细胞工程的理论基础与应用.pptx

细胞工程的理论基础与应用 原代细胞培养原代细胞培养 (primary culture)细胞培养的分类细胞培养的分类 传代细胞培养传代细胞培养 (secondary culture,subculture)培养细胞形态分类培养细胞形态分类粘附型粘附型:附着在培养得固相支持物表面才能生长;绝大多数细胞属于此类型,包括 上皮细胞、成纤维 细胞、多角形细胞等悬浮型悬浮型:不必附着于固相支持物表面,可在悬浮状态下 生长;如白细胞、巨噬细胞Lifespan of cultured human cellsSenescence(M1)Crisis(M2)细胞工程得理论基础与应用细胞工程得理论基础与应用 一、细胞工程得概念w细胞工程(Cell Engineering)指以细胞为对象,应用生命科学理论,借助工程学原理与技术,有目得地利用或改造生物遗传性状,以获得特定得细胞、组织产品或新型物种得一门综合性科学技术。w细胞工程一般指以动植物为研究对象,可以就是完整得细胞、组织或器官、胚胎,也可以就是原生质体、细胞核、染色体、细胞器等。w细胞工程与基因工程、酶工程、微生物工程、生物化学工程、蛋白质工程、代谢工程一起构成了现代现代生物工程技术体系生物工程技术体系。生物工程技术体系及其发展关系w细胞生物学就是细胞工程得重要理论基础,此外,遗传学、分子生物学、发育生物学、生物化学等也就是细胞工程得理论基础。细胞工程与其她学科、技术得关系二、细胞工程得发展历史w细胞工程得发展经历了探索期、诞生期探索期、诞生期、快速发展期快速发展期12大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流 1665年年英英国国物物理理学学家家Robert Hooke(胡胡克克、虎虎克克)发发现现了了第第一一个个植植物物细细胞胞,称之为称之为“CellCell”(小室小室)。细胞得发现细胞就是生命得基本单位细胞就是生命得基本单位;一切动物和植物都由细胞组成一切动物和植物都由细胞组成;德国植物学家德国植物学家 Schleiden(施莱登施莱登,1838年年)植物发生论植物发生论 德国动物学家德国动物学家 Schwann(施旺施旺,1839年年):关于动植物得结构和生长一致性关于动植物得结构和生长一致性得显微研究得显微研究细胞学说得诞生Matthias Jacob SchleidenTheodar SchwannRudolf Virchow 1855 德国人R、Virchow 提出 “一切细胞来源于已有得细胞”得著名论断;进一步完善了细胞学细胞学说说。Cell Theory就是19世纪得重大发现之一,基本内容三条:有机体就是由细胞构成得;细胞就是构成有机体得基本单位;新细胞来源于已存在细胞得分裂。w1885年,Roux发现鸡得神经元在生理盐水中可以存活,并使用“组织培养”一词。w1892年,Driesch利用海胆细胞胚胎分离成单细胞,通过细胞培养获得了完整幼虫。w1907年,美国学者Harrison使蝌蚪神经组织离体培养存活了数周,且生长出神经纤维,开创了动物组织培养先河。探索期探索期w1902年,德国植物学家Haberlandt提出细胞全能性细胞全能性学说,并尝试进行植物单个细胞离体培养。w1937-1938年,Went、Gautheret、Nobercourt几乎同时成功离体培养胡萝卜组织,成为植物组织培养得奠基人。w1958年,Steward和Reinert发现胡萝卜得体细胞可分化成体细胞胚,这成为植物组织培养领域得一个重大突破,同时也验证了细胞全能性学说。w1959年,美籍华人科学家张明觉首次获得第一个体外受精动物-试管兔。w1962年,Capstick成功进行了仓鼠肾细胞得悬浮培养,为动物细胞大规模培养技术奠定基础。w1958年-1965年,初步建立病毒诱导下得动物细胞融合技术。w1960年,兰花无性繁殖成功。w1960-1970年,建立聚乙二醇诱导植物原生质体融合技术。诞生期诞生期w1972年,Carlson通过诱导烟草原生质体融合,获得世界上第一个体细胞杂种植株。w1973年,农杆菌Ti质粒得发现,极大促进了植物转基因得研究,并推动了利用转基因植物生物反应器生产药物、色素、食品添加剂、酶、农药等。快速发展期快速发展期w1973年,童第周成功进行核移植,获得种间杂种鱼。w1975年,Kohler和Milstein建立小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。w1977年,利用胚胎工程技术成功培育出首例试管婴儿。w1984年,Villadsen利用胚胎细胞克隆出一只绵羊,这就是首次通过核移植技术克隆得哺乳动物。w1987年,Gordon获得分泌组织纤溶酶激活因子tPA得转基因小鼠,随后转基因羊、牛、猪得乳腺生物反应器相继成功。1996年7月5日,世界上第一只克隆羊“多利”在英国苏格兰卢斯林研究所得试验基地诞生。证实高等动物体细胞核得全能性。细胞工程历史上得一个里程碑。Breast cellJohn B、Gurdon discovered in 1962 that the specialisation of cells is reversible、In a classic experiment,he replaced the immature cell nucleus in an egg cell of a frog with the nucleus from a mature intestinal cell、This modified egg cell developed into a normal tadpole、The DNA of the mature cell still had all the information needed to develop all cells in the frog、Shinya Yamanaka discovered more than 40 years later,in 2006,how intact mature cells in mice could be reprogrammed to bee immature stem cells、Surprisingly,by introducing only a few genes,he could reprogram mature cells to bee pluripotent stem cells,i、e、immature cells that are able to develop into all types of cells in the body、(induced pluripotent stem cells,iPS cells)三、细胞工程得应用1.动植物快速繁殖 包括试管植物、人工种子、试管动物、克隆动物2、新品种培育 指在细胞、细胞器、细胞核、染色体或组织水平上进行遗传性状改良。包括原生质体诱变、细胞融合、单倍体/多倍体育种、雌雄核发育、胚胎嵌(融)合等技术。3、细胞工程生物制品 利用动植物细胞、组织培养或转基因动植物生物反应器生产生物制品。动物细胞生物制药动物细胞生物制药w哺乳动物细胞表达得蛋白可以经修饰成具有活性得蛋白产品,明显优于酵母、大肠杆菌表达系统。w仓鼠肾细胞生产狂犬病毒疫苗、乙脑疫苗;w幼地鼠肾(BHK21)细胞生产口蹄疫疫苗;w中国仓鼠卵巢(CHO)细胞生产乙肝疫苗;w2BS细胞和KMB17细胞生产甲肝疫苗;w2BS细胞和MRC5细胞生产水痘疫苗。wFDA批准得动物细胞制备药物:胰岛素、组织纤溶酶激活剂(治疗心脏病);促红细胞生成素(治疗贫血);白介素(治疗肾癌);凝血因子III和IV(治疗血友病);肿瘤坏死因子受体(治疗类风湿性关节炎)。1975年,英国科学家Kohler和Milstein 建立杂交瘤技术杂交瘤技术(hybridoma technique)骨髓瘤细胞1、体外无限增殖;2、HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)或者TK(胸腺嘧啶核苷激酶)缺陷型HAT选择培养基含次黄嘌呤H、氨基蝶呤A、胸腺嘧啶核苷T(阻断DNA合成得正常途径及补救途径 基因工程单克隆抗体得制备基因工程单克隆抗体得制备转基因生物反应器转基因生物反应器w将外源基因转入细胞或动植物,利用细胞增殖或动植物代谢制备外源基因得表达产物得技术-转基因生物反应器技术。w被转入外源基因得细胞或动植物-转基因生物反应器。转基因生物反应器得特点比较转基因生物反应器得特点比较人重组人重组tPA(组织纤维蛋白酶原激活剂组织纤维蛋白酶原激活剂)生产流程生产流程