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生物化学实验讲义

化学工程与技术学院
基础部

实验一 酪蛋白的制备
一、目的
学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。
二、原理 ．
牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。
三、器材
1 、离心机 2、．抽滤装置
3、精密pH试纸或酸度计 4、电炉
5、烧杯 6、温度计 ．
四、试剂与材料
1、牛奶 2500mL
2、95％乙醇 1200mL
3、无水乙醚 1200mL
4、0.2mol／L pH 4.7醋酸—醋酸钠缓冲液 3000mL
5、．乙醇—乙醚混合液 2000mL
五、操作
1、 将100mL牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH 4.7的醋酸缓冲液100 mL。用精密pH试纸或酸度计调pH至4.7。将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟(3 000r／min)。弃去清液，得酪蛋白粗制品。
2、 用水洗沉淀3次，离心10分钟(3000r／min)，弃去上清液。
3、 在沉淀中加入30mL乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。
4、 将沉淀摊开在表面皿上，风干；得酪蛋白纯晶。
5、 准确称重，计算含量和得率。
含量：酪蛋白g／100mL牛乳(g％)
得率：
思考题
1、制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？
实验二 小麦萌发前后淀粉酶活力的比较
一、目的
1.学习分光光度计的原理和使用方法。
2.学习测定淀粉酶活力的方法。
3.了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化。
二、原理
种子中贮藏的糖类主要以淀粉的形式存在。淀粉酶能使淀粉分解为麦芽糖。
2（C6H10O5）n +nH2O nC12H22O11
麦芽糖有还原性，能使3，5---二硝基水杨酸还原成棕色的3-氨基-5-硝基水扬酸。后者可用分光光度计测定。

休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌动后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数增加而增加。
本实验观察小麦种子萌发前后淀粉酶活力的变化。
三、器材
1.25mL刻度试管 2. 吸管
3.离心管 4.乳钵
5.分光光度计 6.恒温水浴
7.离心机
四、试剂和材料
1、小麦种子
2、o.1％标准麦芽糖溶液
精确称量100mg麦芽糖，用少量水溶解后，移入100mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度。
3.pH6.9，0.02mol/L磷酸缓冲液
0.2mol/L磷酸二氢钾67.5mL与0.2mol/L磷酸氢二钾82.5混合，稀释10倍。
4、1％淀粉溶液
1g可溶性淀粉溶于100mL0.02mol/L磷酸缓冲液中，其中含有0.0067mol/L氯化钠。
5、1％3，5—二硝基水杨酸试剂
将1.00g3，5—二硝基水扬酸溶于20ml 2M L1NaOH溶液和50ml水中，加入30g酒石酸钾钠定容至100ml。 6、1％氯化钠溶液
五、实验操作
1、种子发芽 小麦种子浸泡2.5小时后，放入25℃恒温箱内或在、室温下发芽。
2、酶液提取 取发芽第3或第4天的幼苗15株，放入乳钵内，加入1%氯化钠溶液10mL，用力磨碎。在室温下放置20分钟，搅拌几次。然后将提取液离心（1500r/min）6—7分钟。将上清液倒人量筒，测定酶提取液的总体积。进行酶活力测定时，用缓冲液将发芽第3或第4天的幼苗稀释10倍。
取干燥种子15粒作对照（提取步骤同上）。
3、酶活力测定
（1）取25mL刻度试管4支，编号。按下表要求加入各试剂（各试剂须在25℃预热10分钟）
试管标号
试剂
1
2
3
4
干燥种子的酶提取液
发芽第3或第4天的幼苗的酶提取液
标准管
空白管
酶液（mL）
0.5
0.5
—
—
标准麦芽糖溶液（mL）
—
—
0.5
—
1％淀粉溶液（mL）
1
1
1
1
水（mL）
—
—
—
0.5
将各管混匀，放在25℃水浴中，保温3分钟后，立即向各管加入1％3，5—二硝基水杨酸溶液2mL。
（2）取出各试管，放入沸水浴加热5分钟。冷却至室温，加水稀释至25mL。并混匀。在A500nm处测定各管的吸光度。填入表中
试管号
干燥种子的酶提取液
发芽第3或第4天的幼苗的酶提取液
标准管
空白管
A500nm吸光度

4、计算
根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，
本实验规定：25℃时3min内水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位（u）。酶活力计算公式为：
式中：C酶 酶液麦芽糖的浓度，V酶 提取酶液的总体积，n酶酶液稀释倍数。

思考题
1、 为什么此酶提纯整个过程在0—5条件下进行？而测酶的活力时要在25预保温？反应后又放入沸水浴中？
2、 实验结果说明什么？

实验三 纸层析法分离鉴定氨基酸

一、目的
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
二、原理
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。
层析溶剂由有机溶剂和水组成。
物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值(比移)来表示的：
…

在一定的条件下某种物质的只Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。
三、器材
1.层析缸 2.毛细管 3.喷雾器 4.培养皿 5.层析滤纸(新华一号)
四、试剂
1、扩展剂 650mL
4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20mL正丁醇和5mL冰醋酸放入分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒人培养皿中备用。
2、氨基酸溶液 0.5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液(各组份浓度均为0.5％)。各5mL
3、显色剂 50～100mL
0. 1％水合茚三酮正丁醇溶液。
五、操作
1.将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。
2.取层析滤纸(长22cm、宽14 cm)一张。在纸的—端距边缘2～3cm处用用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2cm作一记号如图。
3.点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这6个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3 mm。
4.扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中(点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线 1cm)。待溶剂上升15—20 cm时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。
5.显色 用喷雾器均匀喷上O.1％ 茚三酮 正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑点。
6.计算各种氨基酸的只Rf值。
思考题
1、何谓纸层析法?
2、何谓片Rf值?影响Rf值的主要因素是什么?
3、怎样制备扩展剂?
3、 层析缸中平衡溶剂的作用是什么？

实验四 酶的特性
一、目的
加深对酶的性质的认识。
二、内容
本实验由温度对酶活力的影响；pH对酶活力的影响；酶的激活剂及抑制剂；酶的专—性4组实验组成。
(一)温度对酶活力的影响
1、原理
酶的催化作用受温度的影响。在最适温度下，酶的反应速度最高。大多数动物酶的最适温度为37-40℃，植物酶的最适温度为50～60℃。
酶对温度的稳定性与其存在形式有关。有些酶的干燥制剂，虽加热到100℃，其活性井无明显改变，但在100℃的溶液中却很快地完全失去活性。
低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。
2、器材
(1)试管及试管架 (2)恒温水浴 (3)冰浴 (4)沸水浴
3、试剂和材料
(1)0.2％淀粉的0.3％氯化钠溶液 150mL需新鲜配制
(2)稀释200倍的唾液 50mL
用蒸馏水漱口，以清除食物残渣，再含一口蒸馏水，半分钟后使其流入量筒并稀释200倍(稀释倍数可根据各人唾液淀粉酶活性调整)，混匀备用。
(3)碘化钾—碘溶液 50mL
将碘化钾20g及碘l0g溶于100mL水中。使用前稀释10倍。
4、操作
淀粉和可溶性淀粉遇碘呈蓝色。糊精按其分子的大小， 遇碘可呈蓝色、紫色、暗褐色或红色。最简单的糊精遇碘不呈颜色，麦芽糖遇碘也不呈色。在不同温度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈现的颜色来判断。
取3支试管，编号后按下表加入试剂：
管号
1
2
3
淀粉溶液(mL)
1.5
1.5
1.5
稀释唾液(mL)
1
1
—
煮拂过的稀释唾液(mL)
—
—
1
摇匀后，将1、3号两试管放入37℃恒温水浴中，2号试管放人冰水中。10分钟后取出(将2号管内液体分为两半)，用碘化钾—碘溶液来检验1、2、3号管内淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。记录并解释结果，将2号管剩下的一半溶液放人37℃水浴中继续保温10分钟后，再用碘液实验，结果如何?
(二)pH对酶活性的影响
1、原理
酶的恬力受环境pH的影响极为显著。不同酶的最适pH值不同。本实验观察pH对唾液淀粉酶活性的影响，唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。
2．器材
(1)试管及试管架 (2)吸管 (3)滴管 (4)50mL锥形瓶 5)恒温水浴3、试剂和材料
(1)新配制的溶于0.3％氯化钠的0.5％淀粉溶液 250 mL
(2)稀释200倍的新鲜唾液 100mL
(3)0.2mol/L磷酸氢二钠溶液 600mL
(4)0.1 mol/L柠檬酸溶液 400Ml
(5)碘化钾—碘溶液 50mL
(6)pH试纸 pH=5、pH=5.8、pH=6.8、pH=8四种
4、操作
取4个标有号码的50mL锥形瓶。用吸管按下表添加0.2mol／L磷酸氢二钠溶液和0.1 mol/L柠檬酸溶液以制备pH5.0～8.0的4种缓冲液。
锥形瓶号码
0.2mol／L磷酸氢二钠
0.1 mol/L柠檬酸
pH
1
5.15
4.85
5.0
2
6.05
3.95
5.8
3
7.72
2.28
6.8
4
9.72
0.28
8.0
从4个锥形瓶中各取缓冲液3mL，分别注入4支带有号码的试管中，随后于每个试管中添加0.5％淀粉溶液2 mL和稀释200倍的唾液2mL。向各试管中加入稀释唾液的时间间隔各为1分钟。将各试管中物质混匀，并依次置于37℃恒温水浴中保温。
待向第4管加入唾液2分钟后，每隔1分钟由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化钾—碘溶液，检验淀粉的水解程度。待混合液变为棕黄色时，向所有试管依次添加1—2滴碘化钾—碘溶液。添加碘化钾—碘溶液的时间间隔，从第1管起，亦均为1分钟。
观察各试管中物质呈现的颜色，分析pH对唾液淀粉酶活性的影响。
三)唾液淀粒酶的活化和抑制
1、原理
酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。
2、器材
(1)恒温水浴 (2)试管及试管架
3、试剂和材料
(1)0.1％淀粉溶液 150mL (2)稀释200倍的新鲜唾液 150mL
(3)1％氯化钠溶液 50mL (4)1％硫酸铜溶液 50mL
(5)1％硫酸钠溶液 50mL (6)碘化钾—碘溶液 100mL
4、操作

管号
1
2
3
4
0.1％淀粉溶液(mL)
1.5
1.5
1.5
1.5
稀释唾液(mL)
0.5
0.5
0.5
0.5
l％硫酸铜溶液(mL)
0.5
—
—
—
1％氯化钠溶掖(mL)
—
0.5
—
—
1％硫酸钠溶液(mL)
—
—
0.5
—
蒸馏水(mL)
—
—
—
0.5
37℃恒温水浴、保温10分钟
碘化钾—碘溶液(滴)
2～3
2～3
2～3
2～3
现象

解释结果；说明本实验第3管的意义。
（四）酶的专一姓
1.原理
酶具有高度的专一性。本实验以唾液淀粉酶和蔗糖酶对淀粉和蔗糖的作用为例，来说明酶的专一性。
淀粉和蔗糖无还原性。唾液淀粉酶水解淀粉生成有还原性的麦芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解产生还原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解。用Benedict试剂检查糖的还原性。
2、器材 ．
(1)恒温水浴 (2)沸水浴 (3)试管及试管架
3、试剂和材料
(1)2％蔗糖溶液 150mL
(2)溶于0.3％氯化钠的1%淀粉溶液 150mL需新鲜配制
间隔各为1分钟。将各试管中物质混匀，并依次置于37℃恒
温水浴中保温。
(3)稀释200倍的新鲜唾液 100mL
(4)蔗糖酶溶液 100mL
将啤酒厂的鲜酵母用水洗涤2～3次(离心法)，然后放在滤纸上自然干燥。取干酵母100 g，置于乳钵内，添加适量蒸馏水及少量细沙，用力研磨提取约1小时，再加蒸馏水使总体积约为原体积的10倍。离心，将上清液保存于冰箱中备用。
(5)Benedict氏试剂 200 mL
无水硫酸铜17.4 g溶于100 mL热水中，冷却后稀释至150mL。取柠檬酸钠173g，无水碳酸钠100g和600 mL水共热，溶解后冷却并加水至850 mL。再将冷却的150 mL硫酸铜溶液倾入。本试剂可长久保存。
4、操作
（1）淀粉酶的专一性
管号
1
2
3
4
5
6
1％淀粉溶液(滴)
4
—
4
—
4
—
2%蔗糖溶液(滴)
—
4
—
4
—
4
稀释唾液(mL)
—
—
1
1
—
—
煮沸过的稀释唾液(mL)
—
—
—
—
1
1
蒸馏水(mL)
1
1
—
—
—
—
37℃恒温水浴15分钟
Benedict试剂(mL)
1
1
1
1
1
1
沸水浴2—3分钟
│ 现 象

解释实验结果(提示：唾液除含淀粉酶外还含有少量麦芽糖酶)。
（2）蔗糖酶的专一性
管号
1
2
3
4
5
6
1％淀粉溶液(滴)
4
—
4
—
4
—
2%蔗糖溶液(滴)
—
4
—
4
—
4
蔗糖酶溶液(mL)
—
—
1
1
—
—
煮沸过的蔗糖酶溶液(mL)
—
—
—
—
1
1
蒸馏水(mL)
1
1
—
—
—
—
37℃恒温水浴15分钟
Benedict试剂(mL)
1
1
1
1
1
1
沸水浴2—3分钟
│ 现 象

解释实验结果。
思 考 题
1、什么是酶的最适温度及其应用意义?
2、什么是酶反应的最适pH?对酶活性有什么影响?
3、什么是酶的活化剂?
4、什么是酶的抑制剂?与变性剂有何区别?
5、本实验结果如何证明酶的专一性?

实验五 菜花中核酸的分离和鉴定
一、目的
初步掌握从菜花中分离核酸的方法，和RNA、DNA的定性检定。
二、原理
用冰冷的稀三氯乙酸或稀高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性小分子物质，再用有机溶剂，如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。最后用浓盐溶液(10％氯化钠溶液)和0.5 mol／L高氯酸(70℃)分别提取DNA和RNA，再进行定性检定。
由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，经显色后所呈现的颜色深浅在一定范围内和样品中所含的核糖和脱氧核糖的量成正比，因此可用此法来定性、定量测定核酸。
1、核糖的测定 测定核糖的常用方法是苔黑酚(即3，5—二羟甲苯法)。当含有核糖的RNA与浓盐酸及3，5—二羟甲苯在沸水浴中加热10—20分钟后，有绿色物产生，这是因为RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠
醛，后者再与3，5—二羟甲苯作用产生绿色物质。

DNA、蛋白质和粘多糖等物质对测定有干扰作用。
2．脱氧核糖的测定 测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。含有脱氧核糖的DNA在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热10分钟后，产生蓝色。这是因为DNA嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω—羟基—6—酮基戊醛，它再和二苯胺作用产生蓝色物质。
100℃
DNA+二苯胺试剂 蓝色物
此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。
上述两种定糖的方法准确性较差，但快速、简便，能鉴别DNA与RNA，是检定核酸、核苷酸的常用方法。
三、器材
1．恒温水浴 2．电炉 3，离心机 4．布氏漏斗装置
5．吸管 6．烧杯 7．量筒 8．剪刀
四、试剂和材料
1、新鲜菜花 2、95％已醇 600 mL 3、丙酮 400 mL
4、5％高氯酸溶液 200 mL 5、0.5mo1/L高氯酸溶液 200 mL
6、10％氯化钠溶液 400 mL
7、标准RNA溶液(5 mg／l00mL) 50mL
8、标准DNA溶液(15 mg／100mL) 50mL 9．粗氯化钠 250g
10．海砂 5 g 11．二苯胺试剂 60 mL
将1 g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加入2.75mL浓硫酸(置冰箱中可保存6个月。使用前，在室温下摇匀)。
12．三氯化铁浓盐酸溶液 25 mL
13．苔黑酚乙醇溶液 200 mL
1、核酸的分离
(1)取菜花的花冠20g，剪碎后置于研钵中，加入20mL95%乙醇和400 mg海砂，研磨成匀浆。然后用布氏漏斗抽滤，弃去滤液。
(2)滤渣中加入20mL丙酮，搅拌均匀，抽滤，弃去滤液。
(3)再向滤渣中加入20mL丙酮，搅拌5分钟后抽干(用力压滤渣，尽量除去丙酮)。
(4)在冰盐浴中，将滤渣悬浮在预冷的20mL 5％高氯酸溶液中。搅拌，抽滤，弃去滤液。
(5)将滤渣悬浮于20 mL 95％乙醇中，抽滤， 弃去滤液。
(6)滤渣中加人20 mL丙酮，搅拌5分钟，抽滤至于，用力压滤渣尽量除去丙酮。
(7)将干燥的滤渣重新悬浮在40 mL 10％氯化钠溶液中。 在沸水浴中加热15分钟。放置，冷却，抽滤，留滤液。并将此操作重复进行一次。将两次滤液合并，为提取物一。
(8)将滤渣重新悬浮在20mL 0.5 mol／L高氯酸溶液中。加热到70℃、保温20分钟(恒温水浴)后抽滤，留滤液(提取物二)。 ·
2．RNA，DNA的定性检定
(1) 二苯胺反应
管号
1
2
3
4
5
蒸馏水(mL)
1
--
--
--
--
DNA溶液(mL)
--
1
--
--
--
RNA溶液(mL)
--
--
1
--
--
提取物一(mL)
--
--
--
1
--
摄取物二(mL)
--
--
--
--
1
二苯胺试剂（mL）
2
2
2
2
2
放沸水浴中10分钟后的现象

（2）苔黑酚反应
管号
1
2
3
4
5
蒸馏水(mL)
1
--
--
--
--
DNA溶液(mL)
--
1
--
--
--
RNA溶液(mL)
--
--
1
--
--
提取物一(mL)
--
--
--
1
--
摄取物二(mL)
--
--
--
--
1
三氯化铁浓盐酸溶液(mL)
2
2
2
2
2
苔黑酚乙醇溶液(mL)
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
放沸水浴中10分钟后的现象

思 考 题
1．核酸分离时为什么要除去小分子物质和脂类物质?本实验是怎样除掉的?
2．实验中呈色反应时RNA为什么能产生绿色复合物?DNA产生
蓝色物质?

实验六 紫外分光光度法测定核酸的含量
一、目的
1.了解紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
2.学习用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。
二、原理
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。RNA和DNA的紫外吸收高峰在A260nm波长处。一般在A260nm波长下，每mL含1µgDNA溶液的光吸收值约为0.020，每mL含1µgRNA溶液的光吸收值约为0.022。故测定未知浓度RNA或DNA溶液A260nm波长的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故应设法预先除去。
三、器材
1.分析天平 2.离心机
3.容量瓶 4.紫外分光光度计
5.吸管 6.冰浴或冰箱
四、试剂
1、5%～6%氨水
2、钼酸铵—高氯酸试剂(沉淀剂) 如配制200mL可在193mL蒸馏水中加入7mL 70%高氯酸和0.5g钼酸铵。
五、操作
1.用分析天平准确称取待测的核酸样品500 mg，加少量蒸馏水调成糊状，再加入少量的水稀释。然后用5%～6%氨水调至pH7，定容到50mL。
2.取2支离心管，向第一支管内加人2mL样品溶液和2mL蒸馏水；向第二支管内加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂，以除去大分子核酸作为对照。混匀。在冰浴或冰箱中放置30分钟后离心(3000 r／min，10分钟)。从第一管和第二管中分别吸取0.5mL上清液，用蒸馏水定容到50mL。
用光程为1cm的石英比色杯，于260mn波长处测其光吸收值(A1和A2)。

六、计算

如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液(20～50µg/mL )在紫外分光光度计上直接测定。
实验七 总氮量的测定—凯氏定氮法
一、 目的
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
二、 原理
常用凯氏定氮法测定天然有机物（如蛋白质、核酸及氨基酸）的含氮量。含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳氢元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。
但是，此反应进行的比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。甘氨酸的消化过程表示如下：
CH2NH2COOH+3H2SO4 ——2CO2+3SO2+NH3
2NH3+H2SO4—————（NH4）2SO4

弄 浓
浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸留到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据使用的标准酸的摩尔数计算出待测物中的总氮量。
三、仪器
1.50 mL消化管或100 mL凯氏烧瓶
2.改进型凯氏定氮仪
3．50 mL容量瓶 4．3 mL微量滴定管
5．分析天平 6．烘箱 7．电炉 8．1000mL蒸馏烧瓶
9.小玻璃珠 10．远红外消煮炉
四、试剂
1.消化液(过氧化氢：浓硫酸：水二3：2：1) 200mL
2．粉末硫酸钾—硫酸铜混合物 16g
K2S04与CuS04·5H20以3：1配比研磨混合。
3．30％氢氧化钠溶液 1 000mL
4．2％硼酸溶液 500mL
5．标准盐酸溶液(约0．01 mol／L) 600mL
6．混合指示剂(田氏指示剂) 50mL
由50mL 0．1％甲烯蓝乙醇溶液与200mL 0.1％甲基红
乙醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时
为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。
7．市售标准面粉和富强粉.各2g
五、操作方法
改进型凯氏定氮仪
改进型凯氏定氮装置是在传统凯氏定氮装置的结构基础上改装而成，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。改进型凯氏蒸馏装置的结构如图所示。
图 改进型凯氏蒸馏装置
1.水蒸汽发生器 2.反应室 3．水蒸汽排气孔 4．排水排气孔
5.外源水入口 6．进样口 7．加样漏斗 8．冷凝器 9．冷凝器出口
10.自来水入口 11．通气室出口 13.通气室出口 14．排水柱
15．排水柱入口 16．排水柱入口 17.冷凝水和废水出口 ①②③自由夹

可分成3部分来叙述：
(1)水蒸汽发生器和反应室 水蒸汽发生器有3个开口，3、4、5，反应室有1个开口，6。
2)冷凝器和通气室 冷凝器有2个开口，9、10，通气室有有2个开口，12、13
(3)排水柱 排水柱有3个开口，15、16、17。
安装时，先将主体部分固定在支架上，其底部放上电炉。然后将5与13；4与16；12与15；6与7用橡皮管连接，并放上自由夹。最后长橡胶管连接进水口10和出水口17
2．样品处理
某一固体样品中的含氮量是用l00g该物质(干重)中所含氮的g数来表示(%)。因此在定氮前，应先将固体样品中的水分除掉。一般样品烘干的温度都采用105℃，因为非游离的水都不能在100℃以下烘干。
在称量瓶中称人一定量磨细的样品，然后置于105℃的烘箱内干燥4小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1小时后，称重—次，直到两次称量数值不变，即达恒重。
精确称取0.1g左右的干燥面粉作为本实验的样品。
3．消化
取4个100 mL凯氏烧瓶或50mL消化管并标号。各加1颗玻璃珠，在1及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂(K2S04—CuS04·5H20)200 mg，消化液5 mL。注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。在3及4号瓶中各加0.1 mL蒸馏水和与1及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放一漏斗，在通风橱内的电炉上消化。
在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈 待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出S02白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。消化完毕，等烧瓶中溶物冷却后，加蒸馏水10mL(注意慢加，随加随摇)。冷却后将瓶中溶物倾入50 mL的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并人量瓶。用水稀释到刻度，混匀备用。
4，蒸馏
(1)蒸馏器的洗涤 接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水(以排水口高度为宜)用电炉将其加热烧开。然后将蒸馏水由加样室加入反应室，水即自动吸出，或者将电炉移开片刻，或者打开自由夹，使冷水进入蒸汽发生器，都可使反应室中的水自动吸出，如此反复清洗3—5次。清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有5 mL，12％硼酸溶液和1～2滴指示剂的混合液。蒸馏数分钟后，观察锥形瓶内溶液是否变色，如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。
(2)蒸馏 取50 mL锥形瓶数个，各加入5 mL 12％硼酸溶液和1～2滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。
关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将一个盛有硼酸和指示剂溶液的锥形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸没在液体内。
用移液管取5 mL消化液，细心地由加样室下端加入反应室，随后将已准备好的30％NaOH溶液5mL加入，关闭自由夹，在加样漏斗中加少量水做水封。
关闭自由夹打开冷凝水(注意不要过快过猛，以免水溢出)。
当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时(约2—3分钟)，开始计时，蒸馏3分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏1分钟，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。
蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。打开自由夹，将水放出，再加热，再清洗，如此3—5次。最后将自由夹①、③同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉。关闭夹子，再使蒸汽通过整个装置数分钟后，继续下一次蒸馏。
待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。
(3)滴定 全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。
(4)计算

c为标准盐酸溶液摩尔浓度；
v1为滴定样品用去的盐酸溶液平均mL数；
v2为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均mL数；
w为样品重量(g)。
14为氮的相对量子质量。
若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则，
样品中蛋白质含量(％)=总氮量x6．25
若样品中除有蛋白质外，尚有其他含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸，然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品上清液中的含氮量，得出非蛋白氮及总氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。
蛋白氟=总氮—非蛋白氮
蛋白质含量(g%)=蛋白氮×6.25

思 考 题
1、何谓消化?如何判断消化终点?
2、．在实验中加入粉末硫酸钾—硫酸铜混合物的作用是什么?
3．固体样品为什么要烘干?
4．蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中?
5．如何证明蒸馏器洗涤干净?
6．本实验应如何避免误差?

实验八 血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
一、 目的
学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理
二、原理
醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。
醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120µm，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白，糖蛋白和同工酶的分离及用在免疫电泳中。
三、器材
1．醋酸纤维薄膜(2×8 cm) 2．常压电泳仪
3．点样器(市售或自制) 4．培养皿(染色及漂洗用)
5．粗滤纸 6，玻璃板
7．竹镊 8．白磁反应板
四、试剂
1．巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度0.07) 1000 mL：
巴比妥2.76 g，巴比妥钠15.45 g，加水 1 000 mL。
2．染色液 300 mL
含氨基黑10B 0.25 g，甲醇50 mL，冰醋酸10 mL，
水40 mL(可重复使用)。
3．漂洗液 2 000 mL
含甲醇或乙醇45 mL、冰醋酸5 mL、水50 mL。
4，透明液 300 mL
含无水乙醇7份，冰醋酸3份。
五、操作
．浸泡 用镊子取醋酸纤维薄膜1张(识别出光泽面与无光泽面，并在角上用笔做上记号)放在缓冲液中浸泡20分钟。
2．点样 把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上(无光泽面朝上)，将点样器先在放置在白磁反应板上的血清中沾一下，再在膜条一端2—3cm处轻轻地水平地落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。

3．电泳 在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上(先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥(它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”)。膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。通电。调节电压至160 V，电流强度0.4—0.7mA／cm(毫安／厘米)膜宽，电泳时间约为25分钟。

酸纤维裹薄膜电泳装置示意图

4．染色 电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。
5．漂洗 将膜条从染色液中取出后移置到漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。
醋酸纤维薄膜血清蛋白电泳图谱
从左至右，依次为：血清清蛋白 α1，球蛋白，α2球蛋白，β球蛋白，γ球蛋白

定量测定时可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在体积0.4 mol/L氢氧化钠溶液中半小时，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，在A650nm进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放人透明液中浸泡2～3分钟后取出贴于洁净玻璃板上，干后即为透明的薄膜图谱，可用光密度计直接测定。

思 考 题
1．用醋酸纤维薄膜做电泳支持物有什么优点?
2．电泳图谱清晰的关键是什么?如何正确操作?