骨软骨一体化支架的制备及力学性能研究.pdf

第 39 卷 第 5 期2023 年 10 月天 津理工大学学报JOURNAL OF TIANJIN UNIVERSITY OF TECHNOLOGYVol.39 No.5Oct.2023收稿日期:2022-06-20;修订日期:2023-03-25基金项目:国家自然科学基金(12072235,11972198,52105158);天津市透明质酸应用研究企业重点实验室开放基金(KTRDHA-Y201905)DOI:10.3969/j.issn.1673-095X.2023.05.010骨软骨一体化支架的制备及力学性能研究冯鹿明1,3,罗洋2,高丽兰1,3,4,谭沿松1,3,刘钢1,张春秋1,3,4(1.天津理工大学 天津市先进机电系统设计与智能控制重点实验室,天津 300384;2.天津市医疗器械质量监督检验中心,天津 300384;3.天津理工大学 机电工程国家级实验教学示范中心,天津 300384;4.天津市透明质酸应用研究企业重点实验室,天津 300457)摘要:按一定比例混合型胶原、丝素蛋白与透明质酸 3 种天然材料,运用冷冻干燥技术与天然软骨下骨交联,制备出同时具有软骨层和软骨下骨层的骨软骨一体化支架。采用扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)及非接触数字技术研究分析支架的表观与微观结构,通过压缩试验及循环载荷下的平均应变试验,对支架的力学性能进行检测。结果表明:制备出的骨软骨一体化支架软骨层呈多孔孔隙结构,通透性较好,且具有明显的率相关性;随着压缩速率的增加,支架的弹性模量增加;在循环压缩载荷作用下,支架显示了应力-应变滞环曲线,随着加载圈数的增加,支架表现出明显的平均应变行为,对骨软骨缺损修复具有重要的临床价值。关键词:骨软骨缺损;一体化支架;天然材料;微观结构;力学性能中图分类号:R318.01 文献标识码:A 文章编号:1673-095X(2023)05-0064-07Preparation and mechanical properties of osteochondral integrated scaffoldFENG Luming1,3,LUO Yang2,GAO Lilan1,3,4,TAN Yansong1,3,LIU Gang1,ZHANG Chunqiu1,3,4(1.Tianjin Key Laboratory for Advanced Mechatronic System Design and Intelligent Control,Tianjin University of Technology,Tianjin 300384,China;2.Tianjin Medical Devices Supervision and Testing Center of SFDA,Tianjin 300384,China;3.National Demonstration Center for Experimental Mechanical and Electrical Engineering Education,Tianjin University of Technology,Tianjin 300384,China;4.Tianjin Enterprise Key Laboratory on Hyaluronic Acid Application Research,Tianjin 300457,China)Abstract:Three natural materials including type collagen,silk protein and hyaluronic acid are mixed as a certain ratio,and the osteochondral integrated scaffold with both the cartilage layer and the subchondral bone layer are prepared by using cross-linked with natural subchondral bone using freeze-drying technique.The surface of a scaffold and microstructure are studied and analyzed by the SEM and non-contact digital techniques,and the mechanical properties of the scaffold are examined by compression tests and average strain tests under cyclic loading.The results show that the cartilage layer of the scaffold forms porous pore structures with the good permeability.The integrated scaffold has an obvious rate correlation,and the Youngs modulus of the scaffold is increased with the increase of the compression rate.The stress-strain hysteresis loop curve is produced for the scaffold under the cyclic compression load,and the scaffold exhibites an obvious average strain behavior with the increase of loading cycles.The osteochondral integrated scaffold is of great clinical value for the repair of osteochondral defects.2023 年 10 月冯鹿明,等:骨软骨一体化支架的制备及力学性能研究Key words:osteochondral defect;integrated scaffold;natural materials;microstructure;mechanical properties 关节软骨是一种半透明的黏弹性组织,没有血管、淋巴和神经,具有有限的先天自愈能力1。软骨和软骨下骨具有不同的生理特性和天然结构2。软骨组织由水、软骨细胞和蛋白质网络组成,而软骨下骨包括水、羟基磷灰石和胶原纤维束3。在骨软骨组织的天然结构中,软骨的缺损总是深入软骨下骨并进一步发展为骨软骨缺损4。骨软骨缺损是一种常见疾病,严重的创伤、运动损伤或身体疾病引起的关节损伤往往发展为骨关节炎,而骨软骨缺损是导致骨关节炎的主要原因5,会进一步导致关节疼痛和畸形,以及功能残疾6。由于软骨和软骨下骨的异质组织特性和不同的再生能力,全层骨软骨缺损的自愈经常失败7。目前,临床上对骨软骨缺损进行生理性修复和再生的治疗方法主要有自体软骨细胞移植及自体骨软骨移植8-10等。然而,这些治疗方法要么在较差的组织整合下表现出有限的修复效果,要么缺乏足够的自体移植物。组织工程中植入物存在的主要问题还有力学性能差、降解速度过快或过慢,以及易引起炎症反应等问题。针对这些问题,文中采用复合天然材料,通过改善不同的配比,制备出有着较好综合性能的支架,以改善组织工程中的植入物存在状况。型胶原是关节软骨主要组成成分,具有对软骨细胞的分化和迁移诱导作用,有利于关节软骨的再生,且型胶原在体内易降解,降解产物易被体内吸收且不产生炎症反应11。丝素蛋白具有生物相容性好,机械性能优越,有利于细胞黏附等特点,缺点是降解速度较慢,在体内需较长的时间降解12。透明质酸也具有良好的生物相容性和促进细胞代谢的作用,在组织工程领域具有较好的应用前景,缺点是在体内降解速度较快13-14。将型胶原、丝素蛋白和透明质酸进行复合,可优化三者的降解速度并改善其力学性能,提高复合支架的亲水性,制备出具有良好综合性能的复合支架材料。文中按一定比例混合型胶原、丝素蛋白与透明质酸 3 种天然材料,通过不同的配比并利用冷冻干燥技术15使复合支架与天然软骨下骨紧密交联在一起,制备出骨软骨一体化支架,并对其表观及微观形貌结构与力学性能进行分析与测试。1 试验材料和方法1.1 试验材料试 验 用 到 的 主 要 设 备 有:冷 冻 干 燥 机、凯尔 M-100 力学试验机、非接触式图像采集系统及扫描电镜。试验主要试剂有胃蛋白酶、冰乙酸、氢氧化钠、氯化钠及聚乙二醇。支架上层材料主要为型胶原、丝素蛋白与透明质酸;下层材料为牛的股骨松质骨,其中,型胶原参考文献 16 的方法在实验室自行制备,丝素蛋白参考文献 17 的方法在实验室自行制备,透明质酸钠和新鲜牛股骨购外购。1.2 试验方法1.2.1 骨软骨一体化复合支架的制备取新鲜牛股骨,用带锯机除去软骨并切成条状,用砂轮将其打磨为试验所需的圆柱形,并在上表面钻出均匀分布的孔,使用医用胶布在表面上方预留 2 mm的空间,使用型胶原填满孔洞,最后将型胶原、丝素蛋白、透明质酸按 6.75 3 0.25 的质量比均匀混合,混合好的溶液为支架材料,使用磁力搅拌器充分搅拌后,再经 70 目和 120 目不锈钢过滤网依次过滤,将过滤后的混合溶液装入 10 ml 注射器内,均匀地逐层涂在松质骨的表面上,放在-20 的冰箱里冷冻 30 min,最后置于真空冷冻干燥机中,冷冻干燥12 h 后取出,4 保存备用。支架的制备流程如图 1所示。图 1 支架制备流程Fig.1 Scaffold preparation process56天津理工大学学报第 39 卷 第 5 期试验方案经天津理工大学动物实验伦理委员会批准(批准号为 2022-SYDWLL-000243),试验过程遵循国际兽医学编辑协会发布的 关于动物伦理与福利的作者指南共识,以及地方与国家法规。1.2.2 骨软骨一体化支架的微观形貌分析采用非接触式图像采集系统观察骨软骨复合支架在宏观下界面整合情况,图像放大可达 200 倍。将支架材料的上表面及侧面进行喷金处理,在 10 kV 和0.4 nA 下,通过扫描电镜的支架上表面与侧面区域观察复合支架上表面的微观结构,以及支架与下方软骨下骨的界面整合情况。1.2.3 骨软骨一体化支架率相关行为在室温条件下,对骨软骨复合支架进行了相关试验,应变为:=-(L-L0)/L0(1)式中:L0为试验试样的原始高度;L 为试样压缩后的高度。压缩试验分别以 0.05%/s,0.1%/s 和 0.5%/s的压缩应变率加载至复合支架20%的应变。每组测量3 个支架样本,试验过程中,与试验机相连的计算机全程自动记录应力-应变数据,加载条件如表 1 所示。通过计算应力-应变曲线中 2%5%间的曲线获得各组加载条件下支架的弹性模量。表 1 单轴压缩的加载条件Tab.1 Loading conditions of uniaxial compression试样编号应变速率/(%/s)应变/%试样 1试样 30.0520试样 4试样 60.120试样 7试样 90.5201.2.4 骨软骨一体化支架单轴循环试验在室温条件下,对骨软骨复合支架进行压缩动态载荷下的单轴循环试验。该试验采用三角波加载进行,文中所制备的骨软骨一体化支架针对的是临床中患者膝关节股骨处的骨软骨缺损,而人们在日常活动(如步行或跑步)中,膝关节主要承受加载-卸载脉动循环的压缩载荷刺激,即类似于文中试验中所选取的三角波加载,因此,选择该循环载荷进行支架的力学性能测试,这样得到的试验结果与数据更有指导意义。设置平均应力大小为10 kPa,应力幅值为8 kPa,周期为 4 s,循环圈数为 400 圈,并取该试验循环的初始 10 圈,中间 10 圈与循环结束的最后 10 圈进行应力-应变分析,并对圈数-应变关系进行分析。骨软骨一体化支架率相关行为与单轴循环试验的试验数据采用 Excel 软件进行分析,对支架在试验中所发生的应力应变进行分析计算,考虑到试验误差,每组试验采用 3 个独立试样进行重复试验,试验结果取平均值,并用 Origin2018 软件进行绘图。2 试验结果分析2.1 骨软骨一体化支架的微观结构图 2 为非接触式图像采集系统得到的一体化支架的表观图,其中,图 2a 为一体化复合支架的上表面部分区域,经过冷冻干燥后的支架,表面表现出结晶光泽,结构较为均匀,未出现明显裂缝;图 2b 为一体化复合支架的侧面部分区域,图中下半部分黑色区域为天然软骨下骨部分,上半部分白色区域为冷冻干燥后的复合材料,侧面整体较为光滑,结构均匀,且在天然软骨下骨与复合支架间未出现明显裂缝及不均匀区域,界面整合情况整体良好。图 2 一体化支架表观图Fig.2 Apparent view of integrated scaffold图 3 为扫描电镜设备得到的一体化支架软骨层的微观结构。由图 3 可看出,软骨层的微观结构有着较明显的孔隙结构,这些孔隙是复合材料在冷冻干燥时,低温真空状态下聚合物中的冰晶升华并分离出来,并在原来水分子的位置上留下孔隙造成的。由微66 2023 年 10 月冯鹿明,等:骨软骨一体化支架的制备及力学性能研究观结构图可看出,一体化支架的软骨层具有良好的通透性,有利于软骨细胞的黏附与营养物质及代谢废物的运输与排出。通过 Image J 软件测得文中制备的支架表 面 孔 径 大 小 为 70.98 0.83 m,孔 隙 率 为63.34%。支架表面的孔隙结构与孔径大小为相关修复组织和细胞的迁入与长出提供空间。图 3 一体化支架软骨层的微观结构Fig.3 Microstructure of cartilage layer of integrated scaffold图 4 为扫描电镜设备得到的一体化支架侧面微观结构。图 4 一体化支架侧面微观结构Fig.4 Side microstructure of integrated scaffold由图 4 可看出,上层复合材料部分有着明显的孔隙结构,下层天然软骨下骨部分在同样的放大倍数下还未显露出其孔隙结构,这说明相对于复合材料,天然松质骨有着更加致密的结构组成,为上层的复合材料部分提供了较好的力学支撑。同时,上层与下层间由于结构组成的不同有着明显的界面分层,但界面分层处并未观察到明显的缺损和裂缝,说明上下层连接得较紧密,界面结合良好,可防止在后期的体外及体内试验中发生结构性破坏。2.2 骨软骨一体化支架率相关单轴压缩行为通过对骨软骨一体化支架进行单轴压缩试验,考察骨软骨复合支架的力学性能。文中制备的骨软骨一体化支架的复合材料部分为黏弹性材料,对试样压缩20%的应变并不会使支架结构发生破坏,在试样压缩结束试验后,将被压缩试样浸泡在生理盐水一定时间后,发现支架形状可完全恢复。因此,20%的应变不会使材料发生破坏。图 5a 给出骨软骨一体化支架在图 5 单轴压缩结果Fig.5 Uniaxial compression results76天津理工大学学报第 39 卷 第 5 期不同应变率下的应力-应变曲线,可看出骨软骨一体化支架在同等压缩应变下,应力随应变率的增加而增大,说明骨软骨复合支架具有较明显的率相关性;图5b 给出在应变率分别为 0.05%/s,0.1%/s 和 0.5%/s下支架的弹性模量,由此可看出,随着压缩速率的增加,支架的压缩弹性模量也逐渐增大,压缩速率为0.05%/s,0.1%/s 和 0.5%/s 的弹性模量分别为9.81 kPa,13.2 kPa 和 15.6kPa,说明支架具有明显的率相关性,这与支架的孔隙结构和孔隙形状有关。孔隙微观形貌观察为不规则圆形,易发生变形,在试样压缩的过程中,孔隙在载荷的作用下发生变形,当压缩速率较慢时,孔隙发生的应变较大,而当压缩速率较快时,应变较小,使弹性模量增加,因此,支架的弹性模量随压缩速率的增加而增加。2.3 骨软骨一体化支架单轴循环行为单轴循环行为是指材料在非对称应力控制循环加载下产生塑性变形累积的现象,单轴循环应变为:r=(max+min)/2(2)式中:max为每次循环中的最大应变;min为每次循环中的最小应变。图 6 循环压缩结果Fig.6 Cyclic compression results由图 6 可看出,试验试样在第 1 圈起始循环时应变不为 0,是因为该试验设计的循环加载是当应力加载到设定的平均值时开始循环,此时,试验机开始记录试验数据,并不是从设置的应力最小值开始循环。因此,当应力加载到平均值 10 kPa 时,试验机开始循环试验并记录数据,而此时试样已发生明显的应变。支架在加载初期发生了较迅速且明显的单轴循环行为,应力-应变曲线不闭合,且变化较明显;在加载至试验中期 190 圈至 200 圈时,应力-应变滞回曲线已接近闭合,单轴循环应变达到 16.97%,支架的应变变化进入缓慢增长阶段;在加载至试验末期时,应力-应变滞回曲线已接近完全闭合,单轴循环应变达到 17.29%,且支架的应变变化进入平稳阶段。3 讨论 范志海等18通过冷冻干燥法制备出丝素蛋白与透明质酸复合支架,并对其表征及生物相容性进行了研究,发现制得的复合支架与纯丝素蛋白支架相比,具有更好的成孔性与生物相容性;胡银春等19从仿生角度设计并构建了具有多级结构与性能仿生的骨软骨一体化修复材料,为骨软骨缺损的临床治疗提供材料和理论基础;兰伟伟等20采用纯物理交联方式,制备出具有良好界面结合强度与仿生结构的骨软骨修复水凝胶。从文中制备出的骨软骨一体化支架的表观结果可看出,上层冷冻干燥部分与下层软骨下骨紧密结合在一起,可防止支架在后期植入动物体内试验时部分脱落;从支架的表面扫描电镜结果可看出,支架表面有明显的孔隙结构,通过采用冷冻干燥技术制备的骨软骨一体化支架材料具有相互贯通的三维孔道结构。天然软骨呈凝胶状结构,孔隙率为 60%85%21,而文中制备的一体化支架软骨层孔隙率为 63.34%,符合天然软骨的孔隙结构。研究表明:对于软骨再生,理想的支架孔径结构大小为 50300 m22,能促进软骨细胞的再生、干细胞分化及组织再生。文中制备的支架表面孔径为(70.980.83)m,在其范围内;支架的侧面表观图与微观图均表明上层复合支架部分与软骨下骨的表面区域接触紧密。86 2023 年 10 月冯鹿明,等:骨软骨一体化支架的制备及力学性能研究单轴压缩试验表明:在不同应变加载速率下,支架的弹性模量随压缩应变速率的增加而增大。与刘钢等18对复合支架的力学性能研究结果相似。在同样的压缩应变下,文中所制备支架的弹性模量虽然与天然关节软骨的弹性模量 1418 MPa23相比还存在一定的差距,但与刘钢等18、兰伟伟等20制备的支架弹性模量较接近,即支架具有一定的力学承载能力,可防止其在植入体内后由于外力而发生的结构性坍塌24。膝关节在人体内起到承重和减振等作用,股骨软骨在其中又起到润滑和减小摩擦等重要作用。因此,植入体内的支架在长期循环载荷作业时能否保持原来的结构组成至关重要25,这对骨软骨缺损修复的成功与否起到较大的作用。在单轴循环试验中,文中设计的骨软骨一体化支架展现出良好的力学性能与明显的黏弹特性,在循环载荷加载的初期,支架发生了较明显的平均应变行为,随着循环加载的进行,支架应变增长由快速变化转为缓慢增加,加载至末期时转为平稳阶段,与李凯等26对天然软骨单轴循环行为研究的结果趋势相似。单轴循环应变分为 3 个阶段27,而文中试验所设计的 400 圈循环载荷加载并未使支架达到第 3 阶段,表明文中试验设计的骨软骨一体化支架具有一定的抵抗循环压缩载荷作用的力学性能。4 结论 通过复合 3 种天然材料并运用冷冻干燥技术将复合材料与天然软骨下骨交联,制备出骨软骨一体化支架。通过对表观与微观结构分析,表明制备的骨软骨一体化支架的结构交联良好,且具有明显的孔隙结构,表面孔径大小为(70.980.83)m,孔隙率为63.34%,满足骨组织修复对材料结构的要求;通过率相关与单轴循环试验,表明制得的骨软骨一体化支架具有良好的力学性能,满足骨缺损修复体内植入物的力学性能要求,在骨软骨组织工程中具有潜在的应用价值,为多层一体化支架的设计提供了依据,也为后期制备出与骨软骨组织更匹配及更接近生理代谢的骨软骨重建和修复材料提供了一定的理论基础。参 考 文 献1ARMSTRONG 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