流式细胞仪.ppt

第十一章 流式细胞技术与流式细胞仪概述 流式细胞仪的定义:流式细胞仪是以激光为光源，集流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。流式细胞术的定义:应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞术。1934年Moldavan 使悬浮的血红细胞从一个毛细玻璃管中流过，每个通过的细胞可被一个光电装置记录下来，这可谓流式细胞仪的最初模型。1965年Kamentsky用紫外吸收和可见光散射两个参数同时测量未染色的细胞，给出了细胞中核酸的含量和细胞大小，奠定了多参数流式细胞测量的基础。1967年Van Dilla 和Los Alamos采用了CroslandTaylor设计的层流流动室和氩离子激光器开发出了液流束、照明光轴，检测系统三者互相垂直的流式细胞仪，成为目前各种流式细胞测量仪的基础。1969年Fulwyler利用Sweet的静电墨水喷射液滴偏转技术，建立了流式细胞分选术。Ehrlich和Wheeless利用飞点扫描技术和缝扫描技术使零分辨率的流式细胞仪变成了低分辨率的流式细胞仪。80年代以来，流式细胞仪的数据采集、存储、显示、分析日趋完善，随着样品制备方法的增多，新的荧光染料和细胞标记物的出现，流式细胞仪的应用范围逐渐扩大。进入90年代，标本制备仪和自动进样器的问世，以及适合临床应用的单克隆抗体的增加，使流式细胞仪不仅出现在大专院校和科研单位，它也逐渐进入医院的中心实验室和检验科。第一节 流式细胞仪的工作原理一、生物学颗粒分析原理n流式细胞技术是在单细胞水平上，对于处在快速直线流动状态中的大量细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术，现已成为现代医学研究最先进的分析技术之一。应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行快速的、多参数的定量分析和分选的技术称为流式细胞技术。生物学颗粒包括大的免疫复合物、DNA、RNA、蛋白质、病毒颗粒、脂质体、细胞器、细菌、霉菌、染色体、真核细胞、杂交细胞、聚集细胞等，所检测的生物颗粒的理化性质包括细胞大小、细胞形态、胞浆颗粒化程度、DNA含量、总蛋白质含量、细胞膜完整性和酶活性等。将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放人样品管。在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，染色的细胞受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，与水平方向的激光束垂直相交，染色的细胞受激光照射后发出荧光，这些信号分别被光电倍增管荧光检测器和光电二极管散射光检测器接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。1.样品的进入流动室：将悬浮分散的单细胞悬液，经特异荧光染料染色后，放人样品管。在气体压力的作用下，悬浮在样品管中的单细胞悬液形成样品流垂直进入流式细胞仪的流动室，沿流动室的轴心向下流动。2.鞘液的作用：流动室轴心至外壁的鞘液也向下流动，形成包绕细胞悬液的鞘液流，鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束，自喷嘴的圆形孔喷出，与水平方向的激光束垂直相交，相交点称为测量区。3.信号的产生与接收：染色的细胞在测量区受激光照射后发出荧光，同时产生光散射。这些信号分别被光电倍增管和光电二极管接收，经过计算机储存、计算、分析这些数字化信息，就可得细胞的大小和核酸含量等指标。n在压电晶体上加上频率为30kHz的信号，使液柱断裂成一连串均匀的液滴。当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内，从而达到细胞分类收集的目的。二、流式细胞仪细胞分选原理 当某类细胞的特性与要分选的细胞相同时，流式细胞仪就会在这类细胞形成液滴时给含有这类细胞的液滴充以特定的电荷，带有电荷的液滴向下落入偏转板间的静电场时，依所带电荷的符号分别向左偏转或向右偏转，落入指定的收集器内。第二节 流式细胞仪的分类和基本结构一、流式细胞仪的分类流式细胞仪根据功能不同可分为临床型和科研型。n临床型只有分析功能，没有分选功能，操作简便，易学易掌握。n科研型既有分析功能又有分选功能，可快速将所感兴趣的细胞分选出来。流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。n前者的光斑直径大于被检细胞体积，只能提供细胞内某种生物化学成分的参数。n狭缝扫描流式细胞仪被检细胞直径大于激光光斑直径，可计算出细胞直径大小、核直径大小、核浆比例等一系列的形态学信息的定量资料。狭缝扫描流式细胞仪 被检细胞直径大于激光光斑直径，细胞通过光束时各部分被依次扫描。流式细胞仪的结构可分为流动室及液流驱动系统；激光光源及光束成形系统；光学系统；信号检测与存贮、显示、分析系统；细胞分选系统等五个部分。二、流式细胞仪的基本结构（一）流动室与液流驱动系统流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。样品流在鞘流的环包下形成聚焦，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。由右图可知，空气泵产生压缩空气，通过鞘流压力调节器加在鞘液上一恒定的压力，这样鞘液以匀速运动流过流动室，在整个系统运行中流速是不变的。（二）激光光源与光束成形系统 激光是一种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照。由于细胞的快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1s左右，且细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。由于激光焦点处能量分布为正态分布（见图），中心处能量最高。因此，当样本速率选择高速时，处在样本流不同位置的细胞或颗粒，受激光照射的能量不一样，从而被激发出的荧光强度也不相同。（三）光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和小孔组成。滤光片主要分为：1.长通滤光片 长通滤光片使特定波长以上的光通过。2.短通滤光片 特定波长以下的光通过。3.带通滤光片 带通滤光片允许一定波长范围内的光通过（四）信号检测与分析 当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射区时，细胞内不同物质产生不同波长的荧光信号。这些信号以细胞为中心，向空间360度立体角发射，产生散射光和荧光信号。1.散射光信号 射光分为前向角散射和侧向角散射，散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色)，称为细胞的物理参数（或称固有参数）。（1）前向角散射 前向角散射与被测细胞的大小有关（2）侧向角散射 侧向散射光可提供细胞内精细结构和颗粒性质的信息。2.荧光信号 当激光光束与细胞正交时，一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号，称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，通过对这类荧光信号的检测和定量分析能了解所研究细胞的性质和数量。2.荧光信号 （1）荧光信号线性测量和对数测量线性放大器的输出与输入是线性关系，细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。在细胞膜表面抗原等的荧光检测时通常使用对数放大器。（2）荧光信号的面积和宽度荧光信号的面积是采用对荧光光通量进行积分测量，一般对DNA倍体测量时采用面积，这是因为荧光脉冲的面积比荧光脉冲的高度更能准确反映DNA的含量。荧光信号的宽度常用来区分双连体细胞。（3）光谱重叠的校正 当细胞携带两种荧光受激光激发而发射两种不同波长的荧光时，理论上可选择滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测，但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然它们之间发射峰值各不相同，但发射谱范围有一定的重叠。从右图中可以看出，阴影为探测器检测光谱的范围，FITC探测器会探测到少量的PE光谱，而PE探测器则检测到较多的FITC光谱。图中点A通过透镜f成像在A处，而点B通过透镜f成像在B处。在光电倍增管前放上一小孔，作为空间滤波器，排除其它杂散光信号，从而确保了A点光源进不了B点处，B点光源也进不了A点处。（五）细胞分选器1小水滴的形成压电晶体带动流动室振动，液流形成水滴。喷嘴的振动频率即每秒钟产生水滴的数目。当喷嘴直径为50m时，信号频率为40kHz，则每秒钟产生4万个水滴。若每秒钟流出的细胞是1000个，则平均每40个水滴中只有一个水滴是有细胞的，其他皆为空白。2逻辑电路 为了分选细胞，需要细胞在经过测量区时判断出哪个细胞满足了分选的条件，并产生一个逻辑信号，此信号驱动充电脉冲发生器，使之产生充电脉冲。3水滴的充电与偏转 当水滴从流束上将要断开时给整个流束充电，则水滴从流束上断开后便带有同极性的多余表面电荷。下落的水滴通过一对平行板电极形成的静电场时，带正电荷的水滴向带负电的电极板偏转，这样就可用容器收集水滴。（六）FCM测量数据的存贮、显示与分析 目前FCM数据的存贮的方式均采用列表排队(List Mode)方式。目前FCM所采用的都是多参数指标，荧光标记物参数数量在逐渐增多。采用List Mode方式可大量节约内存和磁盘容量。第三节 流式细胞仪的主要性能指标一、荧光测量灵敏度 灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标。一般以能检测到单个微球上最少标有FITC或PE荧光分子数目来表示，现在的FCM均可达到检测小于100个荧光分子的指标。二、仪器的分辨率 分辨率是衡量仪器测量精度的指标，通常用变异系数CV(Coefficient of Variation)值表示：(是分布的标准误差，是分布的平均值)或三、前向角散射光检测灵敏度 前向角散射光检测灵敏度是指能够检测到的最小颗粒大小，一般目前商品化的FCM可以测量到0.20.5m左右。四、FCM分析速度 分析速度以每秒分析的细胞数来表示。当细胞流过光束的速度超过FCM仪器响应速度时，细胞产生的荧光信号就会丢失，这段时间称为仪器的死时间。死时间越短，仪器处理数据越快，一般可达到30006000个/秒左右。大型机已达到每秒几万个细胞。五、FCM分选指标 分选指标主要包括分选速度、分选纯度和分选收获率。分选速度指每秒可提取所要细胞的个数。分选纯度指要分选的目的细胞占分选出细胞的百分比。分选收获率指被分出的细胞与原来溶液中该细胞的百分比。第四节第四节 流式细胞仪应用的技术要求流式细胞仪应用的技术要求 流式细胞分析仪器是一项集多学科知识综合应用的复杂仪器，除了对仪器各方面性能指标有严格的要求以外，在实验设计与样品处理方面也需要有丰富的基础理论及操作经验。一、检测样品制备的重要性 因为流式细胞仪测量的是每个细胞所产生的散射光和荧光信号，如果两个或多个细胞间粘连重叠或细胞碎片过多，都会影响信号的收集及所收集信号的真实性，所以制备单细胞悬液是进行流式细胞仪分析最关键的第一步。二、常用的荧光染料与标记染色 散射光信号是激光照在细胞上所产生的前向光和侧向光信号。荧光信号来自于细胞的自发荧光或被分析细胞经特异性荧光标记染色后通过激光束激发后所产生的。因此，被分析细胞在制备成单细胞悬液后，经过与荧光染料染色后才能上机进行检测。n焦宁Y与异硫氰酸荧光素（FITC，530nm）分别是RNA与蛋白质的特异性染料；n碘化丙啶（PI，620nm）与FITC双染可测知单个细胞内DNA与蛋白质量的变化；n丫啶橙（AO，488nm）染色法不仅可测定单个细胞DNA与RNA含量，还可区分出G0与G1期细胞；n若丹明123（rhodamin 123）是线粒体特殊染料。三、流式细胞仪操作技术的质量控制 在临床检测中，应对各个工作环节和仪器性能进行严格的质量控制和规范化操作，以保证各项检测数据和指标的可靠性。1光路与流路校正 主要目的在于确保激光光路与样品流处于正交状态，使仪器检测时的变异减少到最小，从而控制仪器的CV值。在流路校正物中，有标准大小的荧光微球，其物理性质、生物学特性和化学特性均经过标定。2PMT校准 流式细胞仪在使用过程中，光电倍增管随时间的增加，其放大功率会有所改变，对样品检测的灵敏度会产生影响。为保证样品检测时仪器处于最佳工作状态，采用质控品进行PMT校准，必要时进行电压补偿。3绝对计数的校准 为保证仪器在计数时的准确性，仪器应采用绝对计数标准品建立绝对计数标准。该标准品是经标定的，如以计算1000个细胞为1ml，作为设定标准。在样本测定时，以此为标准进行绝对计数，从而获得绝对计数的标准值。第五节 FCM的维护及常见故障的排除 一、仪器的维护1.激光电源的波动范围应小于10%。2.冷却水须用过滤器，并保证压力和流量。3.室温在1824，相对湿度小于85%。4.安装单独的可靠的地线。5.仪器操作必须有经过培训的人员操作。6.样品和鞘液管道每周应用漂白粉液清洗。故障信息 引起故障的原因 解决方法 清洗液高度错误 清洗液少了 加清洗液 清洗液高度警示 清洗液传感器失灵 与公司联系 数据处理速率错误 数据太大，难以处理 稀释样品 文件名错误 输入的文件名与系统冲突 输入另一个文件名 二、常见故障及排除故障信息 引起故障的原因 解决方法 存取数据时发生错误 流式细胞仪不能存取数据 关开计算机重试 程序错误 软件不能执行该程序 选择主菜单上的重建项 程序号太大 程序号不能大于32 取消一些程序，再输入相应号码 没有激光束 激光器关闭 检查电源，开激光器 故障信息 引起故障的原因 解决方法 激光器开启错误 激光器门打开 关激光器门 参数太多 选择的参数应小于8个 取消某些参数，重新选择 参数不存在 程序中无此参数 重新建立程序 故障信息 引起故障的原因 解决方法 样品压力错误 因为样品管坏了，样品不能被压入流动室 换一个样品管 建立样品压力错误 流式细胞仪连接错误 检查连接，开关机重试 鞘液高度错误 鞘液太少 补充鞘液 第六节 流式细胞仪的临床应用一、流式细胞仪在免疫学中的应用 流式细胞术广泛地应用于免疫理论研究及其临床实践，所以有人称之为现代免疫技术基石之一。尤其同单克隆抗体的结合应用，在淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞功能分析、免疫分型、分选、肿瘤细胞的免疫检测、研究细胞周期等方面都起着相当重要的作用。n淋巴细胞及其亚群分析n如当人类感染免疫缺陷病病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)后，HIV主要选择地侵入人类具有重要免疫功能的T淋巴细胞亚群中的辅助性T细胞，即Th细胞(CD4)，使具有重要免疫功能的T细胞群被破坏，继而累及全身免疫器官，使机体免疫功能下降。检测的免疫指标表现为：T淋巴细胞总数减少(正常值的65%81%)；T细胞亚群比值倒置，即Th/Ts1.0(正常1.3122.11)；Th细胞(CD4)绝对计数200个/L(正常值4001 500细胞/L)，CD8 T细胞在感染早期增多，后期则下降；Ts细胞增高，NK细胞减少或活力下降，B淋巴细胞群则在正常范围；CD4/CD8 明显低于健康成人(P0.01)。n n利用流式细胞仪，采用多色荧光标记的单克隆抗体，分析利用流式细胞仪，采用多色荧光标记的单克隆抗体，分析黏附性黏附性T T 细胞表面细胞表面CD3CD3 CD4CD4 或或CD8CD8CD19CD19CD16CD16CD45ROCD45ROCD62CD62CD27CD27 CD57 CD57 抗原，从而对抗原，从而对LFA1adhesive LFA1adhesive T T 细胞快速准确地测定。细胞快速准确地测定。n白血病免疫分型n白血病是白细胞在分化到某个阶段受阻后呈克隆性异常增殖的结果，它的发病是多阶段的，不同病因引起的白血病的发病机制不同，在治疗和预防上也不同，所以，利用白细胞分化不同阶段出现的细胞表面标志，可以对白血病进行免疫分型，对其进行导向治疗。n应用流式细胞仪四色荧光标记技术，CD45/SSC双参数散点图设门方法，能清楚地区分各种免疫细胞，可准确、客观地进行白血病免疫分型。n血小板膜表面受体检测n血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥其功能的物质基础，静止期和活化期的血小板膜糖蛋白受体的种类、含量、结构和功能显著不同。应用流式细胞仪检测血小板膜上受体，主要是对血小板特异性膜糖蛋白和活化标志物进行免疫荧光标记，结合单克隆抗体和免疫荧光技术，用不同的抗血小板单克隆抗体，可以从分子水平上诊断血小板功能和数量的异常。n细胞因子的检测n细胞因子(cytokine)是由免疫细胞或非免疫细胞合成和分泌的小分子多肽，在调节机体多种细胞的生长、分化和功能，调节正常与病理状态下的免疫应答过程中起着十分重要的作用。n应用流式细胞仪结合间接免疫荧光法，可在单细胞水平上客观、正确地检测细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群，进行多参数相关分析，是一种有效地在单细胞水平研究细胞因子的方法。二、流式细胞仪在血液学中的应用 血液病多为肿瘤性、免疫性和遗传性疾病，恶性血液病约占其总数一半以上。FCM在血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等方面应用广泛。n用于血液/肿瘤细胞增殖动力学研究n细胞经DNA荧光染料标记后，FCM可测定单个细胞DNA的含量，并描绘出DNA图形，经软件处理可计算出G0/G1、S、G2/M各细胞周期细胞所占的百分比。依据增殖指数可了解群体细胞的增殖活力。n通过染色，不仅可了解血/肿瘤细胞的增殖状况，更可用于化疗药物作用机制的探讨，从而将其区分为增殖周期特异性、非特异性药物，以及周期时相特异性、非特异性药物，以便更合理的配伍联合化疗方案，预测肿瘤细胞对药物的敏感性等。三、流式细胞仪在细胞生物学中的应用 细胞生物学研究中，应用最频繁也最普通的是细胞周期分析，研究细胞周期或DNA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系，包括细胞周期各时相的百分比和细胞周期动力学参数的测定等内容。对同一细胞的参数测定技术则导致了对细胞周期的一些新发现，典型的方法是吖啶橙双染色技术。四、流式细胞仪在肿瘤学中的应用 近年来荧光细胞化学技术的发展，以及荧光探针标记的单克隆抗体，为流式细胞技术研究各种肿瘤抗原、肿瘤蛋白、致癌基因开辟了新途径，极大地提高了肿瘤学的研究水平，并为流式细胞技术在肿瘤学的研究中开辟了更广阔的应用前景。五、FCM对自身免疫性疾病HLA抗原的分析 利用FCM可以进行HLAB27HLAB7双标记抗体检测HLAB27阳性细胞，同时又可排出交叉反应。通常5897的强直性脊柱炎患者可检出这种抗原，而正常人仅27可检出这种抗原。FCM检测HLAB27快速、特异、敏感，为强制性脊柱炎的临床诊断提供了有力的帮助。六、流式细胞仪在药物学方面的应用流式细胞仪在检测药物在细胞中的分布，研究药物的作用机制方面应用广泛。亦可用于筛选新药，如化疗药物对肿瘤细胞的凋亡机制，可通过测DNA凋亡峰，Bcl2凋亡调节蛋白等进行观察。