为反应时间，单位为秒(s)Vt 提取酶液的总体积，单位为毫升(mL)W 样品重量，单位为克(g)。A. 9 叶绿素含量的测定取新鲜油橄榄叶片，擦净表面尘土，去中脉剪碎。称取0.2g碎片，加少量石英砂和3mL的95%乙醇，放入研钵研成均浆，再加lOmL乙醇，研磨至变白，静置3min5min。将提取液过滤后倒入漏斗，用少量乙醇冲洗后全部洗入容量瓶中。最后用乙醇定容至100mLo取叶绿体色素提取液在波长663nm、645nm和440nm处测定OD值，按照公式A9A12计算叶绿素含量(mg/g)。6 Ca(吨L)二12.71xD削-2.59xD削(A9)Cb(mglL)二22.88x因45-4.67x D663 .(A 1 0) CT(mglL)二Ca+口).(A11)D862月4625-2022叶绿素含量=(CTxO.Ol川N (A.12) 式中:W一一样品重量，单位为克Cg); D刷一-663nm处的吸光值;D剧一一-645nm处的吸光值。7