药物代谢-LCMS在药物分析中的应用-代谢产物鉴定-PPT.ppt

药物代谢 LCMS在药物分析中的应用-代谢产物鉴定质谱技术与诺贝尔奖If the periodic table is the“alphabet”of chemistry,then molecules are“words”,and chemical reactions and interactions are“sentences”.One important tool to observe the language of chemistry is liquid chromatography/mass spectrometry(LC/MS).2质谱原理简介 v质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的棒图就是我们常见的质谱图。常见术语v质荷比质荷比:离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/z(mass-to-charge ratio).v峰峰:质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰.v离子丰度离子丰度:检测器检测到的离子信号强度.v基峰基峰:在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰.v总离子流图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素总离子流图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素离子离子质谱质谱检测回答分析化学中最常见的问题n定性-样品中有什么?n定量-样品中有多少?MS:Mass Spectrometry6大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点可以互相讨论下，但要小声点质谱仪的特点真空系统样品入口检测器数据系统质量分析器离子源大气 atmospheric pressure ionizationn离子源 离子生成n质量分析器 离子分离n检测器 离子收集 8真空对质谱有何重要性？低真空高真空带电离子带电离子检测器检测器气体分子9v离子源10色谱-质谱联用技术接口（离子化方法）GC/MS LC/MS 电子轰击离子化 EI 化学电离离子化 CI正化学电离离子化 PCI负化学电离离子化 NCI大气压离子化 API:atmospheric pressure ionization电喷雾离子化(ESI:electrospray ionization)大气压化学电离离子化(APCI:atmospheric pressure chemical ionization)大气压光电电离(APPI:atmospheric pressure photo ionization)11电喷雾离子化（ESI）过程12大气压化学离子化（APCI）过程13ESI和APCI离子化方式对比1.生成离子的方式不同：ESI：液相离子化；APCI：气相离子化2.样品兼容性ESI：极性化合物和生物大分子APCI：非极性，小分子化合物（相对ESI而言），热稳定，具有挥发性3.流速兼容性ESI-0.001到1ml/minAPCI-0.2到2ml/min4.ESI的适用范围要远远大于APCI5.复杂样品分析时，APCI相对于ESI不易受到基质效应影响14哪种离子化方式？15v质量分析器16质量分析器离子阱质量分析器(Ion trap,IT)四极杆质量分析器(Quadrupole,Q)飞行时间质量分析器(Time-of-flight,TOF)扇形磁场和静电场(Sector,E&B)傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)真空区工作真空区工作电场或磁场（控制离子的运行轨道）电场或磁场（控制离子的运行轨道）根据根据m/z不同，实现离子分离不同，实现离子分离17 空间上串联质谱 全扫描 选择离子监测(SIM)产物离子扫描 选择反应监测(SRM)母离子扫描 中性丢失扫描 定量分析三重四极杆串联质谱仪（triple-quadrupole,tandem MS）四极杆18四级杆质量分析器Resolution：Low,unit Mass range:25-2000 uScan speed:4000 u/sec maxVacuum requirement:10-4 10-5 Torr 19质量分析器性能指标M.Holcapek et al./J.Chromatogr.A 1259(2012)3 15分辨率：是指质谱仪分开相邻质量数离子的能力，一般定义是：对两个相等强度的相邻峰，当两峰间的峰谷不大于其峰高10%时，则认为两峰已经分开，其分辨率为 其中m1和m2为质量数，且m1m2故在两峰质量数差别越小时，要求仪器分辨率越大20Resolution exampleQ1 要鉴别化合物A(m/z为235.1077，C12H14N2O3)和B(m/z为235.0713，C11H10N2O4)两个峰，仪器的分辨率至少是多少？21离子阱质量分析器（IT）时间上串联质谱 全扫描 选择离子监测(SIM)产物离子全扫描 选择反应监测(SRM)多级全扫描（n=3 10)定性分析22离子阱质谱仪（IT）Resolution：Low,unitMass range:4000 uScan speed:4000 u/secVacuum requirement:10-3 Torr 23四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF)杂交质谱 全扫描 选择离子监测 产物离子扫描 准确分子量测定（元素组成）生物大分子检测 定性分析24Resolution：highMass range:unlimitedScan speed:106 u/sec Vacuum requirement:10-7 Torr or greater 飞行时间质谱仪 25v质谱扫描模式26扫描模式 Full Scan（全扫描）MS ModeQ1Q2Q3Full scan(Q1)Full scan(Q3)=scanned;=selected m/z;blank=complete transmission可获得丰富的谱图信息复杂样品中成分鉴定27扫描模式 母离子扫描MS ModeQ1Q2Q3Precursor Scan=scanned;=selected m/z;=CID适合于含有相同局部结构（碎片离子）的一类化合物的鉴定28扫描模式 产物离子扫描MS ModeQ1Q2Q3Product Ion Scan=scanned;=selected m/z;=CID适合于化合物官能团分析以及化合物的结构解析29扫描模式 中性丢失MS ModeQ1Q2Q3Neutral Loss Scan=scanned;=scanned with offset;=CID选择性获取丢失某一固定碎片的化合物信息（鉴定二相结合代谢物）30扫描模式 SIM（选择离子监测）MS ModeQ1Q2Q3Selected ion monitoring(SIM)(Q1)Selected ion monitoring(SIM)(Q3)=scanned;=selected m/z;blank=complete transmission当全扫描无法满足灵敏度的要求时适合于基质不是很复杂的样品的定量分析31扫描模式 SRM/MRM（选择/多级反应监测）MS ModeQ1Q2Q3Selected/Multiple reaction monitoring(SRM/MRM)=scanned;=selected m/z;=CIDSRM&MRM适合于较脏、基质复杂的样品，提高选择性和灵敏度定量分析32质谱图的样子?33质谱图的样子(APCI/ESI+)34质谱图的样子(APCI/ESI+)35质谱图的样子(APCI/ESI+)36质谱图的样子(APCI/ESI+)37质谱图的样子(ESI+)38质谱图的样子(APCI/ESI)39质谱图的样子(APCI/ESI)(B)M H,M-H+CH3COOH 40软电离模式常见前体离子类型41 质谱图和色谱图?42色谱图?如果我们注意这个区域如果我们注意这个区域.1.251.501.752.002.252.502.753.003.25Time50100%TIC43色谱图-放大在此的细微观察是由许在此的细微观察是由许多点组成的多点组成的.2.122.142.162.182.202.222.242.262.28Time78100%TIC44质谱图 每个点相对于质量分析器每个点相对于质量分析器的一个扫描的一个扫描(质谱图质谱图).60801001201401601802002202402602803000100%24024145色谱图上的质谱图每个点有一张唯一的每个点有一张唯一的质谱图质谱图46数据观察-色谱图v样品运行中的每秒我们可获得一张或数张质谱图v通常是把检测到的离子叠加在一起获得一个唯一的总的数值v这些总的数值然后排列在一起(点对点)产生一个总离子流色谱图(TIC).47总离子色谱图(total ion current,TIC)每次扫描加和所有的离每次扫描加和所有的离子得到子得到.48数据观察-色谱图v 我们也能显示单个离子的色谱图和质谱图v 这让我们得到一个化合物的信息49数据观察-选择离子色谱图TIC图上显示的两个接近的流图上显示的两个接近的流出峰，每个峰是具有不同质出峰，每个峰是具有不同质谱指纹的不同化合物谱指纹的不同化合物.11.0012.00Time0100%TIC1.57e550数据观察-选择离子色谱图100200300400500600m/z0100%254.2194.2507.3334.3399.7100200300400500600m/z0100%194.2580.4402.2226.2460.211.0012.00Time0100%TIC1.57e551分离共流出物峰10.5011.0011.5012.0012.50Time0100%0100%0100%254.235.81e4194.206.14e4TIC1.57e5m/z 254m/z 194TICExtracted ion chromatogram(XIC or EIC)52选择离子色谱图o筛选离子能给出更好的信噪比n消除背景影响n分离共流出物峰o筛选离子也能用于:色谱峰的跟踪准确定量53数据观察-选项v 总离子流色谱图（TIC）观察所有可见峰的最好方法v 选择离子色谱图（XIC）观察某一化合物的最好方法54LC/MS不同扫描方式全扫描总离子流色谱图 从TIC图中提取离子色谱图 产物离子扫描色谱图 选择离子监测色谱图选择反应监测色谱图m/z 100-500m/z 298 from TICMS2 of m/z 298SIM m/z 298SRM m/z 298 18055vLC/MS在药物代谢研究中的应用56药物代谢研究常用的分析技术v放射性同位素分析 代谢物追踪；组织分布；质量平衡v液相色谱-串联质谱分析 代谢物发现和表征；多级质谱；高分辨质谱v核磁共振分析 代谢物对照品结构解析57LC/MS/MS成为药物代谢研究的主要工具生物样品定量分析生物样品定量分析LC/MS/MS-三重四极杆LC/UV,免疫分析,其他技术代谢物鉴定代谢物鉴定LC/MS/MS-三重四极杆-离子阱-高分辨 MSNMR 和其他技术58药物代谢产物鉴定一般流程产生代谢物分离代谢物检测代谢物 药物 体外孵化（肝细胞、微粒体、重组酶）；生物样品（动物或人用药后）提取和纯化代谢物，例如通过沉淀蛋白、液液提取、固体萃取和微透析与空白样品色谱对照，检测LC/MS总离子色谱或HPLC/UV色谱中新出现的色谱峰通过中性丢失和前体离子扫描以及通过特征离子检测可能的代谢产物采用LC/高分辨质谱，通过MDF或背景扣除筛选可能的代谢产物液相色谱-放射活性检测器，检测放射标记的代谢产物59表征代谢物药物代谢产物鉴定一般流程比较母体药物和代谢产物的产物离子质谱通过MS/MS或MSn检测结构特征性离子通过测量准确质量确定代谢产物的分子式组成互补性质谱分析（正、负离子切换；不同的电离源）获得代谢产物对照品（合成、体外代谢孵化、微生物转化、生物样品分离提取等）比较色谱保留时间和质谱特征Kostiainen R,Kotiaho T,Kuuranne T,Auriola S.Liquid chromatography/atmospheric pressure ionization-mass spectrometry in drug metabolism studies.J.Mass Spectrom.2003;38:357372.60代谢反应质量变化C-羟基化+16环氧化+16N-氧化+16N-羟基化+16S-氧化+16/+32P-氧化/羟基化+16/+17甲基化+14乙酰化+42双键还原、羰基还原+2杂原子（O,N,S）去甲基-14氧化脱硫-32葡萄糖醛酸结合+176硫酸结合+80谷胱甘肽结合+305/+307甘氨酸结合+57谷氨酰胺结合+145牛磺酸结合+107代谢产物分子量变化61阿比朵尔人体内代谢产物鉴定n阿比朵尔是已经上市的广谱抗病毒药物 n预防和治疗流行性感冒药，通过抑制流感病毒脂膜与宿主细胞的融合而阻断病毒的复制62代谢实验方法 n两名健康男性志愿者口服2粒阿比朵尔胶囊(200 mg)，收集服药前和服药后024 h尿样n部分尿样通过葡萄糖醛酸苷酶水解分析仪器nAgilent 1200 HPLC systemnAgilent 6300 LC/MSD Trap XCT ultranWaters Acquity UPLCnWaters Q-TOF Synapt MS阿比朵尔代谢产物鉴定63阿比朵尔的一级质谱图（离子阱质谱仪）64阿比朵尔的二级质谱(m/z 477)-45 Da-18 Da-44 Da65-44 Da-109 Da阿比朵尔的三级质谱(m/z 477 432)66-109 Da-28 Da-79 Da阿比朵尔的四级质谱(m/z 477 432 388)67-44 Da-28 Da阿比朵尔的四级质谱(m/z 477 432 323)68阿比朵尔的质谱解析BrNOHBrNOSOH+NNOSOBrHONOSONOSOHOBrNSOHOBrHNHOBrOONOCH2OHOBrNBrSOHH+NSOHOHNCH2OHOBrHNCH2OHOBrH+.NCH2OHOBrHNBrCH2OHH+NHOBrOOm/z 477m/z 459+m/z 432+m/z 432+m/z 388+m/z 294+.m/z 323m/z 279m/z 360+m/z 309-(CH3)2NH-45-H2O-18-44-C6H5S-109-C8H10S-138-C6H5S-109-CO-28-Br-79m/z 294+.m/z 279-CH3CHO-44-CH3CH2-29+-CH3-15m/z 264-CO-28m/z 251.-CH3CHO.+69通过全扫描质谱分析，检测到17个代谢物，包括5个一相代谢物和12个二相代谢物，它们都含有79Br/81Br同位素模式 M1 m/z 463(14 Da)M2 m/z 493(+16 Da)M3 m/z 479(+16 14 Da)M4 m/z 509(+32 Da)M5 m/z 495(+32 14 Da)鉴定人尿中阿比朵尔代谢产物70阿比朵尔及其代谢物的液相色谱和多级质谱数据71Metabolite identification of arbidol in human urine by the study of CID fragmentation pathways using HPLC coupled with ion trap mass spectrometryYuya Wang,Xiaoyan Chen,Qiang Li and Dafang ZhongnAgilent 1200 HPLC systemnAgilent 6300 LC/MSD Trap XCT ultraWang YY,Chen XY,Li Q,Zhong DF.J Mass Spectrom,2008UPLC-Q/TOF MS鉴定人体内阿比朵尔代谢物v仪器：Acquity超高效液相色谱系统及Synapt Q-TOF质谱仪（美国Waters公司）。vUPLC-UV条件：Acquity UPLC BEH C18(2.150 mm,1.7 m)梯度洗脱。紫外检测波长316 nm。vQ/TOF 质谱条件：ESI源，正离子检测，喷雾电压为3.0 kV；雾化气流量800 L/h，去溶剂温度350oC；离子源温度100oC；MSE高能量扫描时Transfer CE为15 ev，Trap CE为1530 eV；低碰撞能量时Transfer CE为2 ev，Trap CE为3 eV。Metabolynx parameters 受试者尿中阿比朵尔代谢物谱-葡萄糖醛酸酶水解前31种代谢物M0-葡萄糖醛酸酶水解后M6M0阿比朵尔及其代谢物对照品阿比朵尔阿比朵尔砜N-去甲基阿比朵尔砜4-羟基阿比朵尔阿比朵尔亚砜N-去甲基阿比朵尔亚砜阿比朵尔的质谱裂解规律477.082-109 Da-44 Da-45 Dam/z 432.022m/z 388.001m/z 278.989M+H+/M+H+2+阿比朵尔亚砜的质谱裂解规律-125 Da493.078m/z 368.075 M+H+/M+H+2+阿比朵尔及其代谢物对照品的质谱裂解规律-125 Da-125 Da阿比朵尔阿比朵尔砜N-去乙基阿比朵尔砜4-羟基阿比朵尔阿比朵尔亚砜N-去乙基阿比朵尔亚砜阿比朵尔硫酸酯-80 Da-176 Da阿比朵尔葡萄糖苷酸结合型代谢产物鉴定80受试者血浆和尿中阿比朵尔的代谢产物阿比朵尔在人体内代谢途径阿比朵尔及其代谢物的质谱断裂特点n作为化学键均裂的结果，阿比朵尔及其代谢物有共同的断裂模式，这种断裂生成奇电子离子，失去自由基 n阿比朵尔、N-去甲基阿比朵尔、阿比朵尔砜、N-去甲基阿比朵尔砜的质谱裂解特点是：首先丢失甲胺(45 Da),然后丢失乙醛(44 Da),再丢失苯硫自由基(109 Da)n具有亚砜结构的代谢物，首先断裂苯亚磺酰基自由基(125Da)，然后丢失甲胺(45 Da)和乙醛(44 Da).83阿比朵尔结合型代谢物的质谱断裂特点n阿比朵尔、N-去甲基阿比朵尔、阿比朵尔砜、N-去甲基阿比朵尔砜结合型代谢物的质谱裂解特点是：首先丢失SO3（80 Da）或葡糖醛酸（176 Da）n具有亚砜结构的代谢物，首先断裂苯亚磺酰基自由基（125 Da），然后丢失SO3（80 Da）或葡糖醛酸（176 Da）84结论n液相色谱的良好分离是鉴定代谢产物的必要条件n多级质谱提供了丰富的结构信息n高分辨质谱提供的准确分子量信息有助于代谢产物的快速鉴定n鉴定代谢产物结构还需要 合成或分离代谢物对照品核磁共振光谱 酶水解深入理解药物代谢反应和质谱裂解规律85