环介导等温扩增技术原理.ppt

PrincipleofLoop-mediatedisothermalamplification烟雨莫问环介导等温扩增技术原理环介导等温扩增技术原理主要内容w等温扩增技术简介w等温扩增技术的应用前景w几种等温扩增技术比较w环介导的等温扩增技术原理w环介导的等温扩增演示w环介导的等温扩增检测等温扩增的概念w等温扩增技术(IsothermalAmplificationTechnology)是核酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和各自特异性引物（或不加）来达到快速核酸扩增的目的。w与PCR技术相比核酸等温扩增对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，更能满足快速简便的需求。等温扩增的优势应用w特异性高w分析速度快w成本低w突变率低w不需要升温降温过程，一台的加热器即可操作w检测核酸成分比检测微生物本身危险性小w方便诊断等温扩增的种类w环介导核酸等温扩增技术（LAMP）w滚环扩增技术RCAw单引物等温扩增SPIAw依赖解旋酶的等温扩增技术HADw链替代扩增SDAw交叉引物扩增技术CPAw核酸依赖性扩增检测技术NASBAwQ复制酶反应各类等温扩增技术的比较温度温度 引物引物模板模板其他其他NASBA42需要2条RNA反转录酶，RNA酶H，T7RNA聚合酶SPIA421条RNA反转录酶，T7RNA聚合酶HDA37/65需要2条DNA解旋酶，扩增片段小SDA37/65不需要DNALAMP634条DNADNA聚合酶RCA 37-65需要DNAQ37不需要RNA环介导等温扩增核酸技术优势wLAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的缺点，避免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的灵敏度和扩增效率。w操作简单：只需一个水浴锅w快速高效：不需要预先的双链DNA热变性避免了温度循环而造成的时间损失w特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。w高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。w缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300bp以内。500bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。灵敏度高易造成假阳性结果。环介导等温扩增核酸技术w环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermalamplification,简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的BstDNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。wLAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。环介导等温扩增原理w6065是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65左右处于动态平衡状态。利用引物合成的DNA链取代模板互补链。w扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特性的BstDNA聚合酶w需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物wLAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及进行温度循环。w针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3端的F3c、F2c和Flc区以及5端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。wLAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则只有内引物被使用。wFIP(ForwardInnerPrimer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成，F2区与靶基因3端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5端的Flc区域序列相同。wF3引物：上游外部引物(ForwardOuterPrimer)，由F3区组成，并与靶基因的F3c区域互补。wBIP引物：下游内部引物(BackwardInnerPrimer)，由B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5端的Blc区域序列相同。wB3引物：下游外部引物(BackwardOuterPrimer)，由B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。环介导等温扩增引物设计LAMP反应引物与对应模板区域反应引物与对应模板区域环介导的等温扩增技术原理w内引物FIP的F2与其模板的互补序列F2c结合，在BstDNA聚合酶作用下，从F2的3末端开始启动DNA合成，合成一条以FIP为新的DNA单链并与模板链结合形成新的双链DNA。以F3为起始合成的新链与模板链形成双链。而原合成的以FIP为起始的DNA单链被置换而脱离产生一单链DNA，其在5末端F1c和F1区发生自我碱基配对，形成茎环状结构。引物BIP的B2与模板链B2c区互补配对，合成以BIP为起始的新链，并与模板链互补形成DNA双链。同时，F端的环状结构将被打开，外引物B3与模板上B3c杂交后，以其3末端为起点也开始合成新链，并使以BIP为起始的DNA单链从模板链上脱离下来，形成以FIP和BIP为两端的单链。因为B1C与B1互补，F1C与F1互补，两端自然发生碱基配对，这条游离于液体中的DNA单链分别在F和B末端形成两个茎环状结构，于是整条链呈现哑铃状结构，此结构即为LAMP的基础结构。形成LAMP基础结构环介导等温扩增过程演示反应时间对LAMP的影响乔岩梅.炭疽芽孢杆菌特征基因恒温扩增检测方法的研究D.中国科学院研究生院（武汉病毒研究所）2007EffectofreactiontimeontheLAMPreaetion.Lanes1,DNAmarker(DL2000)with2000,1000,750,500,250and100bP:lanes2一5,LAMPamPlificationProduetsfor15min,30min,45min,60min,respectively:lane6,withoutDNAtemplateinthereaction.环介导等温扩增检测w反应结束后对扩增产物的检测常使用焦磷酸酶沉淀检测（浊度检测）、荧光检测、凝胶电泳检测等。w焦磷酸酶沉淀的检测（浊度检测）：在LAMP反应过程中，dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物焦磷酸酶白色沉淀，研究者发现LAMP反应中焦磷酸镁沉淀的形成与所产生的DNA量之间的关系，发现两者生成量之间呈线性关系，并且焦磷酸镁沉淀在400nm处有吸收峰，从而进行LAMP的定量检测。w荧光检测：LAMP有极高的扩增效率，可在一小时内将靶序列扩增至109l010倍，所以当反应液中加入核酸染料SYBRGreenI后，在紫外灯或日光下通过肉眼即可进行判定，如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBRGreenI的橙色不变。检测流程图