2-基因克隆载体99.pptx

第二章第二章第二章第二章 基因工程的基本条件基因工程的基本条件基因工程的基本条件基因工程的基本条件一、用于核酸操作的工具酶一、用于核酸操作的工具酶一、用于核酸操作的工具酶一、用于核酸操作的工具酶二、二、二、二、基因克隆载体基因克隆载体基因克隆载体基因克隆载体三、目的基因的制备三、目的基因的制备三、目的基因的制备三、目的基因的制备四、基因工程受体菌或细胞四、基因工程受体菌或细胞四、基因工程受体菌或细胞四、基因工程受体菌或细胞二、基因克隆载体二、基因克隆载体二、基因克隆载体二、基因克隆载体（一）载体的功能及特征（一）载体的功能及特征（一）载体的功能及特征（一）载体的功能及特征（二）质粒（二）质粒（二）质粒（二）质粒（三）噬菌体或病毒（三）噬菌体或病毒（三）噬菌体或病毒（三）噬菌体或病毒DNADNA（四）（四）（四）（四）CosCos质粒与噬菌粒质粒与噬菌粒质粒与噬菌粒质粒与噬菌粒（五）人工染色体载体（五）人工染色体载体（五）人工染色体载体（五）人工染色体载体（一）载体的功能及特征（一）载体的功能及特征（一）载体的功能及特征（一）载体的功能及特征 在基因工程操作中，能携带外源在基因工程操作中，能携带外源DNA进入受体细胞的进入受体细胞的DNA分子。分子。载体载体(vector)：载体的功能：载体的功能：载体的功能：载体的功能：为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。运送外源基因高效转入受体细胞；运送外源基因高效转入受体细胞；运送外源基因高效转入受体细胞；运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因提供复制能力或整合能力；载体应具备的条件：载体应具备的条件：载体应具备的条件：载体应具备的条件：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性可转移性可转移性可转移性)；具有合适的筛选标记。具有合适的筛选标记。具有合适的筛选标记。具有合适的筛选标记。具有较高的外源具有较高的外源具有较高的外源具有较高的外源DNADNA载装能力；载装能力；载装能力；载装能力；具有多种单一的限制酶酶切位点；具有多种单一的限制酶酶切位点；具有多种单一的限制酶酶切位点；具有多种单一的限制酶酶切位点；具有与受体细胞相适应的复制位点或整合位点；具有与受体细胞相适应的复制位点或整合位点；具有与受体细胞相适应的复制位点或整合位点；具有与受体细胞相适应的复制位点或整合位点；基本概念：基本概念：基本概念：基本概念：2 2）存存存存在在在在于于于于细细细细菌菌菌菌、真真真真菌菌菌菌、蓝蓝蓝蓝藻、酵母等细胞中藻、酵母等细胞中藻、酵母等细胞中藻、酵母等细胞中。（二）质粒（二）质粒（二）质粒（二）质粒(plasmid)(plasmid)1 1）是是是是生生生生物物物物细细细细胞胞胞胞内内内内固固固固有有有有的的的的、能能能能独独独独立立立立于于于于染染染染色色色色体体体体而而而而自自自自主主主主复复复复制制制制、并并并并被被被被稳稳稳稳定定定定遗遗遗遗传传传传的的的的核核核核酸酸酸酸分子。分子。分子。分子。The genomic DNA of E.coli:a single circular double-stranded DNA,with the contour length about 850 times longer than the cellplasmid DNAGenomic DNA4 4）绝绝绝绝大大大大多多多多数数数数的的的的天天天天然然然然DNADNA质质质质粒粒粒粒具具具具有有有有共共共共价价价价、闭闭闭闭合合合合、环环环环状状状状的的的的双双双双链链链链结结结结构构构构(c covalently ovalently c closed losed c circular ircular DNA,DNA,cccDNAcccDNA)，以超螺旋形式存在。，以超螺旋形式存在。，以超螺旋形式存在。，以超螺旋形式存在。3 3）绝大多数质粒是）绝大多数质粒是）绝大多数质粒是）绝大多数质粒是DNADNA型的；型的；型的；型的；酵母的杀伤质粒酵母的杀伤质粒(killer plasmid)是是RNA。7 7）最大装载量：）最大装载量：）最大装载量：）最大装载量：15 15 kbkb（5%5%）。5 5）分子大小：）分子大小：）分子大小：）分子大小：1-300 1-300 kbkb；编编码码2-3个个中中等等大大小小的的蛋蛋白白质质，如如抗抗生生素素抗抗性性、代代谢谢特特征征等等，赋赋予予细细菌菌一一些些额额外外的的特特性（非必须）。性（非必须）。6）编码基因：编码基因：质质粒粒不不是是单单纯纯的的寄寄生生，携携带带的的遗遗传传信信息息赋赋予予细细菌菌特定的遗传性状，如抗生素抗性基因特定的遗传性状，如抗生素抗性基因Ampr。质粒与宿主细胞的关系：质粒与宿主细胞的关系：质质粒粒对对宿宿主主的的生生存存不不是是必必需需的的，只只是是“友友好好”的的“借居借居”宿主细胞中。宿主细胞中。质质粒粒离离开开宿宿主主就就无无法法生生存存，只只有有依依赖赖宿宿主主细细胞胞的帮助，才能完成自身的复制、转录。的帮助，才能完成自身的复制、转录。质粒的基本特征：质粒的基本特征：质粒的基本特征：质粒的基本特征：自主复制性自主复制性自主复制性自主复制性不相容性不相容性不相容性不相容性可转移性可转移性可转移性可转移性 携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记携带特殊的遗传标记1 1、自主复制性、自主复制性、自主复制性、自主复制性 质质质质粒粒粒粒DNADNA上上上上的的的的复复复复制制制制子子子子结结结结构构构构决决决决定定定定了了了了质质质质粒粒粒粒与与与与寄主的对应关系。寄主的对应关系。寄主的对应关系。寄主的对应关系。质质质质粒粒粒粒能能能能利利利利用用用用寄寄寄寄主主主主细细细细胞胞胞胞的的的的DNADNA复复复复制制制制系系系系统统统统，进行自主复制。进行自主复制。进行自主复制。进行自主复制。严紧型质粒严紧型质粒严紧型质粒严紧型质粒 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为：多寡，质粒可分为：松弛型质粒松弛型质粒松弛型质粒松弛型质粒 1-31-3拷贝拷贝拷贝拷贝/cell/cell，复制受细胞核控制，复制受细胞核控制，复制受细胞核控制，复制受细胞核控制，伴随染色体伴随染色体伴随染色体伴随染色体DNADNA复制而复制。复制而复制。复制而复制。复制而复制。如：如：pSC101、p15A。1 1）严紧型质粒）严紧型质粒）严紧型质粒）严紧型质粒(stringent plasmid)(stringent plasmid)：加加加加入入入入氯氯氯氯霉霉霉霉素素素素（终终终终浓浓浓浓度度度度10-17010-170 g/mlg/ml）抑抑抑抑制细菌蛋白质合成后，可达制细菌蛋白质合成后，可达制细菌蛋白质合成后，可达制细菌蛋白质合成后，可达30003000拷贝拷贝拷贝拷贝/cell/cell。2 2）松弛型质粒）松弛型质粒）松弛型质粒）松弛型质粒(relaxed plasmid)(relaxed plasmid)：如：如：pMB1、ColE1。10-20010-200拷拷拷拷贝贝贝贝/cell/cell，复复复复制制制制不不不不受受受受细细细细胞胞胞胞核核核核控控控控制制制制，染色体染色体染色体染色体DNADNA复制停止时，仍可进行复制。复制停止时，仍可进行复制。复制停止时，仍可进行复制。复制停止时，仍可进行复制。2 2、不相容性、不相容性、不相容性、不相容性(incompatibility)(incompatibility)指指指指任任任任何何何何两两两两种种种种含含含含相相相相似似似似复复复复制制制制子子子子结结结结构构构构的的的的不不不不同同同同质粒，不能同时存在于一个细胞中。质粒，不能同时存在于一个细胞中。质粒，不能同时存在于一个细胞中。质粒，不能同时存在于一个细胞中。分子机制：分子机制：分子机制：分子机制：两两两两种种种种含含含含不不不不同同同同复复复复制制制制子子子子结结结结构构构构的的的的不不不不同同同同质质质质粒粒粒粒，在在在在复复复复制制制制时时时时受受受受各各各各自自自自的的的的拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数控控控控制制制制系系系系统统统统调调调调节节节节，致致致致使使使使两两两两种种种种质质质质粒粒粒粒的的的的最最最最终终终终拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数恒恒恒恒定定定定，经经经经若若若若干干干干复复复复制制制制周周周周期期期期和和和和细细细细胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞内。胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞内。胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞内。胞分裂周期后，仍能共处于同一细胞内。两两两两种种种种含含含含相相相相似似似似复复复复制制制制子子子子结结结结构构构构的的的的不不不不同同同同质质质质粒粒粒粒，在在在在复复复复制制制制时时时时受受受受同同同同一一一一拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数控控控控制制制制系系系系统统统统的的的的干干干干扰扰扰扰，致致致致使使使使两两两两种种种种质质质质粒粒粒粒的的的的最最最最终终终终拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数不不不不同同同同，其其其其中中中中拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数多多多多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。不相容性的质粒组成不相容性的质粒组成不相容性的质粒组成不相容性的质粒组成不相容性群不相容性群不相容性群不相容性群，如：，如：，如：，如：ColE1ColE1、pMB1pMB1有相似复制子结构，彼此不相容；有相似复制子结构，彼此不相容；有相似复制子结构，彼此不相容；有相似复制子结构，彼此不相容；pSC101pSC101、F F、RP4RP4有相似复制子结构，彼此不相容；有相似复制子结构，彼此不相容；有相似复制子结构，彼此不相容；有相似复制子结构，彼此不相容；p15Ap15A及其衍生质粒有相似复制子结构，彼此不相容。及其衍生质粒有相似复制子结构，彼此不相容。及其衍生质粒有相似复制子结构，彼此不相容。及其衍生质粒有相似复制子结构，彼此不相容。3 3、可转移性、可转移性、可转移性、可转移性接合型质粒接合型质粒接合型质粒接合型质粒(conjunctive plasmid)(conjunctive plasmid)革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒(nonconjunctive plasmid)(nonconjunctive plasmid)除除除除带带带带有有有有自自自自我我我我复复复复制制制制所所所所必必必必需需需需的的的的遗遗遗遗传传传传信信信信息息息息外外外外，还还还还带带带带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。1 1）接合型质粒：）接合型质粒：）接合型质粒：）接合型质粒：能能能能在在在在天天天天然然然然条条条条件件件件下下下下自自自自发发发发地地地地从从从从一一一一个个个个细细细细胞胞胞胞转转转转移移移移到到到到另另另另一个细胞，如一个细胞，如一个细胞，如一个细胞，如F F质粒质粒质粒质粒。符合基因工程的符合基因工程的符合基因工程的符合基因工程的安全安全安全安全要求。要求。要求。要求。2 2）非接合型质粒：）非接合型质粒：）非接合型质粒：）非接合型质粒：不不不不能能能能在在在在天天天天然然然然条条条条件件件件下下下下独独独独立立立立地地地地发发发发生生生生接接接接合合合合作作作作用用用用，如如如如ColE1ColE1质粒质粒质粒质粒。虽虽虽虽带带带带有有有有自自自自我我我我复复复复制制制制所所所所必必必必需需需需的的的的遗遗遗遗传传传传信信信信息息息息，但但但但失失失失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。值值得得注注意意的的是是，某某些些非非接接合合型型质质粒粒（如如ColE1）在在接接合合型型质质粒粒的的存存在在和和协协助助下下，也也能能发发生生DNA转转移移，这这个个过过程程由由 bom和和mob基因决定。基因决定。4 4、携带特殊的遗传标记、携带特殊的遗传标记、携带特殊的遗传标记、携带特殊的遗传标记 这些标记基因对重组这些标记基因对重组这些标记基因对重组这些标记基因对重组DNADNA筛选筛选筛选筛选有重要意义。有重要意义。有重要意义。有重要意义。野野野野生生生生型型型型质质质质粒粒粒粒DNADNA上上上上往往往往往往往往携携携携带带带带一一一一个个个个或或或或多多多多个个个个遗遗遗遗传传传传标标标标记基因，使寄主产生正常生长非必需的附加性状。记基因，使寄主产生正常生长非必需的附加性状。记基因，使寄主产生正常生长非必需的附加性状。记基因，使寄主产生正常生长非必需的附加性状。物质抗性：物质抗性：物质抗性：物质抗性：物质合成：物质合成：物质合成：物质合成：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱抗生素、细菌毒素、有机碱质粒的空间构型：质粒的空间构型：共价、闭合、环状共价、闭合、环状DNA(cccDNA)超螺旋超螺旋(super coil DNA,scDNA)开环开环DNA(open circular DNA,ocDNA)一条链上有一至数个缺口一条链上有一至数个缺口线形线形DNA(linear DNA,L-DNA)质粒空间构型与电泳速率：质粒空间构型与电泳速率：质粒空间构型与电泳速率：质粒空间构型与电泳速率：同同一一质质粒粒尽尽管管分分子子量量相相同同，不不同同的的构构型型电电泳泳迁迁移移率率不不同同：cccDNA最最快快、L-DNA次次之之、ocDNA最慢。最慢。cccDNAcccDNAL-DNAL-DNA ocDNA ocDNA质粒的分类质粒的分类质粒的分类质粒的分类 1 1、按功能：、按功能：、按功能：、按功能：F F质粒质粒质粒质粒(fertility factor)(fertility factor)R R质粒质粒质粒质粒(resistance factor)(resistance factor)Col质粒质粒(coliconogenic factor)1 1）F F质粒：质粒：质粒：质粒：性质粒，决定细菌性别，能在天然条件下性质粒，决定细菌性别，能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞。自发地从一个细胞转移到另一个细胞。R R质粒：质粒：质粒：质粒：抗药性质粒，抗药性质粒，带有一种或多种抗生素抗性带有一种或多种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状。基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状。RTF:resistance trarnsfer factor Col质粒：质粒：大大肠肠杆杆菌菌素素质质粒粒，带带有有控控制制大大肠肠杆杆菌菌素素合合成成的的基基因因，合合成成大大肠肠杆杆菌菌素素，杀杀死死不不含含Col质粒的亲缘细菌。质粒的亲缘细菌。接合型质粒接合型质粒接合型质粒接合型质粒2 2、按转移方式：、按转移方式：、按转移方式：、按转移方式：非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒非接合型质粒3 3、按复制机理：按复制机理：按复制机理：按复制机理：接合型质粒分子量大，一般属严紧型。接合型质粒分子量大，一般属严紧型。接合型质粒分子量大，一般属严紧型。接合型质粒分子量大，一般属严紧型。严紧型质粒：严紧型质粒：严紧型质粒：严紧型质粒：松弛型质粒：松弛型质粒：松弛型质粒：松弛型质粒：非非非非接合型质粒分子量小，一般属接合型质粒分子量小，一般属接合型质粒分子量小，一般属接合型质粒分子量小，一般属松弛型。松弛型。松弛型。松弛型。4、按分子量大小：按分子量大小：15kb，多为接合型质粒；，多为接合型质粒；15kb，多为非接合型质粒。，多为非接合型质粒。大型质粒大型质粒:小型质粒小型质粒:质粒的构建质粒的构建质粒的构建质粒的构建分子量大；分子量大；分子量大；分子量大；野生型质粒的特性提供了以其为基础、野生型质粒的特性提供了以其为基础、人工构建载体分子的可能。人工构建载体分子的可能。野生型野生型野生型野生型质粒的缺陷：质粒的缺陷：质粒的缺陷：质粒的缺陷：拷贝数低；拷贝数低；拷贝数低；拷贝数低；单一酶切位点少；单一酶切位点少；单一酶切位点少；单一酶切位点少；遗传标记不理想。遗传标记不理想。遗传标记不理想。遗传标记不理想。如如：天天然然质质粒粒pSC101分分子子量量9.09kb，只只有有1个个EcoR I切点充当克隆位点，筛选标志只有切点充当克隆位点，筛选标志只有Tetr。可可通通过过插插入入失失活活筛筛选选，但但免免疫疫筛筛选选E1的的操作非常麻烦。操作非常麻烦。ColE1的的筛筛选选标标志志是是大大肠肠杆杆菌菌素素E1，唯唯一一的克隆位点的克隆位点EcoR I正好位于这个基因内部。正好位于这个基因内部。大大于于20kb的的质质粒粒很很难难导导入入受受体体细细胞胞，且且极不稳定。极不稳定。质粒的改造与构建：质粒的改造与构建：尽尽量量缩缩小小质质粒粒的相对分子量，提高外源的相对分子量，提高外源DNA的装载量。的装载量。1）删除不必要的）删除不必要的DNA区域区域，灭灭活活对对质质粒粒复复制制产产生生负负调调控控效效应应的的基基因因，提高质粒的提高质粒的拷贝数拷贝数。2）灭活某些编码基因）灭活某些编码基因 灭灭活活促促进进质质粒粒在在细细菌菌种种间间转转移移的的mob基基因因，杜杜绝绝重重组组质质粒粒扩扩散散污污染染环环境境，保保证证DNA重重组组实验的实验的安全性安全性。最最好好有有两两种种选选择择标标记记基基因因，并并且且在在选选择标记基因区内有合适的克隆位点。择标记基因区内有合适的克隆位点。3）加入选择标记基因：）加入选择标记基因：当当外外源源DNA片片段段插插入入克克隆隆位位点点后后，标标记基因失活，成为选择克隆子的依据。记基因失活，成为选择克隆子的依据。氨苄青霉素抗性（氨苄青霉素抗性（ampicillin,Ampr）卡那霉素抗性（卡那霉素抗性（kanamycin,Kanr）四环素抗性（四环素抗性（tetracycline,Tetr）链霉素抗性（链霉素抗性（streptomycin,Strr）氯霉素抗性（氯霉素抗性（chloromycetin,Chlr）常用的选择标记：常用的选择标记：2）根据克隆子蓝白颜色进行筛选的）根据克隆子蓝白颜色进行筛选的lacZ基因。基因。1）抗生素抗性抗生素抗性基因：基因：3）在在选选择择标标记记基基因因内内，引引入入人人工工合合成成的的多多种种限限制制酶酶连连续续酶酶切切位位点点的的DNA短短序序列列，即即多多克克隆隆位位点点(multiple cloning sites,MCS)，也也称称多多酶酶接接头头(polylinker)。同时同时删除重复的酶切位点删除重复的酶切位点，使其单一化。，使其单一化。4）根根据据外外源源基基因因克克隆隆的的不不同同要要求求，分分别别加装特殊的基因加装特殊的基因表达调控元件表达调控元件。实验室用质粒多以少数几个野生型质粒为基础构建：实验室用质粒多以少数几个野生型质粒为基础构建：实验室用质粒多以少数几个野生型质粒为基础构建：实验室用质粒多以少数几个野生型质粒为基础构建：pSC101pSC101：8.8kb8.8kb，拷贝数，拷贝数，拷贝数，拷贝数5 5，四环素抗性基因，四环素抗性基因，四环素抗性基因，四环素抗性基因TetTetrr。ColE1ColE1：6.56.5kbkb，拷拷拷拷贝贝贝贝数数数数20-3020-30（氯氯氯氯霉霉霉霉素素素素诱诱诱诱导导导导可可可可达达达达1000-30001000-3000），大肠杆菌素基因），大肠杆菌素基因），大肠杆菌素基因），大肠杆菌素基因E1E1。RSF2124RSF2124：ColE1ColE1衍衍衍衍生生生生质质质质粒粒粒粒，氨氨氨氨苄苄苄苄青青青青霉霉霉霉素素素素抗抗抗抗性性性性基基基基因因因因AmpAmprr。人工构建的质粒根据其功能和用途，分为：人工构建的质粒根据其功能和用途，分为：人工构建的质粒根据其功能和用途，分为：人工构建的质粒根据其功能和用途，分为：整合质粒整合质粒整合质粒整合质粒测序质粒测序质粒测序质粒测序质粒高拷贝质粒高拷贝质粒高拷贝质粒高拷贝质粒低拷贝质粒低拷贝质粒低拷贝质粒低拷贝质粒温敏质粒温敏质粒温敏质粒温敏质粒探针质粒探针质粒探针质粒探针质粒穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒表达质粒表达质粒表达质粒表达质粒1 1、高拷贝质粒：、高拷贝质粒：、高拷贝质粒：、高拷贝质粒：1）含含有有氯氯霉霉素素可可扩扩增增的的松松弛弛型型复复制制子子结结构构，如如ColE1、pMB1派生质粒、派生质粒、pBR系列；系列；用于用于克隆克隆和和扩增扩增外源基因。外源基因。2）复复制制子子经经人人工工诱诱变变，解解除除对对质质粒粒拷拷贝贝数数的的负负控控制制作作用用，使使质质粒粒在在每每个个细细胞胞中中达达数数千千拷贝。拷贝。如：如：如：如：pBR322pBR322：pBR3224,363 bporiROPROISal IBamH ITetrPvu IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAmprPst I松弛复制型松弛复制型松弛复制型松弛复制型拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 50-100/50-100/cellcell含含Ampr、Tetrp:plasmid；BR:取取自自构构建建者者F.Bo1ivar和和R.L.Rodriguez姓的首字母；姓的首字母；322:实验室编号。实验室编号。用于基因克隆和扩增用于基因克隆和扩增ori-ColE1Tetr-pSC101Ampr-pSP21242 2、低拷贝质粒：、低拷贝质粒：、低拷贝质粒：、低拷贝质粒：某某某某些些些些毒毒毒毒性性性性基基基基因因因因的的的的表表表表达达达达产产产产物物物物过过过过多多多多时时时时，会会会会严严严严重重重重影影影影响响响响宿宿宿宿主主主主菌菌菌菌的的的的正正正正常常常常代代代代谢谢谢谢活活活活动动动动、导导导导致致致致宿宿宿宿主主主主菌菌菌菌死亡，就需要低拷贝载体。死亡，就需要低拷贝载体。死亡，就需要低拷贝载体。死亡，就需要低拷贝载体。如如如如pLG338/339pLG338/339、pHSG415pHSG415等等等等pSC101pSC101派派派派生生生生质粒质粒质粒质粒，拷贝数，拷贝数，拷贝数，拷贝数1010，用于用于用于用于表达表达表达表达某些某些某些某些毒性基因毒性基因毒性基因毒性基因。3 3、温敏质粒：、温敏质粒：、温敏质粒：、温敏质粒：即温度敏感型复制控制质粒，在不同温度即温度敏感型复制控制质粒，在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质。下表现出拷贝数、整合等不同性质。温度温度 40时，拷贝数很快增至时，拷贝数很快增至1000个以上。个以上。如如：1979年年B.E.Uhlin构建的构建的pBEU1、pBEU2：4 4、测序质粒：、测序质粒：、测序质粒：、测序质粒：高高高高拷拷拷拷贝贝贝贝复复复复制制制制，含含含含有有有有多多多多克克克克隆隆隆隆位位位位点点点点(MCSMCS)，便便便便于于于于外外外外源源源源DNADNA的的的的克克克克隆隆隆隆与与与与扩扩扩扩增增增增，在在在在MCSMCS两两两两端端端端邻邻邻邻近近近近区域，有区域，有区域，有区域，有通用引物通用引物通用引物通用引物互补序列，便于互补序列，便于互补序列，便于互补序列，便于测序测序测序测序。如：如：pUC18/19、M13 mp系列、系列、pGEM-T。如：如：如：如：pUC18pUC18/19/19：rBamH IpUC182,686 bpAmplacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTEcoR I Sst IKpn I Sma IXba ISal IPst I Sph I Hind III拷贝数拷贝数拷贝数拷贝数 2000-3000/2000-3000/cellcell用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序多克隆位点多克隆位点多克隆位点多克隆位点MCSMCS正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZUniversity of California的的J.Messing和和J.Vieria构建构建ori-PBR322、Ampr-PBR322pUC18/pUC18/1919正选择标记正选择标记正选择标记正选择标记lacZlacZ的显色原理的显色原理的显色原理的显色原理:pUC18pUC18/19/19PlacPlaclacZlacZMCSMCS 底物：底物：底物：底物：5-5-溴溴溴溴-4-4-氯氯氯氯-3-3-吲哚吲哚吲哚吲哚基基基基-D-D-半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷半乳糖苷（X-galX-gal）-半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶 -亚基亚基亚基亚基 诱导物：异丙基硫代半乳糖苷诱导物：异丙基硫代半乳糖苷诱导物：异丙基硫代半乳糖苷诱导物：异丙基硫代半乳糖苷（IPTGIPTG）5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝（-互补）互补）互补）互补）5 5、整合质粒：、整合质粒：、整合质粒：、整合质粒：含含含含整整整整合合合合酶酶酶酶编编编编码码码码基基基基因因因因和和和和整整整整合合合合特特特特异异异异性性性性位位位位点点点点序序序序列列列列，克克克克隆隆隆隆在在在在这这这这种种种种质质质质粒粒粒粒上上上上的的的的外外外外源源源源基基基基因因因因进进进进入入入入受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞后后后后，能能能能准准准准确确确确整整整整合合合合在在在在受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞染染染染色色色色体体体体DNADNA的特定位点。的特定位点。的特定位点。的特定位点。便于便于便于便于外源基因的外源基因的外源基因的外源基因的整合整合整合整合。6 6、穿梭质粒、穿梭质粒、穿梭质粒、穿梭质粒(shuttle plasmid)(shuttle plasmid)：如：如：如：如：E.coliE.coli-酵母菌、酵母菌、酵母菌、酵母菌、E.coliE.coli-哺乳动物细胞穿梭质粒。哺乳动物细胞穿梭质粒。哺乳动物细胞穿梭质粒。哺乳动物细胞穿梭质粒。克隆的外源基因可不用更换载体、直接从一克隆的外源基因可不用更换载体、直接从一克隆的外源基因可不用更换载体、直接从一克隆的外源基因可不用更换载体、直接从一种受体菌转入另一种受体菌中复制并遗传。种受体菌转入另一种受体菌中复制并遗传。种受体菌转入另一种受体菌中复制并遗传。种受体菌转入另一种受体菌中复制并遗传。含含含含有有有有两两两两个个个个亲亲亲亲缘缘缘缘关关关关系系系系不不不不同同同同的的的的复复复复制制制制子子子子结结结结构构构构、相相相相应应应应的的的的选选选选择择择择标标标标记记记记基基基基因因因因，能能能能在在在在两两两两种种种种不不不不同同同同种种种种属属属属的的的的受受受受体体体体细细细细胞胞胞胞中复制并被检测。中复制并被检测。中复制并被检测。中复制并被检测。E.coliE.coli-Pichia.pastorisPichia.pastoris穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒E.coliE.coli-HEK293-HEK293穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒穿梭质粒7 7、表达质粒：、表达质粒：、表达质粒：、表达质粒：在多克隆位点的上、下游，分别装有强在多克隆位点的上、下游，分别装有强在多克隆位点的上、下游，分别装有强在多克隆位点的上、下游，分别装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化元件，化外源基因表达的转录、翻译、纯化元件，化外源基因表达的转录、翻译、纯化元件，化外源基因表达的转录、翻译、纯化元件，使外源基因能在受体细胞中使外源基因能在受体细胞中使外源基因能在受体细胞中使外源基因能在受体细胞中高效表达高效表达高效表达高效表达、便于、便于、便于、便于下游下游下游下游纯化纯化纯化纯化。pGEM-3ZpGEM-3Z：装有装有装有装有2 2个噬菌体的强启动子个噬菌体的强启动子个噬菌体的强启动子个噬菌体的强启动子装有多克隆位点装有多克隆位点装有多克隆位点装有多克隆位点(MCS)(MCS)正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZlacZ用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达用于外源基因的高效表达 注注注注意意意意：T7T7和和和和SP6SP6启启启启动动动动子子子子特特特特异异异异性性性性地地地地由由由由噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体RNARNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶识识识识别别别别，相相相相应应应应的的的的受受受受体体体体菌菌菌菌需需需需表表表表达达达达噬噬噬噬菌菌菌菌体体体体RNARNA聚聚聚聚合合合合酶酶酶酶，如如如如BL21(BL21(表达表达表达表达T7 RNAT7 RNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶)。MCSMCSlacZlacZPPT7T7orioriAmpAmprr2,743 bp2,743 bppGEM-3ZpGEM-3ZPPSP6SP6 pET-3a pET-3a：pET-28a pET-28a：只只只只有有有有含含含含启启启启动动动动子子子子或或或或终终终终止止止止子子子子的的的的外外外外源源源源DNADNA插插插插入入入入载载载载体体体体的的的的合合合合适适适适位位位位点点点点，报报报报告告告告基基基基因因因因才才才才能能能能表表表表达达达达，表表表表达达达达量量量量的的的的高高高高低低低低直接反映表达调控元件的强弱。直接反映表达调控元件的强弱。直接反映表达调控元件的强弱。直接反映表达调控元件的强弱。8、探针质粒：、探针质粒：用于用于用于用于筛选表达调控元件筛选表达调控元件筛选表达调控元件筛选表达调控元件，如启动子、终止子。，如启动子、终止子。，如启动子、终止子。，如启动子、终止子。通通通通常常常常装装装装有有有有一一一一个个个个可可可可定定定定量量量量检检检检测测测测表表表表达达达达程程程程度度度度的的的的报报报报告告告告基基基基因因因因（如如如如抗抗抗抗生生生生素素素素抗抗抗抗性性性性基基基基因因因因），但但但但缺缺缺缺少少少少相相相相应应应应的的的的启启启启动动动动子子子子或终止子，因此本身不能表达报告基因。或终止子，因此本身不能表达报告基因。或终止子，因此本身不能表达报告基因。或终止子，因此本身不能表达报告基因。质粒质粒质粒质粒DNADNA的分离纯化的分离纯化的分离纯化的分离纯化氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 碱裂解法碱裂解法碱裂解法碱裂解法 沸水浴法沸水浴法沸水浴法沸水浴法 氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 用含有用含有用含有用含有EDTAEDTA的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加加加加CsClCsCl和溴化乙锭和溴化乙锭和溴化乙锭和溴化乙锭超速离心过夜超速离心过夜超速离心过夜超速离心过夜proteinsproteinsocDNAocDNAL-DNAL-DNAcccDNAcccDNARNAsRNAs在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取在紫外灯下吸取cccDNAcccDNA沸水浴法沸水浴法沸水浴法沸水浴法 用含用含用含用含EDTAEDTA和和和和Triton X-100Triton X-100的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴沸水浴沸水浴沸水浴40 40 secsec离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物离心，用无菌牙签挑去沉淀物乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒乙醇或异丙醇沉淀质粒DNADNA碱裂解法碱裂解法碱裂解法碱裂解法将菌体悬浮在含将菌体悬浮在含将菌体悬浮在含将菌体悬浮在含EDTAEDTA的缓冲液中的缓冲液中的缓冲液中的缓冲液中加加加加NaOHNaOH与与与与SDSSDS混合液，去膜释放内含物混合液，去膜释放内含物混合液，去膜释放内含物混合液，去膜释放内含物加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加溶菌酶裂解细菌细胞壁加高浓度加高浓度加高浓度加高浓度NaAcNaAc溶液，沉淀去除染色体、大部分蛋白质溶液，沉淀去除染色体、大部分蛋白质溶液，沉淀去除染色体、大部分蛋白质溶液，沉淀去除染色体、大部分蛋白质离心取上清，酚离心取上清，酚离心取上清，酚离心取上清，酚-氯仿处理，去除痕量蛋白质、核酸酶氯仿处理，去除痕量蛋白质、核酸酶氯仿处理，去除痕量蛋白质、核酸酶氯仿处理，去除痕量蛋白质、核酸酶乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒乙醇或异丙醇沉淀水相质粒RNaseRNase处理残余处理残余处理残余处理残余RNARNA氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法 质粒纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染；质粒纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染；质粒纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染；质粒纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染；碱裂解法碱裂解法碱裂解法碱裂解法 质粒纯度低、快速、操作简便；质粒纯度低、快速、操作简便；质粒纯度低、快速、操作简便；质粒纯度低、快速、操作简便；沸水浴法沸水浴法沸水浴法沸水浴法 质粒纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间。质粒纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间。质粒纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间。质粒纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间。（三）噬菌体或病毒（三）噬菌体或病毒（三）噬菌体或病毒（三）噬菌体或病毒DNADNA 噬噬菌菌体体(bacteriophage)或或病病毒毒(virus)是是一一类类非非细细胞胞微微生生物物，能能高高效效率率高高特特异异性性地地侵侵染染宿宿主主细细胞胞，然然后后或或自自主主复复制制繁繁殖殖，或或整整合合入入宿宿主主基基因因组组中中潜潜伏伏起起来来，而而且且在在一一定定条条件件下下这两种状态会相互转化。这两种状态会相互转化。噬菌体吸附噬菌体吸附在在E.coli上上噬菌体释放、噬菌体释放、菌体裂解菌体裂解T4T4噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体The DNA is about 3,500 times longer than the viral particle.The electron micrographof the single linear DNAmolecule of bacteriophage T2(about 182,000 bp);可使外源基因高效导入受体细胞。可使外源基因高效导入受体细胞。可使外源基因高效导入受体细胞。可使外源基因高效导入受体细胞。可使外源基因在受体细胞中高效扩增。可使外源基因在受体细胞中高效扩增。可使外源基因在受体细胞中高效扩增。可使外源基因在受体细胞中高效扩增。噬噬菌菌体体或或病病毒毒DNA能能被被开开发发为为基基因因工工程程载体的原因：载体的原因：高效感染性高效感染性高效感染性高效感染性 自主复制繁殖性自主复制繁殖性自主复制