浅析细菌内毒素检测方法及常见问题.ppt

浅析细菌内毒素检测方法及常见浅析细菌内毒素检测方法及常见问题问题 内内 容容细菌内毒素简介细菌内毒素简介细菌内毒素检测方法细菌内毒素检测方法常见问题及解决方案常见问题及解决方案一、细一、细 菌菌 内内 毒毒 素素 简简 介介主要内容主要内容 来源来源 特性特性 与热源的关系与热源的关系 在药检中应用在药检中应用主要来源主要来源 主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖，溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖，这是一种大分子物质，分子量约为这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径约，其粒径约在在1 5纳米纳米。细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含内毒素的量为含内毒素的量为1至至100EU/ml。主要特性主要特性（实验器材处理方法）（实验器材处理方法）1.1.耐热性耐热性 一般在一般在100加热加热1小时无影响，小时无影响，120加热加热4小时能破坏小时能破坏98，180200干热干热2小时或小时或250干热半小时干热半小时才能完全破坏。才能完全破坏。故故：注射剂的一般灭菌条件是不能破坏内毒素的。注射剂的一般灭菌条件是不能破坏内毒素的。2.2.不耐酸碱性不耐酸碱性 内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡主要特性主要特性（实验器材处理方法）（实验器材处理方法）3.3.水溶性与不挥发性水溶性与不挥发性 热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。故：不可用湿热灭菌法处理实验器具故：不可用湿热灭菌法处理实验器具主要特性主要特性（去除内毒素方法）（去除内毒素方法）4.4.滤过性滤过性 原体积很小，约在原体积很小，约在1 15 nm5 nm之间，故能通过除菌之间，故能通过除菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不能滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不能通过半透膜。通过半透膜。5.5.吸附性吸附性 能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有一定的电荷，因而可被某些离子交换介质吸附。一定的电荷，因而可被某些离子交换介质吸附。热原热原=内毒素内毒素？热热原原指指微微生生物物产产生生的的某某些些多多糖糖蛋蛋白白复复合合物物等使人体发热的物质，等使人体发热的物质，不不仅仅仅仅是是细细菌内毒素。菌内毒素。但但在在药药检检的的范范畴畴，细细菌菌内内毒毒素素是是主主要要的的热热原原物物质质，可可以以说说无无内内毒毒素素就就无无热热原原，控控制制内内毒毒素就是控制素就是控制热热原原。热原检查方法简介热原检查方法简介 中中国国药药典典热热原原检检查查方方法法是是采采用用家家兔兔升升温温法法进进行检查。行检查。将将一一定定剂剂量量的的供供试试品品，静静脉脉注注入入家家兔兔体体内内，在在规规定定时时间间内内，观观察察家家兔兔体体温温升升高高的的情情况况，以以判判定定供供试试品中所含热原的限度是否符合规定。品中所含热原的限度是否符合规定。热原检查法与热源对比内毒素检查法优势与热源对比内毒素检查法优势方便、快捷、经济；方便、快捷、经济；重现性好、灵敏度高；重现性好、灵敏度高；避免抗原的产生，克服生物测定的误差；避免抗原的产生，克服生物测定的误差；近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热源近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热源法法在药检中的应用在药检中的应用 细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法，细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法，已经广泛的被世界各国药典收载。已经广泛的被世界各国药典收载。成品检查成品检查药品安全性检查之一药品安全性检查之一 半成品（生产过程）检查半成品（生产过程）检查事前质控手段，避事前质控手段，避免造成药品成批报废免造成药品成批报废二、二、细菌内毒素检测方法细菌内毒素检测方法中国药典中国药典批准使用方法批准使用方法：供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。但当测供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。但当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。本节将着重介绍凝胶法的操作与有关原理。本节将着重介绍凝胶法的操作与有关原理。测定 方法凝胶法 光度测定法 浊度法 显色基质法 鲎试剂与内毒素反应机理内毒素C因子活化的C因子凝胶B因子 凝固酶原凝固酶活化的B因子凝固蛋白原鲎凝血系统酶联反应名词解释名词解释1鲎及鲎试剂鲎及鲎试剂鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物 门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一带。带。鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物，能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体外检测内毒素的敏感试剂。外检测内毒素的敏感试剂。名词解释名词解释2国家标准品及工作标准品国家标准品及工作标准品国家标准品：国家标准品：（单位：（单位：EU/mlEU/ml）自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价；的效价；工作标准品：工作标准品：经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符复核、干扰试验及各种阳性对照；复核、干扰试验及各种阳性对照；名词解释名词解释3细菌内毒素检查用水细菌内毒素检查用水凝胶法：凝胶法：内毒素含量小于内毒素含量小于0.015EU/ml0.015EU/ml的灭菌注射用水；的灭菌注射用水；故：灭菌注射用水故：灭菌注射用水细菌内毒素检查用水细菌内毒素检查用水 光度法：光度法：内毒素含量应小于内毒素含量应小于0.005EU/ml0.005EU/ml；细菌内毒素检测之凝胶法细菌内毒素检测之凝胶法实验程序实验程序1、试验准备：试剂、仪器及用具、试验准备：试剂、仪器及用具2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度3、鲎试剂灵敏度复核、鲎试剂灵敏度复核4、供试品干扰试验（新药或新方法）、供试品干扰试验（新药或新方法）5、供试品细菌内毒素凝胶法检测、供试品细菌内毒素凝胶法检测实验材料及用具实验材料及用具1、仪器、仪器名称名称要求要求天平天平感量感量0.1mg0.1mg以下以下电热干燥箱电热干燥箱300300恒温水浴箱恒温水浴箱37371 1 水银或酒精温度计水银或酒精温度计100 100 1 1 漩涡混合器漩涡混合器/计时器计时器60min60min1min1min2、器具器具分类器具分类器具名称器具名称反应试管反应试管玻璃试管（外径玻璃试管（外径1075mm）、试管架、）、试管架、小三角瓶或磨口瓶小三角瓶或磨口瓶移液器具移液器具刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头其他其他酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、封口膜、记号笔封口膜、记号笔试剂试剂1 1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号2 2、内毒素工作标准品、内毒素工作标准品3 3、内毒素检查用水、内毒素检查用水4 4、7575乙醇乙醇常用英文缩写常用英文缩写BETBET：细菌内毒素检查：细菌内毒素检查 BETBET水水：细菌内毒素检查用水：细菌内毒素检查用水 MVDMVD：供试品最大有效稀释倍数：供试品最大有效稀释倍数 NCNC：阴性对照：阴性对照MVCMVC：供试品最低有效浓度：供试品最低有效浓度 PCPC：阳性对照：阳性对照：鲎试剂灵敏度：鲎试剂灵敏度 L L：供试品细菌内毒素限值：供试品细菌内毒素限值灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度复核。复核。目的目的是为了是为了对试剂、检测者的操作、环境条件、水平对试剂、检测者的操作、环境条件、水平条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。试验举例：内毒素工作标准品为试验举例：内毒素工作标准品为90EU/支；支；待测鲎试剂灵敏度待测鲎试剂灵敏度0.25EU/ml0.25EU/ml。1 1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用7575酒精擦拭后启开，酒精擦拭后启开，加加1mlBET1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min15min后进行稀释，步骤如下后进行稀释，步骤如下(箭头下方为加入箭头下方为加入BETBET水量水量)：90EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml0.2ml1.6ml0.2ml1.8ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml0.2ml0.2ml1ml1ml1ml1ml水水溶解后的标准品水水水水90EU/ml10EU/ml1EU/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml（2）（）（0.5）（0.25）2 2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为、溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml0.1ml装量，则取装量，则取1818支，每支加入支，每支加入0.1mlBET0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于水溶解；若鲎试剂装量大于0.1ml0.1ml，则取若干支，则取若干支，按标示量加入按标示量加入 BETBET水溶解，再取水溶解，再取0.1ml0.1ml分装于标准玻璃试管分装于标准玻璃试管（10mm10mm75mm75mm），将试管按如下形状排列。），将试管按如下形状排列。3 3、加样：每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶液各、加样：每列每支加入相应浓度的内毒素标准品溶液各0.1ml0.1ml，第五列加入，第五列加入BETBET水水0.1ml0.1ml。12230.540.25BET水22220.50.50.50.50.250.250.250.25反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动混匀，置混匀，置37 水浴中保温水浴中保温60602min2min，将每管拿出缓缓，将每管拿出缓缓倒转倒转180180，凝胶不变形为，凝胶不变形为“”，凝胶不能保持完，凝胶不能保持完整为整为“”。当当2.02.0四支管都为阳性，四支管都为阳性，0.25四支管都为阴性时，四支管都为阴性时，试验成立，按下面底公式计算复核的灵敏度试验成立，按下面底公式计算复核的灵敏度c c：c clglg-1-1(X/4)(X/4)（X:X:反应终点浓度的对数值。）反应终点浓度的对数值。）当当0.5c c 2.02.0时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测时时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测时仍以标示灵敏度仍以标示灵敏度为准。为准。左侧管旋转左侧管旋转180凝胶不能保持完整为阴性，记为凝胶不能保持完整为阴性，记为“”；右侧管旋转；右侧管旋转180180凝胶不变形为阳性，记为凝胶不变形为阳性，记为“”。举例：举例：设待复核的鲎试剂标示灵敏度设待复核的鲎试剂标示灵敏度为为0.125EU/ml0.125EU/ml:平行平行管数管数内毒素标准溶液浓度（内毒素标准溶液浓度（EU/mlEU/ml）NCNC反应终反应终点浓度点浓度C CX X(lgC)(lgC)0.250.250.1250.1250.060.060.030.031+-0.06-1.22-1.222+-0.125-0.903-0.9033+-/0.125-0.903-0.9034+-/0.125-0.903-0.903clg-1(X/4)lg-1（-1.22）（-0.903）（-1.22）（-1.22）/4 0.104（EU/ml）c在0.52.0范围内，符合规定。方法学验证方法学验证供试品干扰预试验供试品干扰预试验目的：目的：确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强），确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强），得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍数，为正式干扰实验提供依据。数，为正式干扰实验提供依据。影响因素：影响因素：新药检查方法建立；新药检查方法建立；鲎试剂批号或来源的改变；鲎试剂批号或来源的改变；检品生产工艺，配方，成分的改变；检品生产工艺，配方，成分的改变；检品关键成分来源的改变；检品关键成分来源的改变；方法学验证方法学验证供试品干扰预试验供试品干扰预试验供试品溶液的最大稀释倍数的计算 MVDCL/L:供试品的内毒素限值；C：供试品溶液的浓度；当L以 EU/ml表示时，C为1ml/ml;当L以EU/mg或EU/u表示时，C的单位为mg/ml或u/ml(注意：当L以EU/ml表示时，C的值不是样品的浓度，就是1)。方法学验证方法学验证供试品干扰预试验供试品干扰预试验内毒素限值内毒素限值(L)的确定的确定 药典附录有相应计算公式，即当今世界各国普遍药典附录有相应计算公式，即当今世界各国普遍采用的细菌内毒素计算公式，即：采用的细菌内毒素计算公式，即：L=K/M，式中，式中K为按规定给药途径，人每公斤体重每小时可以为按规定给药途径，人每公斤体重每小时可以接受的不产生任何不良反应的细菌内毒素剂量接受的不产生任何不良反应的细菌内毒素剂量（亦称致热阈），它基本上是一固定值，药典上（亦称致热阈），它基本上是一固定值，药典上对每一给药途径的对每一给药途径的K值都有具体的规定。值都有具体的规定。M为按规为按规定的给药途径，人每公斤体重每小时给药的最大定的给药途径，人每公斤体重每小时给药的最大剂量。这一个值的确定实际上才是计算限值的关剂量。这一个值的确定实际上才是计算限值的关键。键。方法学验证方法学验证供试品干扰预试验供试品干扰预试验（1）原则上一般根据药品使用说明书或国家药典）原则上一般根据药品使用说明书或国家药典委员会编制的委员会编制的临床用药须知临床用药须知来确定最大剂量。来确定最大剂量。如儿童用药剂量大于成人用药剂量，则以儿童剂如儿童用药剂量大于成人用药剂量，则以儿童剂量为准。量为准。（2）为保证安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗）为保证安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品药品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值药品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的的1/2或或1/3。方法学验证方法学验证供试品干扰试验供试品干扰试验 目的：目的：验证预干扰中确定的浓度或倍数下的供验证预干扰中确定的浓度或倍数下的供 试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。试验方法：试验方法：须选择两家以上的鲎试剂进行试验须选择两家以上的鲎试剂进行试验 编编号号内毒素内毒素浓浓度度/配制配制内毒素的溶内毒素的溶液液稀稀释释用液用液稀稀释释倍数倍数所含内毒所含内毒素的素的浓浓度度平行平行管数管数A A无无/供供试试品溶液品溶液2 2B B2/2/供供试试品溶液品溶液供供试试品溶液品溶液1 12 24 48 822110.50.50.250.254 44 44 44 4C C2/2/检查检查用水用水检查检查用水用水1 12 24 48 822110.50.50.250.254 44 44 44 4D D无无/检查检查用水用水2 2方法学验证方法学验证供试品干扰试验供试品干扰试验结果判定：结果判定：如果有供试品和无供试品测得的鲎试剂灵敏度（如果有供试品和无供试品测得的鲎试剂灵敏度（c）均在均在0.5-2.0范围内时，则认为供试品在该浓度下不干范围内时，则认为供试品在该浓度下不干扰试验，否则需要对供试品做适当处理。扰试验，否则需要对供试品做适当处理。干扰的排除：干扰的排除：对供试品进行更大倍数的稀释；对供试品进行更大倍数的稀释；选择灵敏度更高的鲎试剂；选择灵敏度更高的鲎试剂；其他适宜的方法其他适宜的方法 如过滤、中和、透析或加热处理等排除干扰。如过滤、中和、透析或加热处理等排除干扰。供试品细菌内毒素凝胶法检测供试品细菌内毒素凝胶法检测 检测方法：检测方法：结果结果 判定判定 阴性阴性 阳性阳性 阳性阳性 阴性阴性编编号号内毒素内毒素浓浓度度/配制内毒素的配制内毒素的溶液溶液平行管数平行管数 A A无无/供供试试品溶液品溶液2 2 B B2/2/供供试试品溶液品溶液2 2 C C2/2/检查检查用水用水2 2 D D无无/检查检查用水用水2 2 注：A 无干扰浓度供试品溶液；B 供试品阳性对照；C 阳性对照；D 阴性对照。三、常见问题及解决方案三、常见问题及解决方案1、实验前未复核鲎试剂产品的灵敏度、实验前未复核鲎试剂产品的灵敏度 鲎试剂灵敏度的改变或质量不符合要求，会影响实验鲎试剂灵敏度的改变或质量不符合要求，会影响实验结果，因此实验前应复核鲎试剂产品的灵敏结果，因此实验前应复核鲎试剂产品的灵敏2、实验器具的洁净度不符合要求、实验器具的洁净度不符合要求 一般用硫酸清洁液浸泡，用自来水冲洗干净，再用新一般用硫酸清洁液浸泡，用自来水冲洗干净，再用新鲜蒸馏水冲洗三道，并干热（鲜蒸馏水冲洗三道，并干热（250）恒温）恒温1h即可。即可。实验用的玻璃器具必须严格无菌无热原，建议不要使实验用的玻璃器具必须严格无菌无热原，建议不要使用一次性塑料制品。用一次性塑料制品。3、实验条件达不到要求、实验条件达不到要求 实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室，实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室，应备有一台超净工作台。应备有一台超净工作台。4、温度不符合要求、温度不符合要求 实验室温度为实验室温度为252较好，恒温水浴箱温度为较好，恒温水浴箱温度为371为宜为宜。5、忽视样品本身干扰、忽视样品本身干扰 供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要原用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要原则是则是不能影响供试品中的内毒素生物活性不能影响供试品中的内毒素生物活性。(1).(1).供试品稀释法供试品稀释法 MVD=CL/MVD=CL/鲎试剂灵敏度鲎试剂灵敏度()()越高越高(数值越小数值越小)，供试品的稀释，供试品的稀释倍数倍数越大，干扰越小。越大，干扰越小。(2).(2).物理方法物理方法 如加热法如加热法(血液制品血液制品)、冷析法、冷析法(甘露醇甘露醇 )(3).(3).化学方法化学方法 如调节如调节PHPH值值(奎诺酮类奎诺酮类)、调节金属离子、调节金属离子(血液保养血液保养液、液、FDP)FDP)(4).(4).生物方法生物方法 如抗增液的使用，阻断如抗增液的使用，阻断G G因子反应，防止假阳性；因子反应，防止假阳性；(5).(5).其它方法其它方法 如过滤法、溶剂抽提等如过滤法、溶剂抽提等 6 6、鲎试剂浓度达不到要求、鲎试剂浓度达不到要求 开开启启内内毒毒素素标标准准品品和和鲎鲎试试剂剂时时，要要将将粘粘附附在在安安瓿瓿壁壁上上的的粉粉末末尽尽可可能能地地弹弹落落下下去去。用用砂砂轮轮划划过过安安瓿瓿后后，要要用用酒酒精精棉棉（最最好好能能用用沾沾异异丙丙醇醇的的无无纺纺布布，以以避避免免产产生生假假阳阳性性结结果果）擦擦拭拭，防防止止开开启启时时玻玻璃璃屑屑落落入入安安瓿瓿内内。开开启启内内毒毒素素标标准准品品时时，要要在在安安瓿瓿曲曲颈颈上上部部，并并尽尽可可能能保保留留较较长长的的安安瓿瓿颈，准确加入颈，准确加入1.0ml1.0ml鲎试验用水复溶。鲎试验用水复溶。7 7、细菌内毒素混合不均匀、细菌内毒素混合不均匀（1 1）.内毒素工作标准品溶解后要在旋涡混合器混合内毒素工作标准品溶解后要在旋涡混合器混合1515分钟，以后的每一步稀释前要至少混合分钟，以后的每一步稀释前要至少混合3030秒，秒，其它国家药典也有类似要求；其它国家药典也有类似要求；（2 2）.具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布。不按要求进行旋涡混合器混合会使所稀释的内分布。不按要求进行旋涡混合器混合会使所稀释的内毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照毒素效价偏低，造成灵敏度标示偏高、阳性对照不凝等不正确的实验结果。不凝等不正确的实验结果。振荡前振荡后内毒素分子在水溶液中的状态8 8、对灵敏度标示值的误解、对灵敏度标示值的误解 如如=0.06EU/ml=0.06EU/ml，实实际际上上表表示示的的灵灵敏敏度度=0.0625EU/ml=0.0625EU/ml，这这样样写写是是为为了了简简便便。稀稀释释过过程程中中一一定定要要按按照照=0.0625EU/ml=0.0625EU/ml来来稀稀释释，否则，会对实验结果有影响。否则，会对实验结果有影响。9 9、保温过程中受到振动、保温过程中受到振动 在在 保保 温温 过过 程程 中中 要要 注注 意意 不不 要要 振振 动动，以以 免免 因因 振振 动造成假阴性结果。动造成假阴性结果。