骨关节炎模型中促炎症因子及膝关节组织病理变化的研究.pdf

2023年6 月第2 7 卷第6 期中国实验诊断学721文章编号：10 0 7 42 8 7(2 0 2 3)0 6-0 7 2 10 3骨关节炎模型中促炎症因子及膝关节组织病理变化的研究王嘉鹏，吕秋波，范冀缓，白晋平1，林霞2*（1.吉林省一汽总医院，吉林长春130 0 11；2.吉林大学第二医院，吉林长春130 0 41）骨关节炎（osteoarthritis，O A）是临床上常见的一种渐进性、退行性关节病变 1-3。OA发病的具体机制尚不是十分明确，对OA的治疗只能局限于对症处理。以往观点认为OA是一种退行性疾病，其病理改变主要为关节软骨磨损、软骨下骨硬化和关节周缘骨赘增生等。然而随着研究的深人，炎症反应在OA发病中的重要作用逐渐得到广泛关注。为了探索骨关节炎中炎症反应的变化及作用，通过采用弗氏完全佐剂复制OA动物模型 4，对骨关节炎模型血液中炎症指标IL-1、IL-2、IL-6、T NF、M M P-9、Ts、M p、NO 采样检测,观察膝关节病理组织变化,对骨关节炎发病机制进行深人的探讨和研究。1材料与方法1.1材料1.1.1动物wistar大鼠，SPF级，雄性，体重18 0-200g，合格证编号：2 0 17 0 0 0 17 97 2，购自于长春亿斯实验动物技术有限责任公司，许可证号：SCXK（吉）-2016-0003在屏障系统内饲养并进行试验。1.1.2实实验药品及试剂结核杆菌（吉林省中医药科学院提供），戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司），玻璃酸钠（2 5mg/支，上海景峰制药有限公司），MMP-9，（96 T，美国BD公司），M（96 T，美国BD公司），IL-1（96 T，美国BD公司），IL-2（96 T，美国BD公司），IL-6（96 T，美国BD公司），NO（96 T，美国BD公司），TNF-（96 T，美国BD公司）。1.1.3实验仪器T2000型电子称（由美国双杰兄弟有限公司），ELx800酶标仪（美国BioTek公司），DHG-9030A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），GI54DWS型高压灭菌锅（致微仪器有限公司），FCC-2000型精密恒温水浴箱（上海比朗仪器有限公司），RM2255型高精密全自动切片机（德国徕卡仪器有限公司），LeicaEG-1130型修切冷台（德国徕卡仪器有限公司），zLxL-A型蜡块修复*通讯作者仪（天津市久圣医疗电子仪器有限公司），DGH-9070A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司），YT-7F型烤片展片机（湖北孝感亚光电子有限公司），YR-21型染色机（湖北孝感亚光电子有限公司）。1.2实验方法1.2.1模型制备将液体石蜡加热致7 0，然后向其中加人结核杆菌至每毫升8 mg，最后加少量液体石蜡边加边研磨，然后用注射器来回抽、冲，充分混匀。高压灭菌，封装备用，做成福氏完全佐剂（FCA），每只大鼠于右后足跖皮内注射10 0 l。1.2.2分组给药取雄性Wistar大鼠30 只，分为空白对照组，OA模型组，治疗组（玻璃酸钠皮下注射4mg/kg），造模给药前大鼠眼球后静脉丛采血，第二天注射FCA造模，造模后治疗组开始给药（造模后第1、5、10、15天皮下注射玻璃酸钠），在造模后的第8、10、12、14、16、18、2 0 天大鼠眼球后静脉丛采血，进行炎症因子指标检测。1.2.3检测指标长在造模后的第8、10、12、14、16、18、2 0 天大鼠眼球后静脉丛采血，检测血液中MMP-9、M、IL-1、IL-2、IL-6、NO、T NF-的变化并进行组间比较。造模第2 0 天结束后，戊巴比妥钠麻醉处死动物取膝关节做组织病理学观察。1.2.4统计学分析检测结果采用t检验，以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1促炎症因子结果见表1-7。结果显示，造模第8 天OA模型组与空白对照组比较，IL-1、I L-2、IL-6升高（P0.05）；造模第10、12、14天OA模型组与空白对照组比较，MMP-9、M、NO 升高（P0.05),IL-1、I L-2、I L-6、T NF-升高（P0.01)。OA模型组与治疗组比较IL-1、I L-2、I L-6、T NF-升高（P0.05）；造模第16、18、2 0 天OA模型组与空白对照组比较,IL-6、M M P-9、M p、NO 升高（P0.01)，IL-1、I L-2、T NF-升高有显著差异（P0.001）,O AChinJLabDiag,2023,Vol27,No.6ne722模型组与治疗组比较IL-1、IL-2、IL-6、M M P-9、M p、NO、T NF-升高(P0.05)。表1OA模型大鼠不同时间点IL-1(pg/ml)的变化(xs,n=10)组别空白对照组OA模型组治疗组时间第8 天86.2319.86115.3222.14*85.3216.52第10 天88.6314.85136.2319.63*112.4315.63#第12 天90.2113.61145.3211.23*112.34 7.51#第14天88.4213.61110.4211.32*95.239.86#第16 天79.2515.64128.4314.86*103.4115.12#第18 天84.5614.69132.4118.64*114.5715.23#第2 0 天77.5210.54101.249.44*89.318.51#（注：与空白组相比：*P0.05，*P 0.0 1；与模型组相比#P0.05,下同。）表2OA模型大鼠不同时间点IL-2(ng/L)的变化(xs,n=10)组别空白对照组OA模型组治疗组时间第8 天72.137.6292.1510.23*79.234.12第10 天71.238.41109.6210.25*81.4311.54#第12 天73.648.64112.545.99*95.428.15#第14天77.568.43102.545.42*89.329.21#第16 天76.548.64118.6912.54*94.8514.28#第18 天77.4310.45110.288.68*93.439.41#第2 0 天74.118.7999.847.99*87.217.65#表3OA模型大鼠不同时间点IL-6(pg/ml)的变化(xs,n=10)组别空白对照组OA模型组治疗组时间第8 天24.444.2338.434.31*22.563.86第10 天25.644.2345.323.86*33.253.31#第12 天26.245.6247.234.32*35.215.64#第14天25.326.8241.567.23*31.437.74#第16 天23.424.5635.865.21*27.613.89#第18 天21.873.5438.294.21*31.052.68#第2 0 天23.454.5438.543.86*31.123.12#表4OA模型大鼠不同时间点MMP-9(ng/L)的变化(xs,n=10)组别空白对照组OA模型组治疗组时间第8 天72.326.6275.854.3170.325.23第10 天70.548.42100.259.62*95.639.54第12 天76.518.82109.5611.38*91.5412.31第14天74.238.8489.237.25*82.239.12第16 天78.6410.2194.859.64*81.237.32#第18 天74.518.4192.269.23*80.239.14#第2 0 天69.418.4189.316.25*74.417.66#2.2病理组织学HE染色结果造模第12 天，病理结果见图13。图1显示空白对照组关节面软骨连续，饱满，较厚，软骨细胞饱满，分散分布；图2显示OA模型组较空白对照组关节软骨层变薄，正表5OA模型大鼠不同时间点Mp(ng/L)的变化(xs,n=10)组别空白对照组OA模型组治疗组时间第8 天22.313.3224.864.2324.122.94第10 天28.443.1239.862.14*36.214.94第12 天28.325.2139.217.32*36.246.72第14天25.325.4237.546.32*32.899.45第16 天27.623.1541.844.21*32.543.04#第18 天24.192.5437.413.41*30.413.94#第2 0 天22.413.1439.4127.64*30.413.21#表6OA模型大鼠不同时间点NO(ng/L)的变化(xs,n=10)组别空白对照组OA模型组治疗组时间第8 天26.239.4329.867.3227.329.23第10 天28.629.4342.138.96*39.217.23第12 天28.219.4338.429.1235.217.98第14天27.627.5336.546.32*30.866.12第16 天27.648.5440.547.62*33.217.31#第18 天29.845.2141.216.21*34.415.43#第2 0 天30.147.5444.859.62*33.964.85#表7OA模型大鼠不同时间点TNF-(ng/L)的变化(xs,n=10)组别空白对照组OA模型组治疗组时间第8 天29.327.2330.319.6428.576.21第10 天29.647.6241.236.23*34.265.56#第12 天25.876.3840.2311.32*34.216.98#第14天27.547.6338.676.54*30.456.21#第16 天30.586.4551.869.47*43.346.42#第18 天27.947.6145.619.48*34.8910.21#第2 0 天26.418.6447.557.31*34.414.21#常软骨细胞消失，纤维组织与巨噬细胞成分增加，关节周围纤维组织成分增生；图3显示治疗组软骨塌陷，关节软骨层变薄，正常软骨细胞消失，纤维组织与巨噬细胞成分增加，关节周围纤维组织成分增生轻于OA模型组3讨论促炎症因子(pro-inflammatory cytokines,PIC)是炎症反应的重要媒介，OA中PIC水平显著升高，加速关节软骨的破坏，加重滑膜炎症，促进OA的进展 5-6 。其中白细胞介素、肿瘤坏死因子和基质金属蛋白酶作为经典的PIC介导炎症反应，引起OA进展的机制已被众多研究所阐明 7-8 。近年来，新的PIC不断涌现，以往认为与OA发病无关的PIC被证实在疾病进展中扮演重要角色，一些PIC甚至可以通过调节上述经典PIC来参与OA的病理过程。其中软骨破坏是OA发病的中心环节，主要由软骨EMC降解与合成明显失衡而引起L9，都涉及软骨退行性变的发病机制 10-11第2 7 卷第6 期2023年6 月中国实验诊断学723图1空白对照组HE染色结果（40 0）图2OA模型组HE染色结果（40 0 X）图3治疗组HE染色结果（40 0）相关研究表明,OA血液中IL-1、I L-2、I L-6 等炎症因子表达明显升高，也可干扰软骨细胞的正常功能，与OA早期阶段关节软骨退行性病变密切相关，同时炎症因子可以加快细胞外基质更新的速度，促进关节软骨细胞退化和调亡，在机体的多种免疫细胞分泌和诱导过程中发挥作用，参与免疫细胞的分化和增生，可导致体内慢性炎症的长期存在，导致一系列代谢功能异常变化 13,其中IL-1在OA软骨细胞炎症反应及软骨基质降解中起着核心作用14。TNF-与OA病情程度密切相关,关节液中 TNF-的水平随着OA严重程度的增加而升高 15-16 。TNF-可诱导滑膜细胞合成和分泌前列腺素E2与胶原酶，参与炎症反应,TNF-在OA炎症反应中还可介导白细胞的迁徙，其表达量可作为评估OA炎症反应严重程度的可靠依据 17-18 。NO是一种不稳定的气态自由基，具有多种生理功能，同时也介导局部炎症反应、组织损伤。其可传递神经信息，调节内皮细胞、平滑肌和神经等 19。本研究结果可以看出，炎症因子在发病和病情发展过程中起重要作用，其表达情况可作为评估病情严重程度的有效依据，并与病情程度呈正相关，部分作用机制是通过降低异常升高的炎症因子的水平，减少机体炎症因子的含量，减轻炎症反应。本研究组织病理学显示骨关节炎正常软骨细胞消失，纤维组织与巨噬细胞成分增加，关节周围纤维组织成分增生，炎症因子异常升高；治疗组软骨塌陷，关节软骨层变薄，正常软骨细胞消失，纤维组织与巨噬细胞成分增加，炎症因子低于模型组，说明炎症因子的变化与组织病理学成正相关。参考文献：1韦贵康，施祀.实用中医骨伤科学 M.上海：上海科学技术出版社，2 0 0 6：6 2 4-6 2 7.2 靳春兰，张建坡.中医药治疗膝骨关节炎 J.长春中医药大学学报，2 0 16,32(1):8 1.3JMigliorea,Procopios.Effectiveness and utility of hyaluronicacid inosteoarthritisJJ.Clin Cases Miner Bone Metab,2015,12(1):31.4徐淑云，卡如，陈东修，等.药理实验方法学 MI.第2 版.北京：人民卫生出版社，1992：52 4-544，933-944.5 Mabey T,Honsawek S.Cytokines as biochemical markers forknee 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